本发明涉及血液净化领域，具体涉及碳化树脂DNA免疫吸附剂的制备方法。
背景技术：
系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,以下简称SLE)是一种常见的累及多系统多器官的自身免疫性疾病。由于患者机体免疫调节障碍及自身免疫耐受状态被打破，产生多种针对自身组织的抗体，导致组织和器官的损伤，这些抗体主要是抗Sm抗体、抗核抗体以及抗DNA抗体。其中抗DNA抗体可分为抗单链DNA抗体(抗ss-DNA抗体)和抗双链DNA抗体(抗ds-DNA抗体)。
根据国内外临床及基础研究表明，抗ds-DNA抗体的滴度与疾病严重程度及活动性呈正相关。最近几年，激素及免疫抑制剂的应用使SLE患者的愈后效果得到明显改善，但依旧存在很多患者药物疗效不显著的现象，过度的免疫抑制治疗所引起的感染是引起SLE患者死亡的主要原因。另外，多方面研究证实，抗双链DNA抗体(抗ds-DNA抗体)与DNA结合成为免疫复合物在肾小球基底膜沉积，或ds-DNA抗体直接作用于肾小球抗原，从而造成SLE患者的肾损伤。
使用DNA免疫吸附(IA)对患者进行血液灌流，是近二、三十年发展起来的新型疗法。Jones,Frank R(EP0272792A1,1987)对这种方法作了详细说明。DNA免疫吸附剂的吸附作用是依靠DNA对致病性抗ds-DNA抗体的特异识别作用，清除患者血液中的致病物质，缓解病情，改善患者的免疫功能，从而逐渐恢复健康。
美国的TermanDS等人(Lancet,1979,2(8147):824-7)首次使用活性炭为载体材料，采用火棉胶包膜固定DNA，得到DNA免疫吸附剂用于血液灌流治疗一名重度SLE患者，使患者生命延长，从此开辟了DNA吸附剂治疗SLE的先河。使用火棉胶包膜，使DNA免疫吸附剂的安全有效性得到了保证，但吸附率仅为50％左右。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的缺陷，提供一种吸附性能更好的DNA免疫吸附剂。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：DNA免疫吸附剂，包括碳化树脂载体以及交联P(HEMA-b-GMA)膜层，DNA通过物理包埋作用以及与GMA的环氧基团发生开环反应而固载于碳化树脂表面。
P(HEMA-b-GMA)化学名称为聚(甲基丙烯酸羟乙酯-b-甲基丙烯酸缩水甘油酯)，交联P(HEMA-b-GMA)中的GMA可以和DNA分子发生开环反应将DNA化学固载在膜层上，可防止DNA脱落，提高吸附剂的吸附性能。
本发明要解决的另一技术问题是提供一种制备DNA免疫吸附剂的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：DNA免疫吸附剂的制备方法，将碳化树脂载体与包膜溶液混合，然后搅拌、过滤、干燥、冷却，得到DNA免疫吸附剂；其中，包膜溶液与碳化树脂的体积比为(3-5)：1；包膜溶液中含有DNA和交联P(HEMA-b-GMA)。
包膜溶液中含有DNA和交联P(HEMA-b-GMA)。在包膜后的后处理过程中，DNA会与交联P(HEMA-b-GMA)侧链中的GMA发生开环反应，使DNA通过化学作用固载在膜层上，可防止DNA脱落，有效提高吸附剂的吸附性能。另外，P(HEMA-b-GMA)中的GMA与HEMA中的羟基可发生开环交联反应，从而降低P(HEMA-b-GMA)的溶解性能，增强膜的稳定性，进而增加DNA分子在膜层内部的物理包埋作用。优选的，包膜溶液中含有DNA的浓度为0.17-0.4mg/ml,P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.4％-0.8％。
较好的方案为交联P(HEMA-b-GMA)中GMA的含量范围为1％-5％。当GMA在聚合物中的含量在1％-5％时，形成的P(HEMA-b-GMA)/DNA膜层溶胀性能不明显，部分DNA与GMA发生化学键合作用，DNA几乎没有脱落，吸附剂的吸附率均可达到75％以上，吸附性能好。
较好的方案为所述包膜溶液通过以下方法制得：将DNA原液与P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液按1：(4-5)的体积比混合，然后搅拌或振荡至DNA完全溶解，得到所述包膜溶液，DNA原液中DNA的浓度为1-2mg/ml，P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％-1.0％。
还好的方案是干燥温度为70℃-85℃，干燥时间为1.5-3小时。
GMA的开环反应需要在加热条件下进行，但DNA在加热条件下会发生变性导致DNA双链双螺旋解开，DNA能耐受的最高温度为85℃，故优选的干燥温度为70℃-85℃，干燥1.5-3小时。更优选的，干燥时间为2小时。
为解决上述技术问题，本发明提供的另一技术方案为DNA免疫吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将DNA原液与P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液按1：(4-5)的体积比混合，搅拌或振荡至DNA完全溶解，得到包膜溶液；
步骤二：量取一定体积的干燥碳化树脂，倒入所述包膜溶液中，搅拌、过滤、干燥、冷却，得到所述DNA免疫吸附剂；
其中，
DNA原液中DNA的浓度为1-2mg/ml，P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％-1.0％；
包膜溶液与碳化树脂的体积比为(3-5)：1。
包膜溶液中含有DNA和交联P(HEMA-b-GMA)。在包膜后的后处理过程中，DNA会与P(HEMA-b-GMA)侧链中的GMA发生开环反应，使DNA通过化学作用固载在膜层上，可防止DNA脱落，有效提高吸附剂的吸附性能。另外，P(HEMA-b-GMA)中的GMA与HEMA中的羟基可发生开环交联反应，从而降低P(HEMA-b-GMA)的溶解性能，增强膜的稳定性，进而增加DNA分子在膜层内部的物理包埋作用。
较好的方案为交联P(HEMA-b-GMA)中GMA的含量范围为1％-5％。当GMA在聚合物中的含量在1％-5％时，形成的P(HEMA-b-GMA)/DNA膜层溶胀性能不明显，部分DNA与GMA发生化学键合作用，DNA几乎没有脱落，吸附剂的吸附率均可达到75％以上，吸附性能好。
还好的方案是干燥温度为70℃-85℃，干燥时间为1.5-3小时。
GMA的开环反应需要在加热条件下进行，但DNA在加热条件下会发生变性导致DNA双链双螺旋解开，由于DNA能耐受的最高温度为85℃，故优选的干燥温度为70℃-85℃，干燥1.5-3小时。更优选的，干燥时间为2小时。
本发明DNA免疫吸附剂的载体为碳化树脂，但对碳化树脂的选择没有严格的限制，可以通过商业途径购买，可以通过任何公知的方法制备，亦可以通过以下方法制得：
以苯乙烯和二乙烯苯为单体，二乙烯苯占混合单体总质量的0.5％，以三倍于单体(重量比)的甲苯为致孔剂，以过氧化苯甲酰为引发剂，用量为混合单体总质量的1％，以1％明胶水溶液为分散介质，进行悬浮聚合，在80℃下反应5小时，获得大孔树脂；
将上述制备的树脂放入电阻炉中，在惰性气体保护下，在300℃的温度下烧灼10小时，然后升温至800℃，即获得碳化树脂。
本发明对DNA原液亦没有严格的要求，可通过公知技术手段制备，如通过以下的方法制备：
将高纯度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/L Tris-HCL(pH＝7.9)缓冲溶液中，配制DNA浓度为1-2mg/ml的DNA原液，备用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为0.5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为2mg/ml的DNA原液10ml加入到50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即制得均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min，过滤后在70℃下烘干2小时，然后冷却，即得DNA免疫吸附剂。
实施例2制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为1.0％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为2mg/ml的DNA原液10ml，加入到50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在70℃下烘干1.5小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例3制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为2.5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为2mg/ml的DNA原液10ml，加入到50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在70℃下烘干2小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例4制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为2mg/ml的DNA原液10ml，加入到40ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在70℃下烘干3小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例5制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为7.5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为2mg/ml的DNA原液10ml，加入到50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在70℃下烘干2小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例6制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液溶液，备用。
取浓度为1.5mg/ml的DNA原液10ml，加入到50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为187.5ml的包膜溶液中,搅拌10min过滤后在70℃下烘干2小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例7制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为1mg/ml的DNA原液10ml，加入到45ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为250ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在70℃下烘干3小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例8制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.25％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为2mg/ml的DNA原液10ml，加入50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在70℃下烘干2小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例9制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.75％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为1mg/ml的DNA原液10ml，加入40ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在70℃下烘干2小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例10制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为1％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为1mg/ml的DNA原液10ml，加入到50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在70℃下烘干2.5小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例11制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为1.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为1mg/ml的DNA原液10ml，加入到50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在70℃下烘干2小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例12制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为1mg/ml的DNA原液10ml，加入到50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在60℃下烘干2小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例13制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为1mg/ml的DNA原液10ml，加入到50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在75℃下烘干1.5小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例14制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为1mg/ml的DNA原液10ml，加入到50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在80℃下烘干1.5小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例15制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为1mg/ml的DNA原液10ml，加入到50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中，搅拌或振荡至DNA完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在85℃下烘干2小时后冷却，即为包膜吸附剂。
实施例16制备DNA免疫吸附剂
步骤一 均相DNA包膜溶液的配制
将GMA含量为5％的交联P(HEMA-b-GMA)溶于无水乙醇中，配制交联P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.5％的P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，备用。
取浓度为1mg/ml的DNA原液10ml，加入50ml P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液，搅拌或振荡至完全溶解，即为均相DNA包膜溶液。
步骤二 吸附剂包膜
量取50ml干燥碳化树脂，倒入到体积为150ml的包膜溶液中，搅拌10min过滤后在90℃下烘干2小时后冷却，即为包膜吸附剂。
性能测试：
取实施例1至实施例16制备的DNA免疫吸附剂样品各2ml，分别加入至20ml SLE患者血浆中，于37℃下震荡吸附2小时，取吸附前后的SLE患者血浆检测抗ds-DNA抗体浓度。检测方法为酶联免疫吸附法，试剂盒为上海科新生产，仪器为深圳爱康Uranus AE120。
DNA免疫吸附剂样品制备方式汇总如下表1所示，性能检测结果如下表2所示：
表1 DNA免疫吸附剂样品制备方式汇总表
表2 吸附性能检测结果
根据表2的数据，我们可以得出：
(1)从实施例1-16的结果来看，本发明的DNA免疫吸附剂的吸附率均在65％以上。
(2)从实施例1-5的结果来看，当GMA在聚合物中的含量在1％-5％时，DNA免疫吸附剂的吸附性能最好，均在75％以上。这是因为形成的P(HEMA-b-GMA)/DNA膜层溶胀性能不明显，部分DNA与GMA发生化学键合作用，DNA几乎没有脱落。
(3)对比实施例4、6和7，包膜溶液与碳化树脂体积间优选的比例为(3-5)：1。当包膜溶液与碳化树脂比例较低时，吸附剂的吸附性能较低，随着包膜溶液的增加，吸附剂的吸附性能有一定增加，当体积比达到5时，吸附剂的吸附性能已能达到较高水平。
对比实施例4和8-11实施例的结果可知，在P(HEMA-b-GMA)乙醇溶液中P(HEMA-b-GMA)的质量浓度为0.25％时吸附剂的吸附性能较低(72.5％)，随着P(HEMA-b-GMA)质量浓度的增加吸附剂的吸附性能有很大程度提升均达到了80％以上，当P(HEMA-b-GMA)质量浓度为1.5％时吸附剂的吸附性能再次降低(74.9％)，因此最优的P(HEMA-b-GMA)质量浓度为0.5-1％。
(4)对比实施例4和12-16实施例的结果可知，干燥温度对DNA免疫吸附剂的性能有一定影响，在温度为60℃时吸附剂的性能仅为73.1％，随着温度的提高吸附剂的性能有很大程度的提升，在温度为90℃时，吸附剂的性能再次下降，这与高温导致DNA变性有关，因此最优的DNA接枝温度为70-85℃。
总之，本发明提供了DNA固载在碳化树脂表面形成对ds-DNA有特异性吸附的吸附剂及其制备方法。该免疫吸附剂聚合物膜层通过物理包埋和化学键合作用将DNA固载在碳化树脂表面，提高了DNA的固载量，有效防止了DNA的脱落，从而大幅度提高了该免疫吸附剂的吸附性能。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。