一种干酪乳杆菌电转化方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及分子生物学领域，特别是一种干酪乳杆菌电转化方法。
【背景技术】
[0002] 乳杆菌在农业、食品领域具有重大的经济意义以及对动物和人体健康公认的重要 性，越来越引起人们的关注。几个世纪以来，乳杆菌作为重要的益生菌已广泛地应用于食品 及饮料加工业，其生物学特性为棒状，厌氧或微需氧，属易生菌。以乳杆菌作为发酵菌的食 品工业所创造出的经济价值占全球总的发酵类食品的20%。同时乳杆菌也被广泛用于肠、 肉类食品的加工和保鲜。乳杆菌通过重建肠道菌群平衡，从而有利于人类及某些动物宿主 恢复并提高健康状态。
[0003] 由于乳杆菌广泛的工业用途和在医学上的重要意义，对乳杆菌分子遗传学研究成 为焦点，特别是利用基因工程技术，以乳杆菌为载体携带外源基因（如抗原、酶、小肽分子 等)到人和动物体内直接产生外源蛋白质。乳杆菌的遗传操作的先决条件是建立方便和可 靠的转化方法。目前乳杆菌的转化方法有原生质体转化法和电击转化法。原生质体转化法 最早出现，但具有繁琐、耗时和不稳定的缺点而被摒弃，一种干酪乳杆菌电转化方法取代了 原生质体转化法，但是仍然不十分完善，尤其是重复性不好，转化率低。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种干酪乳杆菌电转化方法，以克服传统电转化重复性不 好，转化率低的问题。
[0005] 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种干酪乳杆菌电转化 方法，方法包括了干酪乳杆菌培养、干酪乳杆菌电转化和转化后再培养，具体步骤为：
[0006] 干酪乳杆菌培养：
[0007] A.从低温冷冻冰箱取出一支加入甘油保存的干酪乳杆菌菌种，在MRS固体培养基 上划线，37 °C厌氧倒置培养；
[0008] B.用无菌的接菌环挑取在MRS上生长好的菌落至试管里MRS液体培养基中，37°C静 止培养过夜；
[0009] C.第二日将前一天生长好的菌液lmL转接到50mL MRS液体里，37°C静止生长至菌 液600nm处紫外吸收值为0.5-0.6时，准备干酪乳杆菌电转化；
[0010] 干酪乳杆菌电转化：
[0011] D.将干酪乳杆菌移入50mL离心管里，放到冰盒里静置20分钟后，放到提前预冷到4 。(:离心机中5000r/min，5分钟，弃掉上清，留下沉淀；向沉淀里移入40mL EPWB溶液，使沉淀 悬浮于EPWB溶液中，放到提前预冷到4°C的离心机中5000r/min，5分钟，弃掉水相，留下菌 体，此步骤重复3次，用40mL EPB溶液洗涤菌体一次，弃上清；
[0012] E.菌体用400yL的EPB溶液重悬，分装500-300μ!7支(现用现配），用于电转；
[0013] F.质粒DNAlyg加入到之前制备好的干酪乳杆菌感受态细胞中，轻轻混合，冰浴10 分钟；
[0014] G.将质粒与干酪乳杆菌感受态转入提前预冷的2mm电击杯中，冰浴10分钟；
[0015] H.用滤纸将电转化杯表面擦干，放入电转仪中，调节电压2.3kV、电阻200Ω、电容 25yF，脉冲时间约为4-5ms;
[0016] I.向电击杯中快速加入900yL的含有0.5%甘氨酸的MRS，轻轻地用移液器吹吸混 合后移到一个无菌的Eppendorf管中，放到提前调至37°C的80-100rpm/min摇床内孵育1.5-3小时；
[0017] 转化后再培养：
[0018] J.孵育后的混合液离心，留下l〇〇yL上清，重新悬浮;然后涂布于含有选择压力的 MRS琼脂平板上，37 °C无氧倒置培养24-36小时。
[0019 ] 其中，MRS培养基为莫匹罗星锂盐改良MRS培养基，EPWB溶液为:NaH2P〇4〇. 6mmo 1 /L 和MgCl20. lmmol/L配置而成，Era溶液为EPWB溶液基础上加入0.3mol/L蔗糖，调节pH为7.4， 并灭菌4°C保存。
[0020] 本发明具有以下有益效果：
[0021] 1.本发明公开了干酪乳杆菌电转化的具体方法和步骤，克服了传统电转化重复性 不好，转化率低的问题。2.经过合理优化的干酪乳杆菌电转化方法，可以应用于多种不同外 源DNA表达，潜在的推动了生物药物基因的高效表达。
【具体实施方式】
[0022]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。
[0023] 实施例1
[0024]本发明公开了一种干酪乳杆菌电转化方法，方法包括了干酪乳杆菌培养、干酪乳 杆菌电转化和转化后再培养，具体步骤为：
[0025]干酪乳杆菌培养：
[0026] A.从低温冷冻冰箱取出一支加入甘油保存的干酪乳杆菌菌种，在MRS固体培养基 上划线，37°C厌氧倒置过夜；
[0027] B.用无菌的接菌环挑取在MRS上生长好的菌落至3-5mL的MRS液体培养基中，37°C 静止培养过夜；
[0028] C.第二日将前一天生长好的菌液lmL转接到50mL的MRS液体里，37°C静止生长至菌 液600nm处紫外吸收值为0.5-0.6时，准备干酪乳杆菌电转化；
[0029]干酪乳杆菌电转化：
[0030] D.将干酪乳杆菌移入50mL离心管里，放到冰盒里静置20分钟后，放到提前预冷到4 。(:离心机中5000r/min，5分钟，弃掉上清，留下沉淀；向沉淀里移入40mL EPWB溶液，使沉淀 悬浮于EPWB溶液中，放到提前预冷到4°C的离心机中5000r/min，5分钟，弃掉水相，留下菌 体，此步骤重复3次，用40mL EPB溶液洗涤菌体一次，弃上清；
[0031] E.菌体用400yL的EPB溶液重悬，分装50-300μLν支(现用现配），用于电转；
[0032] F.质粒DNAlyg加入到之前制备好的干酪乳杆菌感受态细胞中，轻轻混合，冰浴10 分钟；
[0033] G.将质粒与干酪乳杆菌感受态转入提前预冷的2mm电击杯中，冰浴10分钟，
[0034] H.用滤纸将电转化杯表面擦干，放入电转仪中，调节电压2.3kV、电阻200Ω、电容 25yF，脉冲时间约为4-5ms;
[0035] I.向电击杯中快速加入900yL的含有0.5%甘氨酸的MRS，轻轻地用移液器吹吸混 合后移到一个无菌的Eppendorf管中，放到提前调至37°C的80-100rpm/min摇床内孵育1.5-3小时；
[0036]转化后再培养：
[0037] J.孵育后的混合液离心，留下100yL上清，重新悬浮细菌，然后涂布于含有选择压 力的MRS琼脂平板上，37°C无氧倒置培养24-36小时；其中，MRS培养基为莫匹罗星锂盐改良 MRS培养基，EPWB溶液为:NaH2P〇4〇. 6mmol/L和MgCl20. lmmol/L配置而成，EPB溶液为EPWB溶 液基础上加入0.3mol/L蔗糖，调节pH为7.4，并灭菌4°C保存。
[0038] 工作原理：
[0039] 利用高压脉冲电流可以使细胞壁发生瞬间的可逆性穿孔，外源DNA穿过细胞膜而 转移到细胞中，经过一定条件复苏后，细胞膜上的孔径将重新封闭，防止胞内物质外流，然 而由于乳杆菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁厚，外源DNA很难进入细胞，导致电转效率低，重复 性不高，限制了对其基因水平的研究。经过试验反复摸索之后，确立了电击后的乳酸菌需要 在补充0.3mol/L蔗糖的MRS培养液中，37°C静止培养1.5-3小时，再涂布平板的关键步骤建 立，有效的减少电击后细胞在MRS培养基中破裂的情况。
[0040] 实施例2
[0041] 实验目的及方法:为了对比实验方法优化前后乳杆菌电转化率变化，其中优化后 的操作方法如实施例1所述，优化前的操作方法如下：
[0042] 将乳杆菌单菌落接入MRS培养液中，37°C静置培养过夜后，以2%接种量接入20m 1 MRS培养液中，37 °C静置培养约4h左右，至培养液液600nm处紫外吸收值0.15-0.18，离心收 集菌体，用等体积的冰冷电击缓冲液洗涤细胞2次。培养物悬浮于200μ1电击缓冲液中。 [0043] 取ΙμL质粒DNA与40μ1的冰冷细胞悬浮液混合后，移入电击杯中置冰上5min，设置 电压1175kV，电阻100Ω，电容25yF，然后释放电脉冲，电击完毕向杯子中加入400μ1的MRS培 养液，再吸入微量离心管中，37°C静止培养2~3h，取100μΙ涂布在含氯霉素的MRS平板上，培 养24-36h，具体操作参考《微生物技术》等相关标准操作手册。
[0044] 实验结果：
[0045] 表1优化前后转化率对照表
[0046]
[0047]注:转化率为每单位质量DNA分子获得转化子数，单位为转化子数每微克DNA分子。 [0048]如表1所示，通过多次实验后对比优化前后的平均转化率可以发现，优化后的转化 率较优化前的转化率有50多倍的提高，克服了传统电转化方法重复性不好，转化率低的问 题。
[0049]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种干酪乳杆菌电转化方法，其特征在于，所述的方法包括了干酪乳杆菌培养、干酪 乳杆菌电转化和转化后再培养，具体步骤为： 干酪乳杆菌培养： A. 从低温冷冻冰箱取出一支加入甘油保存的干酪乳杆菌菌种，在MRS固体培养基上划 线，37 °C厌氧倒置培养； B. 用无菌的接菌环挑取在MRS上生长好的菌落至试管里MRS液体培养基中，37°C静止培 养过夜； C. 第二日将前一天生长好的菌液lmL转接到50mL MRS液体里，37°C静止生长至菌液 600nm处紫外吸收值为0.5-0.6时，准备干酪乳杆菌电转化； 干酪乳杆菌电转化： D. 将干酪乳杆菌移入50mL离心管里，放到冰盒里静置20分钟后，放到提前预冷到4°C离 心机中5000r/min，5分钟，弃掉上清，留下沉淀；向沉淀里移入40mL EPWB溶液，使沉淀悬浮 于EPWB溶液中，放到提前预冷到4°C的离心机中5000r/min，5分钟，弃掉水相，留下菌体，此 步骤重复3次，用40mL EPB溶液洗涤菌体一次，弃上清； E. 菌体用400yL的EPB溶液重悬，分装500-300μ!7支(现用现配），用于电转； F. 质粒DNAlyg加入到之前制备好的干酪乳杆菌感受态细胞中，轻轻混合，冰浴10分钟； G. 将质粒与干酪乳杆菌感受态转入提前预冷的2mm电击杯中，冰浴10分钟； H. 用滤纸将电转化杯表面擦干，放入电转仪中，调节电压2.3kV、电阻200Ω、电容25yF， 脉冲时间约为4_5ms; I. 向电击杯中快速加入900yL的含有0.5 %甘氨酸的MRS，轻轻地用移液器吹吸混合后 移到一个无菌的Eppendorf管中，放到提前调至37°C的80-100rpm/min摇床内孵育1.5-3小 时； 转化后再培养： J. 孵育后的混合液离心，留下l〇〇yL上清，重新悬浮;然后涂布于含有选择压力的MRS琼 脂平板上，37 °C无氧倒置培养24-36小时。2.如权利要求1所述的一种干酪乳杆菌电转化方法，其特征在于:所述的MRS培养基为 莫匹罗星锂盐改良MRS培养基，所述的EPWB溶液为:NaH2P〇4 0.6mmol/L和MgCl2 0. lmmol/L 配置而成，所述的溶液为EPWB溶液基础上加入0.3mol/L蔗糖，调节pH为7.4，并灭菌4°C 保存。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，公开了一种干酪乳杆菌电转化方法，包括了干酪乳杆菌电转化的具体方法和步骤，克服了传统电转化重复性不好，转化率低的问题，经过合理优化的干酪乳杆菌电转化方法，可以应用于多种不同外源DNA表达，潜在的推动了生物药物基因的高效表达。
【IPC分类】C12N15/74
【公开号】CN105567725
【申请号】CN201610053312
【发明人】余丽芸, 侯喜林
【申请人】黑龙江八一农垦大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月27日