专利名称：一种动物性食品中氯霉素酶免疫检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
一种动物性食品中氯霉素(chlora mphenicol，CAP)酶免疫检测试剂盒及其检测方法，属于酶免疫分析技术领域。
背景技术：
氯霉素是一种广谱抗生素，已广泛用于动物各种传染性疾病的治疗，但是氯霉素有严重的副作用，它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血症和粒状白细胞缺乏症等疾病，因此动物性食品中的氯霉素残留对人类的健康构成了潜在的危害，美国和欧共体对氯霉素使用于动物和动物性食品中氯霉素残留量有严格的限止。我国尚未制定氯霉素残留量的食品卫生标准。由于氯霉素抑菌广谱，效果好和价廉，在我国用它治疗家畜、禽类疾病也较普遍，为了保障我国人民的健康和扩大动物性食品的贸易往来，加强对动物性食品中氯霉素残留的检测是非常必要的。
测定氯霉素残留的方法，主要有微生物学方法，色谱法，放射免疫法，酶免疫分析法等。国内外文献已有许多报导(见“中国食品卫生杂志”2002年第14卷第2期P44-47)对检测方法的要求是操作简便，精确度高，特异性强。国外氯霉素酶免疫检测试剂盒有若干种推向市场已见文献报导，但国内尚未见有此类试剂盒面市的报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种结构简单，操作方便，价格便宜的氯霉素酶免疫检测试剂盒。同时提供一种样品前处理简单，提取后就可直接测定一次可测定大量样本，简便、快速、灵敏、准确、廉价的检测氯霉素的方法。
本发明试剂盒主要由盒体(1)、酶标板(2)、A试剂瓶(标准氯霉素试剂)(3)、B试剂瓶(稀释液)(4)、C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5)、D试剂瓶(酶标抗原稀释液)(6)、E试剂瓶(含吐温-20的磷酸盐固体)(7)、F试剂瓶(邻苯二胺OPD试剂)(8)、G试剂瓶(醋酸钠一柠檬酸缓冲液)(9)、H试剂瓶(H2O2溶液)(10)、I试剂瓶(硫酸溶液)(11)、海绵托架(12)所组成，海绵托架(12)上制有孔和凹槽，上述A、B、C、D、E、F、G、H、I试剂瓶安放在海绵托架的孔和凹槽内。海绵托架(12)及酶标板(2)均安放在盒体(1)内。酶标板(2)有塑料支架和各自分开的带孔穴的塑料条组成。
本发明原理是采用酶免疫吸附(ELISA)竞争法来检测氯霉素(CAP)。
一、特异性抗体(CAP单抗)的制备1、抗原制备，以人工合成的氯霉素——牛血清白蛋白(CAP-BSA)作为免疫抗原。
2、免疫动物采用BALB/C小鼠作为免疫动物，免疫抗原剂量为50～100ng，皮下注射，3～4周后，腹腔注射加强免疫2～4次，取脾细胞。
3、细胞融合将SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞在聚乙烯醇的溶剂中进行细胞融合，在HAT培养液中作选择培养。
4、杂交瘤细胞克隆化采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直至得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。
5、单克隆抗体(McAb)的保存在液氮-20℃冻存，使用时37℃水浴快速解冻。
6、McAb的生产和提纯先小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5ml/只，7-10天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105～106/只，7-10天后采集腹水。经硫酸铵盐析法进行纯化，小瓶分装待用。
二、样品处理1、牛奶样品a.3500转/分离心10分钟去脂。
b.吸取并弃去上层脂肪层。
c.取5ml去脂牛奶加入150μl革瑞氏液I，摇匀后振荡再加入150μl革瑞氏液II，迅速摇匀。
d.3500转/分离心10分钟。
e.移去上清液，再用缓冲液将其1∶1稀释(1份上清液+1份缓冲液)。
f.取50μl用于检测。
2、肉样a.用均质器或捣碎机将去质肉样或肾脏进行均质。
b.取均质后样品5g，加20ml乙腈水溶液(84份乙腈+16份水)提取10分钟。
c.3000转/分离心10分钟。
d.用3ml去离子水稀释3ml上清液，再用4.5ml乙酸乙酯提取。
e.3000转/分离心10分钟。
f.将乙酸乙脂层吹干。
g.用1.5ml缓冲液将残渣溶解，再加入1.5ml正己烷或正庚烷去脂。
h.彻底移去上层的正己烷或正庚烷层。
i.取50μl下层液用于检测。
酶标板有12孔、12条。酶标板上用单克隆CAP抗体包被，每孔50-100μl，37℃，温育2hr，用10g/L明胶封闭。包被后的每条酶标板用铝箔袋封好，置2-8℃冷芷保存。
用本试剂盒检测氯霉素(CAP)的方法，是将单克隆CAP抗体包被在酶标板(2)上，酶标板(2)放在4℃左右冰箱过夜。再进行试剂及酶底物混合液的配制。在A试剂(标准CAP)中加20-30mlB试剂混匀，在C试剂(酶标抗原)中加入10-20mlD试剂(酶标抗原稀释液)，溶解、混匀，在2-8℃下保存，E试剂(含吐温20的PBS固体)中加入去离子水配制成E洗涤液。先取出酶标板，用E洗涤液洗涤2-4次，洗液不得溢出，每次间隔3-4分钟，洗后用吸水纸拍干。然后加反应物竞争吸附，在酶标板小孔中加入配制好的试剂及样品稀释液进行竞争免疫反应，在1-3标准对照孔中仅加或不加酶标抗原，加或不加标准CAP试剂，而在4-12样品测定孔中，先后加入待测抗原和酶标抗原，在37-38℃温育1-1.5小时。再用E洗涤液洗板4-6次，每次间隔3-4分钟，拍干，再加入酶底物混合液，混匀，在37-38℃避光作用15-20分钟，显色，最后加入I终止液(硫酸溶液)中止反应，测定A490nm值。
C试剂(酶标抗原试剂)为氯霉素-辣根过氧化物酶(CAP-HRP)，或酶标羊抗兔抗体(SABC上海)，或酶标猪抗兔抗体(Sigma，USA)，B试剂为PBST溶液(含10g/L BSA，0.01mol/L，PH7.4)，D试剂瓶(酶标抗原稀释液)为PBS溶液(含1％明胶，0.01mol/L，PH7.4)。
酶底物混合液，采用G试剂(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)和F试剂(邻苯二胺)按G∶F＝7-9∶3-1稀释和每ml此稀释液加14μl H试剂(H2O2)混合配制而成，临用前半小时内配制。
本发明的优点是样品前处理简单，利用本试剂盒检测CAP残留，是简便、快速、灵敏、准确、廉价的检测方法。最低检测限达50ng/kg。
图1 试剂盒的直观示意2 酶标板的直观示意中盒体(1)、酶标板(2)，A试剂瓶(标准CAP试剂)(3)，B试剂瓶(稀释液)(4)，C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5)，D试剂瓶(酶标抗原稀释液)(6)，E试剂瓶(含吐温-20的磷酸盐PBS固体)(7)，F试剂瓶(邻苯二胺OPD试剂)(8)，G试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(9)，H试剂瓶(H2O2溶液)(10)，I试剂瓶(硫酸溶液)(11)，海绵托架(12)，试剂盒应放在2-8℃贮存，忌0℃下冻存，有效期为12个月。
具体实施例方式
实施例1采用按照前述方法制备的单克隆CAP抗血清包被在酶标板上，放入4℃冰箱过夜。
1、按照前述方法，进行样品处理。
2、试剂配制。
1)标准CAP试剂CAP加20mlB试剂(稀释液)混匀。
2)酶标抗原试剂C试剂加10mlD试剂(酶标抗原稀释液)溶解、混匀。
3)E洗涤液配制在含0.1％吐温-20(Tween-20)的磷酸盐(PBS)的E试剂中加入200ml蒸馏水配制E洗涤液，用于酶标板洗涤。
4)底物混合液配制根据每次所需用量，用F试剂(邻苯二胺)和G试剂(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)按G∶F＝7-9∶3-1的比例稀释F试剂，再按每ml此稀释液需加入14μl的双氧水H试剂，配制成底物混合液，临用前半小时内配制。
3、将试剂盒平衡至室温。
4、用E洗涤液洗酶标板2次，洗液不得溢出；每次间隔3分钟，放在吸水纸上拍干。
5、加反应物进行反应，按下表所列，依次加入配制好的试剂及待测样品稀释液，1-3号孔为标准对照孔，4-12号孔为样品测定孔，每批测定时，可以每孔置一只待测样品，也可几只孔置同一只待测样品，进行平行测定，也可用另一根酶标板同时检测，其1-12孔扩大均为样品孔，这可视具体待测样品的数目多少而灵活决定。
按上表在4-12样品测定孔中，先后加入待测抗原和酶标抗原，而在1-3标准对照孔中，仅加或不加酶标抗原。
6、反应在37℃温育放置1.5小时。
7、洗涤显色用E洗涤液洗酶标板4次，拍干，每孔加入50μl底物混合液，摇匀，在37°温育15分钟，显色。
8、终止，加入I终止液(硫酸溶液)2mol/L50μl/孔。
9、测定先比较1-3号孔颜色，1号孔最深，2号孔次之，3号孔接近无色，说明标准正确。
目视法比较样品孔与2号孔颜色，若比2号孔颜色浅，则为阳性，反之为阴性。若颜色与2号孔接近。则用酶标仪测A490nm。
权利要求
1.一种氯霉素(CAP)酶免疫检测试剂盒，其特征在于由盒体(1)，酶标板(2)，A试剂瓶(标准CAP试剂)(3)，B试剂瓶(稀释液)(4)，C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5)，D试剂瓶(酶标抗原稀释液)(6)，E试剂瓶(含吐温-20的磷酸盐PBS固体)(7)，F试剂瓶(邻苯二胺OPD试剂)(8)，G试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(9)，H试剂瓶(H2O2溶液)(10)，I试剂瓶(硫酸溶液)(11)，海绵托架(12)所组成，海绵托架(12)内装有上述A、B、C、D、E、F、G、H、I试剂瓶，海绵托架(12)及酶标板(2)均安放在盒体(1)内。
2.按照权利要求1所述的氯霉素(CAP)酶免疫检测试剂盒，其特征在于所述的海绵托架(12)上制有孔和凹槽。
3.按照权利要求1所述的氯霉素(CAP)酶免疫检测试剂盒，其特征在于所述的酶标板(2)有塑料支架和各自分开的带孔穴的塑料条组成。
4.一种用氯霉素(CAP)酶免疫检测试剂盒检测氯霉素的方法，先进行样品处理，其特征在于首先将单克隆CAP抗体包被在酶标板上，酶标板放在4℃冰箱过夜，再进行试剂及酶底物混合液的配制，在A试剂(标准CAP)中加20-30mlB试剂混匀，在C试剂(酶标抗原)中加入10-20ml D试剂，溶解混匀，在2-8℃下保存，用E试剂加入去离子水配制成E洗涤液，用E洗涤液洗酶标板2-4次，洗液不得溢出，每次间隔3-4分钟，洗后用吸水纸拍干，在酶标板小孔中加入配制好的试剂及样品稀释液进行竞争免疫反应，在37-38℃温育1～1.5h，再用E洗涤液洗板4-6次，每次间隔3-4min，拍干，再加入酶底物混合液，混匀，在37-38℃避光作用15-20分钟，显色，最后加入I终止液(硫酸溶液)中止反应，用酶标仪测定A490nm值。
5.按照权利要求4所述的检测氯霉素(CAP)的方法，其特征在于所述的C试剂(酶标抗原试剂)为氯霉素-辣根过氧化物酶(CAP-HRP)或酶标羊抗兔抗体(SABC，上海)或酶标猪抗兔抗体(Sigma，USA)，B试剂(稀释液)为PBST溶液(含10g/L BSA，0.01mol/L，PH7.4)，D试剂(酶标抗原稀释液)为PBS溶液(含1％明胶，0.01mol/L，PH7.4)。
6.按照权利要求4所述的检测氯霉素(CAP)的方法，其特征在于所述的酶底物混合液，采用G试剂(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)和F试剂(邻苯二胺)按G∶F＝7-9∶3-1，和每ml此稀释液加14μl H试剂(H2O2)混合配制而成，临用前半小时内配制。
全文摘要
一种氯霉素(CAP)酶免疫检测试剂盒及其检测方法,属于酶免疫分析技术领域。本发明配制的试剂盒,采取酶免疫吸附(ELISA)竞争法检测CAP,利用CAP和牛血清白蛋白(BSA)偶连物作为CAP抗原免疫小鼠,获得含有CAP抗体的单克隆CAP抗血清,经分离、提纯、稀释后包被在酶标板上,温育、洗涤,加入样品稀释液及酶标抗原,使两者进行反应、洗涤,加酶底物显色。本发明样品前处理简单,是一种简便、快速、灵敏、准确、廉价的检测方法,尤其适用于肉制品的CAP残留检测。
文档编号G01N33/543GK1389729SQ02137940
公开日2003年1月8日 申请日期2002年7月12日 优先权日2002年7月12日
发明者胥传来, 丁宏标, 李相前, 邵蔚蓝, 徐保国, 詹斌 申请人:江南大学