专利名称：免疫原或诊断剂的制备及其获得免疫原或诊断试剂的方法
技术领域：
本发明的主题涉及模仿对某疾病特异的抗原或病原生物体的免疫原或诊断试剂的制备方法，该疾病甚至可以是不典型的或未知的(这里包括已知或未知其病因/或病原的自身免疫疾病)。此方法基于能和引起感染的生物体发生特异性反应的抗体，单克隆或多克隆、或血清中抗体的存在及可用性。
适用于本方法的抗体对任何感兴趣的抗原是特异的，这就是寻找模仿这种抗原的免疫原或诊断试剂的目的。这种抗原可以是合成的、天然资源衍生的或重组产生的蛋白质或肽；碳水化合物；多糖；糖蛋白；激素；受体；抗体；病毒；底物；代谢物；相变类似物；辅基；药物；染料；营养素；生长因子；细胞成份；致癌基因产物；细菌和它们的胞外产物；哺乳动物细胞和其抽提物，它们包括肿瘤细胞，病毒感染的细胞和正常细胞；寄生物；原生动物；疟疾抗原；蠕虫；真菌；立克次氏体；或包括但不限于花粉，灰尘，作为致敏原的皮肤皮屑或其抽提物的致敏原；或毒液，毒物，毒素，或类毒素；包括DNA的核酸；或者是不加限制的任何其它抗原。适用于本发明的病毒抗原包括但不限于来自如下病的抗原脊髓灰质炎病毒，流感病毒，HIV，HTLV，乳头状瘤病毒，腺病毒，副流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，呼吸道合胞体病毒，船热病毒，东西脑脊髓炎病毒，日本乙型脑脊髓炎病毒，俄罗斯春夏脑脊髓炎病毒，猪霍乱病毒，肝炎病毒，痘病素，狂犬病毒，湿垫病毒，疱疹病毒，巨细胞病毒，口蹄疫病毒，鼻病毒，新域疫病毒，疫苗病毒，猪a疱疹病毒I型。不加限定，此模拟物可以是免疫原、疫苗、抑制剂或激活剂等。
已知，现在销售的或接受临床试验的所有疫苗和诊断试剂，通常通过基于病原生物体或其成份的操作方法处理，修饰和/或调试的方法制得。虽然这些方法产生了很好的结果，但并不是没有问题。与这些方法相关的最大局限性和此事实相关这些方法依赖于直接来源于病原生物体或其成份的信息和/或材料的可利用性。
以前为了克服上述限制的尝试由于缺乏一个有效的和可重复的实验方法而失败；特别是，为了识别和说明用于诊断和疫苗治疗的免疫原模拟物的特征，这些尝试没能提供充分的信息。必须强调的是本发明着重于克服以前建议采用的方法中的概念上和技术上不充分的新技术开发。
本发明的一个主要特征是选择抗原或免疫原模仿物的新策略，这种选择是基于来自病人血清样品的使用，作为试剂，以及用健康个体血清样品进行反选择的步骤。
依据本发明，制备方法的使用允许这种限制被克服，并且提供了以下描述中将阐明的其它优点。
依据本发明，下列实施基本上说明了模仿对某疾病特异的抗原或病原生物体的免疫原或诊断试剂的制备方法—识别至少一个抗体，该抗体同对某疾病特异的抗原或病原生物体相反应；
—构建在衣壳表面上表达寡肽的噬菌体文库，这种衣壳寡肽的表达是通过使用基因操作技术，将随机序列的寡核苷酸插入子引入编码噬菌体衣壳基因中而实现的；—选择表现在被所述抗体识别的衣壳抗原寡肽表面上的噬菌体；可选择地，用第一个病原的血清选择，用第二个不同的病原血清随后筛选，并且，用健康个体的血清样品组作反筛选；—为了形成对特定病原试剂，或一般地对疾病的诊断试剂盒，这些疾病包括已知或未知病因和/或病原的免疫学上的紊乱，即所谓典型的自身免疫疾病，可选择性地使用所选的噬菌体和/或其片段和/或它们的衍生物；—为了形成该抗原—抗体反应的拮抗物，用于由所述抗原引起疾病的治疗，可选择性地使用所选的噬菌体和/或其它片段和/或它们的衍生物；—为了诱导对化合物和/或天然或合成制备物的过敏性和/或变态反应的耐受现象，可选择性地使用所选的噬菌体和/或其片段和/或它们的衍生物；—可选择性地用所选的噬菌体和/或其片段和/或它们的衍生物免疫生物体；和—可选择性在确认，在免疫过的生物体血清中，识别上述对某疾病特异的抗原或生物体的抗体的存在。
如果对所述病原物特异的所述抗体是保护性的或中和性的，用于所述免疫的材料可用于制成抗述特异病原物的疫苗。
依据本发明，可优选采用丝状噬菌体M13，F1和Fd，或其衍生物构建噬菌体文库。下面是这样做的理由
—在分子生物学和遗传工程领域，一般采用丝状噬菌体作为分子载体。例如，利用它们包含单链DNA螺旋基因组的特性，它们特别地用于DNA测序，定点突变，蛋白质和肽的表达实验中；—单链DNA基因组包含的必要和充分的信息被很好地特征化了，并且这些信息可转移到其它分子载体中；同样地表明，通过增加或插入另外氨基酸序列的方法，可修饰至少二个丝状噬菌体的衣壳蛋白质。所得的噬菌体是衣壳化的，并保持复制和在大多数情况下不感染细菌细胞的能力。依据这种情况，外源氨基酸序列在噬菌体表面表达，并且能通过其与抗体或其它特异分子的相互作用而被识别。
依据本发明，能用于免疫原和诊断试剂制备过程的抗体，可以是单克隆抗体，多克隆抗体或血清中的抗体。后一种形式具有特殊的意义，因为它首次提供了可重复的实验策略在缺乏天然的和病理性的抗原结构和特征信息的情况下，来确认新抗原或免疫原模拟物。
用随机寡核苷酸序列插入的方法，编码噬菌体衣壳的基因可以是编码噬菌体衣壳蛋白VIII的基因或是编码所述噬菌体蛋白III的基因。
依据本发明方法能不受限制地应用于产生疾病的任何抗体或生物体。使用单克隆抗体或对人类乙肝病毒表面抗原(HBSAg)特异的血清，已经取得好的结果。
被所用抗体识别的抗原寡肽，可通过随机寡核苷酸序列插入子的表达而得到，并使用载体，例如质粒pC89。
依据本发明，在免疫原和诊断试剂的制备方法中，选择噬菌体是可能，在这种噬菌体的衣壳中，包含从限制性内切酶EcoRI(GAATTC)识别位点到限制性内切酶BamHI(GGATCC)的识别位点，包含序列识别号为1，2，3，7和从9至68的序列之一。
本发明不仅仅限于抗某一特异性病原物的免疫原或诊断试剂的制备方法，而且可扩展到使用上述方法制得的免疫原和诊断试剂及在上述的方法中使用的噬菌体。
此外，本发明也可扩展到全部地或部分地包含由下列组中选择的核苷酸序列的质粒pC89，此组中序列包括序列识别号为4，5，6和8的序列。
用本发明方法制得的免疫原可用作疫苗或免疫剂及诊断试剂。根据文献中已知的标准方法，这种疫苗或免疫物在需要此治疗时，可用于病人。这种疫苗或免疫物既可单独地，也可混合地给药和使用。本发明的疫苗和免疫原包括噬菌体或蛋白质以及从其中分离的肽。
可制备包含用本发明方法得到的免疫原试剂盒。这样的试剂盒用于检测样品中抗原的存在。这种特性能用于不同的目的，包括但不限于法医分析和流行病研究。这种试剂盒应包括一个分隔的载体，该载体适用于支持在接近密封状况下的至少一个容器。这种载体进一步包括免疫原，和用于检验抗原的抗体的试剂。这种载体也可包含一种检验方法，例如标记的抗原或酶底物或其类似物。
根据已知的方法，例如通过药学上可接受的载体混合物，可形成药剂上有用的组合物，该组合物包括本发明的免疫原和疫苗。这种载体和配制方法的实施例可在Remington的药剂学中找到。为了制成药学上可接受的，并适合于有效给药的组合物，这种组合物将包含有效量的本发明疫苗或免疫原。
本发明的治疗或诊断组合物，以治疗或诊断该相关疾病的量，给药于个体。根据诸如个体的状况，体重，性别和年龄等因素的不同，其有效剂量不同。其它的因素包括给药的方式。药剂组合物可通过诸如皮下的，局部的，口服的和肌肉内的不同途径提供给个体。
本发明也有提供适用于局部的，口服内吸的和非肠道的药剂配方，用在本发明的新治疗方法中的目的。依据本发明，包含被确认为活性成分的疫苗或免疫原的组合物，能以常规载和以广泛的不同治疗剂量形式给药。例如，免疫原和疫苗能以诸如口服剂量形式给药，即片剂，胶囊(每个包括控释和缓释配方)，丸剂，粉剂，颗粒剂，煎剂，酊剂，溶液，悬液，糖浆和乳剂，或通过注射。同样地，它们或许也能以下列方式给药，即静脉内的(静脉内注入和灌注)，腹膜内的，皮下的，有封闭或无封闭的局部的或肌肉内的形式，使用的所有形式都是药学文献中公知的技术。能采用一个有效的但无毒的疫苗和免疫原的量。
疫苗和免疫原的日剂量变动幅度大，从0.01到1000mg每个成年人/每天。对口服给药来说，疫苗和免疫原最好以有刻痕的或无刻痕的片剂形式提供，这些片剂包含0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，15.0，25.0，和50.0毫克活性成分，可依所致病人的症状不同调整给药剂量。一般提供的有效疫苗和免疫原量可在大约0.001mg/kg到100mg/kg体重/每天的剂量水平。从0.001mg/kg到10mg/kg体重/每天的剂量范围是特别多的。一旦调整好疫苗和免疫原的剂量，混合就达到了预期效果。另一方面，这些不同因子的剂量可以独自地最优化，也可以混合起来达到协同作用的效果，其中，其病理作用缓解比任一因子被单独使用时的效果好得多。
它的好处是，本发明的疫苗或免疫原或许能以单剂量或每天的一次剂量，或每天的总剂量形式给药，这种每天的总剂量能以每天二次，三次，或四次的分剂量形式给药。此外，本发明的疫苗或免疫原能以鼻内的形式给药，即通过适当鼻内载体的局部使用，或通过透皮途径，并使用文献中已知的通用透皮贴剂的形式。为了以透皮传送系统的方式给药，当然，在整个服药方案中，给药剂量将连续的，而不是间歇的。
对于用一种以上活性剂的联合治疗，其中的活性剂是以分开剂量形式配制，这些活性剂能被同时给药，或者它们每一个在分隔交错的时间给药。
使用本发明的疫苗或免疫原的剂量方法的选择依据包括病人的类型，种族，年龄，体重，性别和体格状态等不同因素；要治疗情况的严重程度；给药方式；病人的肾脏和肝脏的功能；和其中使用的特殊疫苗和免疫原。具一般技能的医生或兽医能很容易地确定和开出能预防、消除和阻止病情发展的本发明疫苗或免疫原的有效剂量处方。在达到本发明有效但无毒副作用范围的疫苗或免疫原浓度时，其浓度的最佳精确值要求一个方案，该方案基于适合目标位点的本发明疫苗或免疫原的动力学。这涉及到考虑本发明疫苗或免疫原的分布，稳定，和消除。
在本发明的方法中，这里详述的免疫原或疫苗能形成活性成分，能典型地以同适当的药剂稀释剂，赋形剂或载体(这里也可统指“载体”物质)混合物的形式给药，这些稀释剂，赋形剂或载体是依据预想的给药形式适当地选择的，口服片剂，胶囊，煎剂，糖浆等，并且它是和常规的药剂应用是一致的。
例如，对于以片剂或胶囊形式的口服给药来说，活性疫苗或免疫原组份能同可口服的，无毒的，药学上可接受的惰性载体，例如乙醇，甘油，水等混合。等惰性载体。并且，当想要或需要时，也能将适当的粘合剂，润滑剂，分散剂和染色剂掺入混合物中。适当的粘合剂不受限制地包括淀粉，明胶，诸如葡萄糖或β—乳糖等的天然糖，谷类糖，天然的和合成胶，例如，阿拉伯树胶，黄蓍胶或海藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡等。在这些剂量形式中所用的润滑剂，无限制地包括油酸钠，硬酯酯钠，硬酯酸镁，苯甲酸钠，醋酸钠，氯化钠等。分散剂无限制地包括淀粉，甲基纤维素，皂土胶，黄原胶等。
对液体剂型来说，活性疫苗或免疫原能同下列适当口味的悬浮或分散剂混和，例如，合成的和天然的胶，如黄蓍胶，阿拉伯树胶，甲基纤维素等。其它能使用的分散剂包括丙三醇等。对非肠道给药来说，要求无菌的悬浮物和溶液。当要求静脉给药时，可使用一般包含当防腐剂的等渗制剂。
包含活性疫苗或免疫原成分的局部制剂可以同文献中已知的不同载体物质相混合，例如，乙醇，芦荟胶，尿囊素，丙三醇，维生素A和E油，矿物油，PPG2肉豆蔻丙酸盐等，用来形成诸如乙醇溶液，局部清洁剂，清洁霜，皮肤用胶，皮肤涂剂，和配成霜或胶状的洗发剂。
本发明的疫苗或免疫原也能以脂质体传递系统的形式给药，例如小的单层囊泡，大的单层囊泡和多层囊泡。脂质体能从不同的磷脂形式，例如胆固醇，硬脂酰胺，磷脂酰胆碱来形成。
本发明免疫原或疫苗也可以利用作为单个载体的单克隆抗体传送，且这种疫苗或免疫原偶联到单个载体上。本发明的疫苗或免疫原也可以使用作为目标疫苗或免疫载体的可溶性聚合物偶联。这种聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃共聚物、多羟基丙异丁烯酰胺苯酚，多羟基乙基门冬氨酰苯酚，或代有棕榈酰残基的多乙基内氧化多赖氨酸。此外，本发明的疫苗或免疫原也能偶联到一组可生物降解的聚合物上，这些聚合物在达到疫苗或免疫原的控释时有用，例如，聚乙酸，poly epsilon己酸内酯、多羟正丁酸，聚原酸酯，聚乙缩醛，聚双氢吡喃，聚氰丙烯，和交联水凝胶共聚物或两性基因保护的水凝胶共聚物。
直到这一点，已给出了本发明主题的一般性描述。借助于下列实施例，将能给出本发明特殊体现的详细阐述，目的在于更好地理解其目标，特征，优点和应用方法。依据本发明，下列实施例分别指抗某一特定病物的免疫原或诊断试剂制备方法的具体再现；克隆有效性的证明，该克隆是为了制备免疫原而选择的，这种免疫原是基于用单个克隆免疫试验动物所得血清样品产生的作用；指克隆有效性的证明，该克隆是为了制备诊断试剂而选择的，这种诊断试剂是基于用HPSAg免疫个体血清同它们的特异性反应。
里面的一个图表现了为本发明构建的质粒PC89基因图谱的一部分。其下说明了在上述部分基因图谱中，限制性位点的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。为了引入单—EcoRI和BamHI位点，修饰了成熟PVIII氨基末端的野生型氨基酸序列。
实施例1人类乙肝病毒(HBV)所致疾病的特异诊断试剂和免疫原的制备方法依据本发明，使用下列方法制备了第一个抗原决定族的“文库”，该文库是由具有寡肽的噬菌体组成，该寡肽带有的9个氨基酸出现在衣壳表面上，该文库通过随机寡核苷酸插入子而表达，这种插入子引入了编码噬菌体衣壳蛋白VIII的基因中。为表达包含抗原决定簇的重组蛋白质的，使用了PC89质粒，该质粒按F.Felici等人描述的方法构建，“从大的寡肽文库中选择抗体配体，这些寡肽在一个多价裸露载体上表达(J.Mol.Biol.(1991)，222，301—310)，图中显示该载体的一部分基因图谱。
第二个抗原决定簇“文库”按第一个“文库”同样的方式制备，所不的是两个胱氨酸残基出规在插入子的两个末端，按照A.Luazzaso等的通过噬菌体被附的肽模仿不连续的衣壳，“利用限定肽的噬菌文库，人类H铁蛋白的抗原决定簇图谱”，Gene(1993)，128，51—57。
用HBV表面抗原(HBSAg)的重组形式免疫单个个体所得的血清样品，被用于检验抗HBSAg特异抗体的存在。然后，使用含抗HBSAg高抗体含量的血清。
将包含在这些血清中的抗体固定化在固体基质上，然后和噬菌体文库一起培养。被这些抗体特异性地保留的噬菌体，然后被洗脱和扩增。
被上面所选噬菌体感染的细菌被涂布在固体培养基上，并被转移在硝酸纤维素滤膜上。随后，这些滤膜和单个个体的血清一起培养，这个单个个体是被免疫来抗不同于第一次富集所用血清中的HBSAg。被这些血清中抗体特异识别的噬菌体被鉴定和分离。
用ELISA试验，为了同对HBSAg无免疫性的单个个血清抗体起反应，将以上识别的噬菌体进行反选择。
通过ELISA试验中的竞争法，为了对抗抗—HBSAg的反应特异性，选择得到的噬菌体。
随后确定了用这种方法识别的编码抗原决定簇基因的核苷酸序列(序列识别号为4，5，6，8)实施例2所选噬菌体证明为人类乙肝病毒(HBV)所致疾病的特异免疫原使用了下列方法扩增和纯化了上述的选择的噬菌体。
依据V.F.de La Cruz等在下列文献中所描述的方法，将纯化的噬菌体注入试验动物体中(小鼠，大鼠，家兔)，通过遗传工程构建的丝状噬菌体，作出外源序列的的免疫原性和抗原决定簇的图谱，J.BioL.CHem.(1988)263，9，4318—4322，和J.Greenwood等等的外源肽在丝状噬菌体中的多重显现，J.MoL.BioL.(1991)220，821—827。
用ELISA试验，为了证明能和HBSAg相反应的抗体存在，检验了按上述方法免疫的动物血清。这种方法突出了按上述方式免疫的实验动物血清中高水平抗—HBSAg抗体的存在。
用合成寡肽免疫原复制按上述给出的步骤鉴定的抗原决定簇氨基酸序列(序列鉴定号从1到3，和7))，采纳了同样的免疫方法。这种方法突出了按上述方式免疫的实验动物血清中高水平抗—HBSAg抗体的存在。
采纳了同样的免疫方法。用细菌中产生的免疫原重组形式，在该细菌中，人类铁蛋白的重链出现在表面上，用合成寡肽复制依据上述给出步骤鉴定的抗原决定簇的氨基酸序列。这种方法突出了按上述方式免疫的实验动物血清中高水平抗—HBSAg抗体的存在。
实施例3为了确定血清中抗—HBSAg抗体的存在，证明了作为诊断试剂的所选噬菌体的有效性使用了包括下列操作的方法在ELISA试验中，分析了接种抗—HBSAg疫苗的20个人类单个个体血清，目的是说明特异性地识别噬菌体克隆的能力，这些克隆按实施例1中描述的方法鉴定，并且显示了所述肽序列(序列鉴定号从1到3，和7)。这些结果表明80％的血清特异地识别所选四个序列中至少一个序列。
按ELISA试验方法分析了16个患乙肝和包含抗HBSAg抗体病人的人类血清，目的是证明它们特异地识别噬菌体克隆的能力，这些克隆按实施例1所述的方法鉴定，并且表明了所述的肽序列(序列鉴定号从1到3，和7)，这个结果表明44％的血清特异性地识别所选四个序列中的至少一个序列。
按ELISA试验方法，分析了不接种抗—HBSAg20个单个个体的人类血清，目的是表明它们特异地识别噬菌体克隆能力，这些克隆按实施例1所述的方法鉴定，并且显示了所述肽序列(序列鉴定号从1到3，和7)。结果表明没有血清特异地识别四个所选序列中的任何一种。
实施例4
人类丙肝病毒(HCV)所致疾病的特异诊断试剂和免疫原的制备方法依据本发明，使用下列方法制备了抗原决定簇的第一个“文库”，该文库是由带有9个氨基酸寡肽的噬菌体，这9个氨基酸出现在衣壳表面，该文库被随机寡核苷酸插入子所表达，该插入子引入编码噬菌体蛋白VIII基因中。为了进行含抗原决定簇的重组蛋白的表达，使用了质粒PC89，该质粒按F.Felici等在文献所述的方法构建，“从大的寡肽文库中选择抗体配体，该寡肽在多价裸露载体中表达，J.MoL.BioL.(1991)，222，301—310。图中表示载基因图谱的一部分。
第二个抗原决定簇“文库”按第一个文库同样的方式制备，所不同的是两个胱氨酸残基出现在插入子的两个末端，该文库在A.Luzzago等的使用含肽的噬菌体文库，构建人类H铁蛋白抗原决定簇I图谱，Gene(1993)，128，51—57。
然后，使用临床上已确认被丙肝病毒感染病人的血清。
将这些血清中的抗体固定化在固体基质上，并和噬菌体文库培养。然后洗脱和扩增被这些抗体特异保留的噬菌体。
将被如上所选噬菌体感染的细菌涂布在固体培养基上，再转移到硝酸纤维素滤膜上。随后，将这些滤膜同被HCV感染的病人血清培养，这些血清不同第一次富集所用的血清。分离和鉴定被血清中抗体特异识别的噬菌体。
用ELISA试验，为了反作用不被HCV感染病人血清中的抗体，对按上述方式鉴定的噬菌体进行反选择。
按下述方法统计评价上述噬菌体同抗HCV抗体反应的特异性。在ELISA试验中，确定被HCV感染病人的大量血清识别噬菌体克隆的频率。在平行实验中，又用ELISA试验，试验了不被HCV感染的许多病人血清不识别相同的噬菌体克隆。对于每个噬菌体克隆来说，通过将被HCV感染病人的血清识别频率同不被HCV感染病人的血清识别频率相比较，来评价其特异性。
随后，确定用这种方法鉴定的抗原决定簇肽序列(序列鉴定号从9到30)。
实施例5为了确认血清中抗—HCV抗体的存在，证明了所选噬菌作为诊断试剂的有效性。
使用了包括下列操作的方法用ELISA试验，为了说明它们特异识别噬菌体克隆的能力，分析了没被HCV感染的40个人的血清，该噬菌体克隆按实施例4中所述的方法被鉴定，并且显示了所述的肽序列(序列鉴定号从9到23)。这些结果表明没有血清识别所选的序列。
为了说明它们特异识别噬菌体克隆的能力，用ELISA试验，分析了被HCV感染的42个病人的血清，该噬菌体克隆按实施例4中所述的方法被鉴定，并显示所述的肽序列(序列鉴定号从9到23)。这些结果表明每个噬菌体克隆被所选的血清特异识别，其识别频率从15％至65％不等。(见表I)。同样的结果也表明被试验的42份血清中的每一个特异识别至少所选序列之一。
所选序列有效地说明所有试验病人血液中抗HCV抗体的存在，并且该序列不和非感染个体的血液反应。这些数据表明所选的噬菌体克隆组形成了一个诊断丙肝病毒感染的可靠系统。
表1 ”＝阳性 ”＝阴性□”＝未分析实施例6针对由人类丙肝病毒所致，和/或与人类丙肝病毒相关的II型冷球蛋白症的特异诊断试剂和免疫原的制备方法依据本发明，使用了下述方法制备了第一个抗原决定簇“文库”，该文库由在衣壳表面表达具有9个氨基酸的噬菌体组成，该文库被随机寡核苷酸序列插入子所表达，该插入子引入编码噬菌体衣壳蛋白VIII的基因中。为了表达含抗原决定簇的重组蛋白质，使用了PC89质粒，该质粒按F.Felici等的“从大的寡肽文库中选择抗体配体，该寡肽在多肽裸露载体中被表达”，J.MoL.BioL.(1991)，222，301—310，图中表示了载体的部分基因图谱。
第二个抗原决定簇“文库”按第一个相同的方式被制备，所不同的是两个胱氨酸残基存在于插入子的两末端，并按A.Luzzago等的，通过再现噬菌体肽模仿不连续抗原决定簇I。用含肽的噬菌体文库，给出人类H铁蛋白的抗原决定簇的图谱，Gene(1993)，128，51—57。
将由人类丙肝病毒所致，和/或与人类丙肝病毒相关的II型冷球蛋白症个体的抗体样品，固定在因体基质上，并和噬菌体文库培养。洗脱和扩增被所述抗体特异保留的噬菌体。
将被以上所选噬菌体感染的细菌，涂布在固体培养基上，然后转移在硝酸纤维素滤膜上。随后，将这些滤膜和患II型冷球蛋白症病人的血清培养保温，该疾病是由和/或与人类丙肝病毒(HCV)相关的病毒所引起的，所用的血清不同于第一次富集所用的血清。鉴定和分离血清中抗体特异识别的噬菌体。
用ELISA试验，为了反作用于不患II型冷球蛋白症个体血清中的抗体，反选择以上鉴定的噬菌体，该病由人类丙肝病毒所致，和/或与人类丙肝病毒相关。
以下从统计上评估来自反选择的噬菌体和抗体相互作用的特异性，该抗体对和/或与人类丙肝病毒相关病毒所致II型冷球蛋白症的抗体是特异的。在ELISA试验，确定了许多血清识别噬菌体克隆的频率，这些血清亲自和/或与人类丙肝病毒(HCV)相关病毒所致的II型冷球蛋白症患者。在平行实验中，再使用ELISA试验，试验了不患此病个体的许多血清并不识别相同的噬菌体克隆。对每个噬菌体克隆来说，通过比较被患此病患者血清识别的频率和健康个体血清识别的频率，来评价其特异性。
随后，确定用这种方式鉴定的抗原决定簇肽序列(序列鉴定号从31到42)。
实施例7为了确定由人类丙肝病毒所致，和/或人类丙肝病毒相关的II型冷球蛋白症特异抗体的存在，证明了所选噬菌体作为诊断试剂的有效性。
使用了包含下列操作的方法在ELISA试验中，为了呈现它们特异识别噬菌体克隆的能力，分析了16个不患有由人类丙肝病毒所致，和/或与人类丙肝病毒相关的所致II型冷球蛋白症个体血清，这些血清按实施例6所述方式鉴定，并显示了所述肽序列(序列鉴定号从31到42)。这些结果表明没有血清识别所选择的序列。
在ELISA试验中，为了表现它们特异识别噬菌体的能力，分析了80个患有由人类丙肝病毒所致，和/或与人类丙肝病毒相关的II型冷球蛋白症病人的血清，该血清按实施例6所述方法鉴定，并表明了所述的肽序列(序列鉴定呈从31到42)。这些结果显示所选血清特异识别每个噬菌体克隆，其识别频率从15—60％不等。
所选序列有效地表明所实验病人血液中对II型冷球蛋白症特异的抗体存在，该疾病由人类丙肝病毒所致，和/或与之相关，并且所选的序列不同不患此病的个人血液反应。这些数据表明所选噬菌体克隆组形成了一个可靠的系统，此系统是用于由人类丙肝病毒所致和/或与之相关的II型冷球蛋白症的诊断。
所选序列表现出和人类LAG—3基因序列显著同源，该基因序列被T淋巴细胞和“自然杀伤”细胞所特异地表达。用于选择噬菌体克隆的相同抗体同蛋白LAG—3的部分相反应，蛋白LAG—3和所选噬菌体克隆的序列同源。这种识别可通过与所选噬菌体克隆竞争来消除。这些结果表明所选的噬菌体克隆能用于阻止自身抗体同蛋白LAG—3结合。
实施例8针对I型糖尿病自动免疫疾病诊断的制备方法，以及为了确定血液中自身免疫疾病特征化的自身抗体的存在，表明了所选的噬菌体作为诊断试剂的有效性。
依据本发明，使用了下列方法制备抗原决定簇的第一“文库”，该文库是由带有9个氨基酸的寡肽的噬菌体所组成，这9个氨基酸出现在衣壳的表面上，该文库通过随机寡核苷酸插入子所表达，该插入子引入编码噬菌体衣壳蛋白VIII的基因中。为了表达含抗原决定部位重组蛋白，使用了质粒PC89，该质粒按F.Felici等的“从大的寡肽文库中选择抗体配体，该寡肽在多价裸露载体中表达，J.MoL.BioL.(1991)，222，301—310。
第二个抗原决定簇“文库”按第一种同样的方式被制备，所不同的是两个胱氨酸残基存在于插入子的两个末端，象A.Luzzgo等的通过表现肽的噬菌体模仿不连续的抗原决定簇I。使用含肽的噬菌体文库，给出人类H铁蛋白的抗原决定簇文库，Gene(1993)，128，51—57。
试验了I型糖尿病病人初期血清样品，目的是为了证明对该病特征化标记的特异抗体存在，例如，以下标记抗胰岛素和ICA抗体，或抗胰岛的抗体。然后，用高抗体浓度的血清做选择。
将这种血清中的抗体固定在固相基质上，并和噬菌体文库一起培养。然后，洗脱和扩增被这些抗体特异保留的噬菌体。
将由以上所选噬菌体感染的细菌涂布在固体培养基上，并转移到硝酸纤维素滤膜上。随后，将这些滤膜和糖尿病人的血清一起培养，该血清不同于第一次加富所用的血清。分离和鉴定了被这些血清中的抗体特异识别的噬菌体。
用ELISA试验，为了反作用于不患I型糖尿病病人血清中抗体，按以上鉴定的噬菌体被反选择。
为了证明反应的特异性，通过大范围筛选，检查这种反选择所得的噬菌体，并且使用糖尿病患者不同疾病阶段的血清。然后，确定用这种方法鉴定的抗原决定簇的核苷酸序列。
用下列方法分析噬菌体克隆
用ELISA试验，为了说明它们特异识别噬菌体克隆的能力，分析了25个取自I型糖尿病病人早期临床症状出现时的血清，该血清按所述方式鉴定，并表现出所述的肽序列(序列鉴定号43，44，45，46，47)。这些结果表明36％的血清特异地识别5个所选序列中至少一个。
用ELISA试验，为了说明它们特异识别噬菌体克隆的能力，分析了16个取自自动免疫病而非糖尿病病人的血清，这些血清按实施例8所述的方式鉴定，并显示所述的肽序列(序列鉴定号分别为43，44，45，46，47)。这些结果表明18％的血清特异地识别5个所选序列中的至少一个。
用ELISA试验，为了说明它们特异识别噬菌体克隆的能力，分析了50个取自不患糖尿病病人或不患自动免疫病病人的血清，该血清按实施例8所述的方式鉴定，并显示所述的肽序列(序列鉴定号分别为43，44，，45，46，47)。这些结果表明没有血清特异识别5个所选序列中的任一个。
实施例9对人类肿瘤蛋白NEU(P185HERZ)免疫应答检测和诱导特异的诊断试剂和免疫原制备方法依据本发明，使用了下列方法单克隆抗体MGr2和MGr6被鉴定为特异地识别人类肿瘤蛋白NEU(P185HERZ)。
制备两个抗原决定簇“文库”，这些文库是由展现寡肽在衣壳的表面上的噬菌体所组成(该衣壳和实施例1中所述样)，用生物筛选法检验这些衣壳(V.Parmley，S.F..J Smith，G.P.，可选择抗体的丝状fd噬菌体载体目标基因的亲合纯化，Gene(1988)73，305—318)，目的是为了选择能同上述抗体特异反应的克隆。
将被以上所选噬菌体感染的细菌涂布在固体培养基的表面，并转移至硝酸纤维素滤膜上。随后，将这些滤膜和单克隆抗体MGr2及MGr6一起培养。用ELISA试验，控制用这种方式鉴别的噬菌体反应的特异性。
随后，通过分析相应核苷酸序列(对MGr2来说，序列鉴定号为48到56；对MGr6来说，序列鉴定号为57到68)，确定用以上方法鉴定的抗原决定簇的肽序列。
将以上所选噬菌体扩增，纯化，再后注射到实验动物中，依据实施例2中描述的步骤。用免疫组织化学试验，为了证明能同NEU相反应的抗体的存在，检验了以这种方式免疫动物的血清。
这种方法突出了用这种方式免疫实验动物的血液中，高水平抗NEU抗体的存在。
本实施例中所述噬菌体所得的结果证明，所述噬菌体替代人类肿瘤蛋白NEU作为抗原和免疫在的有效性。这也能允许由此得到的噬菌体或其衍生物被用作为检验肿瘤病人血清中抗NEU抗体的试剂，和/或作为刺激抗NEU抗体应答的特异免疫原。
序列目录的一般信息(i)申请人ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIAMOLEECOLAREP.ANGELETTI S.P.A(ii)发明的题目免疫原和诊断试剂的制备及由此得到的免疫原和诊断试剂的方法(iii)序列数68(iv)通讯地址L(A)收信人地址Societa Italiana Brevetti(B)街道Piazza di Pietra.39(C)城市Rmel(罗马)(D)国家Italy(意大利)(E)邮政编码I—00186(viiii)代理人信息(A)名字DI CERBO.Mario(Dr.)(B)登记号RM/090041/MDC(ix)电信信息(A)电话06/6785941(B)电传06/6794692(C)电报612287 ROP AT(1)序列鉴定号为1的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源性的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步的特征(A)名称多肽(B)鉴定方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号1Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp15 10 15(2)序列鉴定号为2的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源性的
(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步的特征(A)名称多肽(B)鉴定方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号2Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp15 10 15(3)序列鉴定号为3的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源性的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步的特征(A)名称多肽(B)鉴定方法采用特异的抗体选择
(xi)序列描述序列鉴别号3Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp1 5 1015(4)序列鉴定号为4的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(ix)进一步的特征(A)名称多聚核苷酯(B)鉴定方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号4GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 47(5)序列鉴定号为5的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基
(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(ix)进一步的特征(A)名称多聚核苷酯(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号5GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 47(6)序列鉴别号为6的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否
(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(ix)进一步的特征(A)名称多聚核苷酯(B)鉴别方法采用特异的抗体筛选(xi)序列描述序列鉴别号6GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 472序列目录的一般信息(i)申请人ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIAMOLEECOLAREP.ANGELETTI S.P.A(ii)发明题目免疫原和诊断试剂的制备及由此得到的免疫原和诊断试剂的方法(iii)序列数68(iv)通讯地址(A)收信人地址Societa Italiana Brevetti(B)街道Piazza di Pietra.39(C)城市Rmel(罗马)(D)国家Italy(意大利)(E)邮政编码I—00186(viii)代理人信息(A)名字DI CERBO.Mario(Dr.)
(B)登记号RM/090041/MDC(ix)电信信息(A)电话06/6785941(B)电传06/6794692(C)电报612287 ROP AT(1)序列鉴别号为1的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步的特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号1Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp1 5 10 15(2)序列鉴定号为2的信息
(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步的特征(A)名称多肽(B)鉴定方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号2Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp15 10 15(3)序列鉴定号为3的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白
(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步的特征(A)名称多肽(B)鉴别法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号3Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp15 1015(4)序列鉴别号为4的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(ix)进一步的特征
(A)名称多聚核苷酸；(B)鉴别法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号4GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 47(5)序列鉴别号为5的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(ix)进一步的特征(A)名称多聚核苷酸(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号5GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 47(6)序列鉴别号为6的信息(i)序列特征
(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(ix)进一步的特征(A)名称多聚核苷酸(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号6GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 473序列目录的一般信息(i)申请人ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGLAMOLEECOLAREP.ANGELETTI S.P.A(ii)发明题目免疫原和诊断试剂的制备及由此得到的免疫原和诊断试剂的方法(iii)序列数68(iv)通讯地址
(A)收信人地址Societa Italiana Brevetti(B)街道Piazza di Pietra.39(C)城市Rmel(罗马)(D)国家Italy(意大利)(E)邮政编码I—00186(viii)代理人信息(A)名字DI CERBO.Mario(Dr.)(B)登记号RM/090041/MDC(ix)电信信息(A)电话06/6785941(B)电传06/6794692(C)电报612287 ROP AT(1)序列鉴别号为1的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的
(ix)进一步的特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号1Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp1 5 10 15(2)序列鉴别号为2的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步的特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号2Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp15 10 15(3)序列鉴别号为3的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步的特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号3Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp1 5 10 15(4)序列鉴别号为4的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性
(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(ix)进一步特征(A)名称多聚核苷酸(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号4GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 47(5)序列鉴定号为5的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(ix)进一步特征(A)名称多聚核苷酸(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号5GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 47(6)序列鉴别号为6的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(ix)进一步特征(A)名称多聚核苷酸(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号6GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 47
4序列目录的一般信息(i)申请人ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIAMOLEECOLAREP.ANGELETTI S.P.A(ii)发明题目免疫原和诊断试剂的制备及由此得到的免疫原和诊断试剂的方法(iii)序列数68(iv)通讯地址(A)收信人地址Societa Italiana Brevetti(B)街道Piazza di Pietra.39(C)城市Rmel(罗马)(D)国家Italy(意大利)(E)邮政编码I—00186(viii)代理人信息(A)姓名DI CERBO.Mario(Dr.)(B)登记号RM/090041/MDC(ix)电信信息(A)电话06/6785941(B)电传06/6794692(C)电报612287 ROP AT(1)序列鉴别号为1的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型多肽
(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号1Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp1 5 10 15(2)序列鉴别号为2的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源
(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号2Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp1 5 10 15(3)序列鉴别号为3的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接的来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步的特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号3
Glu Phe Cys Arg Thr Cys Ala His Pro Gly Glu His Ala Gly Asp15 10 15(4)序列鉴别号为4的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(ix)进一步特征(A)名称多核苷酯(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号4GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 47(5)序列鉴别号为5的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(v)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(ix)进一步特征(A)名称多核苷酸(B)鉴别方法采用特异的抗体筛选(xi)序列描述序列鉴别号5GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 47(6)序列鉴别号为6的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(ix)进一步的特征(A)名称多聚核苷酸(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号6GAATTCTGCC GAACCTGCGCCCAATCCAGGTGAGCATGCGG GGGATCC 47(7)序列鉴别号为7的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为7Glu Phe Cys Gly Pro Phe Phe Leu Ser Pro Thr Ser Cys Gly Asp15 10 15
(8)序列鉴别号为8的信息(i)序列特征(A)长度47对碱基(B)类型核苷酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)假设的否(iv)反义否(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(ix)进一步特征(A)名称多聚核苷酯(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为8GAATTCTGCG GTCCGTTTTTTCTCTCCCCGACGTCATGCG GGGATCC 47(9)序列鉴别号为9的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性
(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为9Glu Phe Cys Leu Pro Ala His Gly Pro Ser Leu Ser Cys Gly Asp15 10 15(10)序列鉴别号为10的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的
(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为10Glu Phe Cys Leu Pro Trp Gly Val Ala Ala Arg Arg Cys Gly Asp1 5 10 15(11)序列鉴别号为11的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为11Glu Phe Cys Pro Thr His Tyr Thr Thr Ser Ala Pro Cys Gly Asp15 10 15
(12)序列鉴别号为12的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为12Glu Phe Cys Pro Thr His Tyr Ile Ser Ser Arg His Cys Gly Asp15 10 15(13)序列鉴别号为13的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为13Glu Phe Cys Pro Thr His Tyr Ile Ser Thr Ser Leu Cys Gly Asp15 10 15(14)序列鉴别号为14的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为14Glu Phe Cys Thr Arg His Tyr Leu Arg Pro Gly Leu Cys Gly Asp15 10 15(15)序列鉴别号为15的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为15Glu Phe Cys Pro Ser His Tyr Val Pro Arg Ile Tyr Cys Gly Asp15 10 15(16)序列鉴别号为16的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为16Glu Phe Cys Pro Pro His Leu Thr Leu Ser Ser Cys Arg Gly Asp151015(17)序列鉴别号为17的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为1 7Glu Phe Cys Lys Leu Asn Ser Arg Gly Ser Ile Ser Cys Gly Asp15 10 15(18)序列鉴别号为18的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为18Glu Phe Cys Gly Lys Phe Pro Gly Ser Lys Pro Ser Cys Gly Asp1 5 10 15(19)序列鉴别号为19的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为19Glu Phe Cys Phe Pro Gly Gly Pro Pro Leu Arg Ala Cys Gly Asp1 5 10 15(20)序列鉴别号为20的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为20Glu Phe Cys Ala Pro Ser Leu Pro Ala Gly Tyr Leu Cys Gly Asp151015(21)序列鉴别号为21的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为21Glu Phe Cys Gln Val Pro Gln Ser Arg Leu Glu Pro Trp Gly ASp151015(22)序列鉴别号为22的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为22Glu Phe Asn Lys Arg Glu Trp Ala Pro Pro Pro Asp1510 12(23)序列鉴别号为23的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为23Glu Phe Asn Lys Thr lys Gln Asn Pro Asn Leu Asp15 1012(24)序列鉴别号为24的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为24Glu Phe Thr Ser Leu Gln Pro Asp Arg Ala Gln Asp1 5 10 12(25)序列鉴别号为25的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为25Glu Phe Ser Gly Leu Arg Pro Gly Lys Phe Gln ASp1 51012(26)序列鉴别号为26的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为26Glu Phe Thr Gly Val Arg Glu Ile Ser Phe Gly Asp1 5 10 12(27)序列鉴别号为27的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为27Glu Phe Thr Gly Leu Arg Glu Ser Pro Ser Met Asp1 51012(28)序列鉴别号为28的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为28Glu Phe Ser His Pro His Phe Ser Gly Leu glu Asp15 10 12(29)序列鉴别号为29的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为29Glu Phe Thr Leu Arg Ser Arg Tyr Pro Ala Asp15 10 12(30)序列鉴别号为30的信息(i)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为30Glu Phe Thr Gly Leu Arg His lys Thr Ser Ala Asp1510 12(31)序列鉴别号为31的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为31Glu Phe Cys His Pro Leu Ala Pro Ala Gly Thr Phe Cys Gly Asp15 10 15(32)序列鉴别号为32的信息(i)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为32Glu Phe Cys His Pro Leu Ala Pro Len Asn Phe Cys Gly Asp15 10 14(33)序列鉴别号为33的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号33Glu Phe Cys Gly His Pro Leu Ala Pro Pro Gln Ala Cys Gly Asp1 5 10 15(34)序列鉴别号为34的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号34Glu Phe Cys His Pro Leu Ser Pro Arg Pro Leu Gln Cys Gly Asp1 5 10 15(35)序列鉴别号为35的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号35Glu Phe Cys His Pro Leu Ala Pro Pro His Pro Ser Cys Gly ASp1 5 10 15
(36)序列鉴别号为36的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号36Glu Phe Cys His Pro Leu Ser Pro His Pro Ser Tyr Lys Gly Asp1 510 15(37)序列鉴别号为37的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号37Glu Phe Cys His Pro Leu Ala Thr Gly Pro His Leu Cys Gly Asp1 5 1015(38)序列鉴别号为38的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号38Glu Phe Cys His Pro Leu Ala Pro Ser Pro Ala Val Cys Gly Asp15 10 15(39)序列鉴别号为39的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号39Glu Phe Cys His Pro Leu Pro Pro Ala Ala Thr Phe Cys Gly ASp1 5 10 15
(40)序列鉴别号为40的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号40Glu Phe Cys His Pro Leu Ala Pro Val Pro Arg Gln Cys Gly ASp15 10 15(41)序列鉴别号为41的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号41Glu Phe Cys His Pro Leu Ser Pro Ser Pro Tyr Met Cys Gly Asp15 10 15(42)序列鉴别号为42的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号42Glu Phe Cys ASn His Pro Leu Ser Pro Ser Gly Ala Cys Gly Asp15 10 15(43)序列鉴别号为43的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号43Glu Phe Cys His Ala Val Lys Gly Phe Ser Ala Val Cys Gly ASp15 10 15
(44)序列鉴别号为44的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号44Glu Phe Cys His Ala Val Lys Val Gly ASn Pro Ser Cys Gly ASp15 10 15(45)序列鉴别号为45的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号45Glu Phe Cys His Ala Thr Lys Thr Pro Trp Thr Thr Cys Gly ASp15 10 15(46)序列鉴别号为46的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号46Glu Phe Cys Arg Ala Pro Ser Gly Val Ile Val Gln Cys Gly ASp15 10 15(47)序列鉴别号为47的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号47Glu Phe Cys Gly Gly Ala Ser Ser Gly Cys Lys Pro Cys Gly ASp15 10 15
(48)序列鉴别号为48的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号48Gly Glu Phe Tyr Tyr Pro Thr Trp Met Leu Pro Glu ASp Pro Lys1 510 15(49)序列鉴别号为49的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号49Gly Glu Phe Ser Pro Pro Trp Met Leu Pro Ser Val ASp Pro Lys1 5 10 15(50)序列鉴别号为50的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号50Gly Glu Phe Thr Pro Asn Trp Met Len Gln Asn Leu Asp Pro Lys15 10 15(51)序列鉴别号为51的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号51Gly Glu Phe Thr Pro Arg Trp Met Leu Ser Arg Glu ASp Pro Lys1 5 1015
(52)序列鉴别号为52的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号52Gly Glu Phe Thr Pro Thr Trp Met Leu Ala Arg Trp Asp Pro Lys1 5 10 15(53)序列鉴别号为53的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号53Glu Phe Cys Gly Pro Leu Asp Ser Leu Phe Ala Gln Cys Gly Asp1 5 10 15(54)序列鉴别号为54的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号54Glu Phe Cys Gly Pro Ile Ser Ala Leu Phe Ala Ser Cys Gly Asp1 510 15(55)序列鉴别号为55的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号55Glu Phe Cys Gly Pro ILe His Ala Leu Phe Leu Asp Cys Cly Asp15 10 15
(56)序列鉴别号为56的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为56Glu Phe Cys Gly Pro Ile Ser Ser Leu Phe Gly ASp Cys Gly Asp15 10 15(57)序列鉴别号为57的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号57Gly Glu Phe Ile Cys His Ser Asp Cys Ala Ala Gly ASp Pro Lys15 10 15(58)序列鉴别号为58的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号58Gly Glu Phe Ile Cys His Ser ASp Cys Ala Ser Gly ASp Pro Lys15 10 15(59)序列鉴别号为59的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号59Gly Glu Phe Ile Ala Cys His Ser Asp Cys Gly Ser ASp Pro Lys15 10 15
(60)序列鉴别号为60的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号60Gly Glu Phe Trp Thr Pro Leu LYs Cys ASp Ala Leu Asp Pro Lys1 5 10 15(61)序列鉴别号为61的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号61Gly Glu PHe Pro Ala Ala Phe Gly Lys Leu Gly Val Asp Pro Lys1 5 10 15(62)序列鉴别号为62的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽
(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号62Glu Phe Cys Leu VAl Leu Pro Lys Val Lys Met Ala Cys Gly Asp15 1015(63)序列鉴别号为63的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号为63Glu Phe Cys Ala Arg Leu Pro Val Leu Lys Leu Lys Leu Val Cys15 10Gly Asp15(64)序列鉴别号为64的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号64Glu Phe Cys ILe Trp Leu Pro Arg Ile Lys Leu Ser Cys Gly Asp15 10 15(65)序列鉴别号为65的信息(i)序列特征
(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号65Glu Phe Cys Phe Ser Ile Pro Ser Leu Lys Thr Val Cys Gly Asp15 10 15(66)序列鉴别号为66的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是
(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号66Glu Phe Cys Phe Arg Gly Pro Arg Gln Lys Leu Tyr Cys Gly ASp15 10 15(67)序列鉴别号为67的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征
(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号67Glu Phe Cys Leu Pro Leu Leu Gly Arg Lys Thr Met Cys Gly Asp15 10 15(68)序列鉴别号为68的信息(i)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型重组蛋白(iii)假设的是(v)片段类型内源的(vii)直接来源(A)文库噬菌体中的重组肽(B)克隆噬菌体的(ix)进一步特征(A)名称多肽(B)鉴别方法采用特异的抗体选择(xi)序列描述序列鉴别号68Glu Phe Cys Trp Ile His His Leu Leu Lys Val Val Cys Gly ASp15 10 1
权利要求
1.免疫原或诊断试剂的制备方法，该免疫原或诊断试剂模仿对某种疾病特异的抗原或病原生物体，其特征基本体现于下列实施中—鉴定至少一个同对某疾病特异的抗原或病原生物体反应的抗体；—构建噬菌体文库，该文库表达衣壳表面的衣壳寡肽，该文库通过随机寡核苷酸插入序列表达，这种插入序列可用基因操作技术引入编码哓菌体衣壳蛋白质的基因中；—选择在衣壳表面表达抗原寡肽的噬菌体，该寡肽可用所述的抗体识别；可任选地用第一个病原血清选择，随后用第二个不同的病原血清筛选，再后用健康个体的血清组进行反筛选；—可任选地使用所选噬菌体和/或其片段和/或它们的衍生物，来配成对特异病原生物，或一般疾病的试剂盒，这些疾病包括已知或未知病因和/或病原的免疫疾病，该疾病是典型的所谓自身免疫疾病；—可任选地使用所选噬菌和/或其片段和/或它们的衍生物，来配成用于所述抗原诱导疾病治疗中抗原一抗体反应的拮抗物；—可任选地使用所选噬菌体和/或其片段和/或它们的衍生物，来诱导对化合物和/或天然或合成制备物产生过敏性和/或变态反应现象的耐受；—可任选地采用所选噬菌体和/或其片段和/或它们的衍生物，来免疫生物体；并且—可任选地确认免疫生物体血清中抗体的存在，该抗体识别对某疾病特异的上述抗原或生物体。
2.依据权利要求1，免疫原或诊断试剂的制备方法，该免疫原或诊断试剂模仿对某疾病特异的抗原或病原生物体，其中，在对所述病原物特异的所述抗体是保护性的或中和性的时，用于所述免疫的材料被用来制成抗所述特异病原物的疫苗。
3.依据权利要求1或2的方法，其中的抗体是包含单克隆抗体，多克隆抗体及血清中含有的抗体中选出。
4.依据权利要求3的方法，其中的抗体是在血清中含有的抗体。
5.依据权利要求1至4，免疫原或诊断试剂的制备方法，该免疫原或诊断试剂模仿对某疾病特异的抗原或病原生物体，其中，用丝状噬菌体构建噬休文库，这些噬菌体是从M13，F1，Fd和其衍生物中选出。
6.依据以上的任一权利要求，免疫原或诊断试剂的制备方法，该免疫原或诊断试剂模仿对某疾病特异的抗原或病原生物体，其中，采用随机寡核苷酸序列插入子，编码噬菌体及衣壳的基因是编码噬体衣壳蛋白VIII的基因。
7.依据权利要求1至5，免疫原或诊断试剂的制备方法，该免疫原或诊断试剂模似对某疾病特异的抗原或病原生物体，其中，用随机寡核苷酸序列插入子，编码噬菌体衣壳的基因是噬菌体衣壳中编码蛋白III的基因。
8.依据以上任一权利要求，免疫原或诊断试剂的制备方法，该免疫原或诊断试剂模仿对某疾病特异的抗原或病原生物体，其中病原物从下列组中选出人类乙肝病毒表面抗原，人类丙肝病毒表面抗原，以及和自动免疫疾病，例如糖尿病，病源上相关的抗原。
9.依据权利要求8，免疫原或诊断试剂的制备方法，该免疫原或诊断试剂模仿对某疾病特异的抗原或病原生物体，其中，对病原物有保护或中和活性的抗体，包含在用人类乙肝病毒表面抗原(HBSAg)免疫的个体血清中，或包含在用人类丙肝病毒感染个体的血清中。
10.依据以上任一权利要求，免疫原或诊断试剂的制备方法，该免疫原或诊断试剂模仿对某疾病特异的抗原或病原生物体，其中，被所用抗体识别的抗原寡肽，来自随机寡核苷酸序列插入子的表达，并使用质粒PC89作为载体。
11.依据以上任一权利要求，免疫原或诊断试剂的制备方法，该免疫原或诊断试剂模仿对某疾病特异的抗原或病原生物体，其中，为了从限制性内切酶EcoRI(GAATTC)认别位点到BamHI限制性内切酶识别位点(GGATCC)，构建包含在它们衣壳中，蛋白VIII中，或蛋白III中的丝状噬菌体文库，氨基酸序列从含以下序列中选择，即序列鉴定号分别为1、2、3、7、9至68的序列。
12.依据权利要求1至11，该噬菌体具有以下特征它们在衣壳表面上表达抗原寡肽；它们在免疫原或诊断试剂的制备过程中是可得到的，该免疫原或诊断试剂模仿对某疾病特异的抗原或病源生物体。
13.依据权利要求1至11，抗特异病原生的疫苗具有的特征是，它们用该方法是可以得到的。
14.依据权利要求1至11，被修饰的PC89质粒具有的特征是，它们在该方法中是可使用的，并且它们包含下列序列中的部分或全部序列，它些序列是从序列鉴定号分别为4，5，6，8的序列中的选取的核苷酸序列。
全文摘要
制备模拟对某种疾病特异的抗原或病原生物体的免疫原或诊断试剂的方法，主要通过下列操作过程实施识别至少一种与对疾病特异的抗原或病原生物体反应的抗体；构建表达衣壳表面寡肽的噬菌体文库；该寡肽是用基因操作技术在编码噬菌体衣壳蛋白的基因中引入随机序列寡核苷酸插入于表达的(例如，使用针对此发明的改建质粒，基因图谱所示如图)；通过所述的抗体，筛选被识别的在衣壳表面表达抗原寡肽的噬菌体，选择性地使用筛选的噬菌体和/或其片段，和/或其衍生物，以制成针对特异病原物，或一般对疾病的诊断试剂盒，这些疾病包括典型地所谓自身免疫病的免疫疾患，已知或未知其病因和/或病原；选择性地应用筛选的噬菌体和/或其片段和/或其衍生物，以配制成为治疗所述抗原引起的疾病的抗原-抗体反应的拮抗剂；选择性地应用筛选的噬菌体和/或其片段，和/或其衍生物，以诱导对过敏性和/或对化合物和/或天然或合成制品发生的变态反应现象产生耐受；通过筛选的噬菌体和/或其片段，和/或其衍生物对生物体选择性免疫；在免疫的生物体血清中选择性地确认识别上述对疾病特异的抗原或生物体的抗体的存在。
文档编号C09K8/38GK1122613SQ94192060
公开日1996年5月15日 申请日期1994年5月5日 优先权日1993年5月11日
发明者F·费里斯, A·鲁泽郜, A·尼考司, P·默那西, R·考特塞 申请人:布·安格莱荻公司分子生物学研究所