前列腺炎联检试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种前列腺炎联检试剂盒，将诊断前列腺炎所用的具有代表性的七个指标：pH值、白细胞酯酶、卵磷脂小体、柠檬酸、锌、酸性磷酸酶和弹性蛋白酶联合起来在临床上一次性进行检测，根据标本在七个孔内的颜色变化判断该指标正常与否，为前列腺炎的正确诊断提供了有效帮助，避免了因为检测人员的视觉疲劳造成的漏检。同时该试剂盒操作简便，快速准确，无需特殊仪器，更易于在临床上推广。
【专利说明】前列腺炎联检试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种前列腺炎联检试剂盒。
【背景技术】
[0002]前列腺炎是成年男性的常见疾病，困扰着全球接近50%的男性人群。尽管前列腺炎患者一般不会有生命危险，但会严重影响患者的生活质量，同时，其庞大的患者人群和高昂的医疗费用也会给公共卫生事业带来巨大的经济负担。
[0003]目前诊断前列腺炎所用的检测方法都是镜检法，即通过显微镜观察前列腺按摩液中卵磷脂小体、白细胞数量来进行检查，这种方法检测的指标较少，不能完全明确患者炎症的类型和治疗过程中的治疗效果的评价。而且这种镜检方法人为因素对结果造成的影响较大，出现长时间观察显微镜引起的视觉疲劳而造成的漏检等。
[0004]男性生殖道感染时，分叶核粒细胞参与吞噬病原体等抗炎反应，并分泌大量弹性蛋白酶至细胞外，弹性蛋白酶与其它氧化物质(如活性氧、过氧化氢、氢氧根离子等)共同发挥局部抗炎效应。弹性蛋白酶与随后分泌的a 1-蛋白酶抑制剂结合，形成弹性蛋白酶-a 1-蛋白酶抑制剂复合物，该复合物浓度与弹性蛋白酶释放量高度相关，可作为分叶核粒细胞生殖道抗感染活性的检测指标。
[0005]弹性蛋白酶可作为静止型生殖道感染的诊断及愈后监测指标，其可靠性得到了世界卫生组织的认可。它不仅对于筛选由奈瑟双球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、毛滴虫等感染有特异的诊断价值，对白细胞精子症、睾丸鞘膜炎等多种疾病也有较高的特异性。弹性蛋白酶已被作为诊断男性生殖道感染的特异性标志物。 目前对弹性蛋白酶的临床或实验室诊断方法有:(I)免疫细胞化学法；(2) ELISA方法。现有检测方法检测时间长、操作繁琐，且需要特殊仪器，无法满足临床快速、简便的需求。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种可同时检测多种指标的前列腺炎联检试剂盒。
[0007]为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的前列腺炎联检试剂盒，包括标本稀释液、显色液以及用于检测白细胞酯酶、卵磷脂小体、酸性磷酸酶、弹性蛋白酶的检测试剂，其中
检测白细胞酯酶的检测试剂由Tris-HCl缓冲液，糖和5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯溶液配制而成；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.0f 2 mol/L, pH 7.(Tl0.0，所述糖为蔗糖、葡萄糖、海藻糖或乳糖，浓度为3(T60g/L，所述5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯溶液的浓度为0.001?lmol/L ；
检测卵磷脂小体的检测试剂由硼酸盐缓冲液、锌试剂溶液和氯化锌溶液配制而成；所述硼酸盐缓冲液的PH为广10，其中氯化钾:0.1?100g/L，硼酸:0.fl00g/L，氢氧化钠:
0.0fl0g/L ;所述锌试剂溶液中含有0.ri00g/L的5-(2-羧基苯基)-1-(2-羟基-5-磺基苯基)-3-苯基甲单钠盐；所述氯化锌溶液中氯化锌:0.ri00g/L ；
检测酸性磷酸酶的检测试剂由配制的底物液构成；所述的底物液包括以下组分:柠檬酸0.1~75g/L，磷酸苯二钠:0.1~90g/L，4-氨基安替比林:0.1~65g/L，氢氧化钠:0.1~88g/L ；
检测弹性蛋白酶的检测试剂由缓冲液、底物溶液配制而成；所述缓冲液为0.1~1.0M的磷酸盐或者Tris-HCl缓冲液，pH 6.(T9.0，所述底物溶液为地衣红弹性蛋白或刚果红弹性蛋白，浓度0.1~5mg/L。
[0008]所述标本稀释液为质量百分比浓度8.5^9.0%的氯化钠水溶液。 [0009]所述显色液为酸性磷酸酶显色液和弹性蛋白酶显色液，所述酸性磷酸酶显色液中包括以下组分:铁氰化钾0.f 100g/L，碳酸氢钠0.f 100g/L、氢氧化钠0.0ri0g/L ;所述弹性蛋白酶显色液中包括盐酸、乙酸、硝酸或硫酸溶液50-80%。
[0010]为使检测的指标更加全面，更利于病症的准确诊断，它还包括用于检测pH值、柠檬酸和锌的检测试剂；其中
检测PH值的检测试剂由溴百里酚蓝钠盐0.5^100g/L和纯化水配制而成；
检测柠檬酸的检测试剂由硫酸铁铵溶液和磺基水杨酸溶液按1:15的比例配制而成；其中硫酸铁铵溶液为0.0Of lmol/L，磺基水杨酸溶液为0.0Of lmol/L ；
检测锌的检测试剂由硼酸盐缓冲液和锌试剂溶液按10:1的比例配制而成；所述硼酸盐缓冲液包括以下组份:氯化钾0.fl00g/L，硼酸0.fl00g/L，氢氧化钠0.0fl0g/L，pH值7.0-10.0 ;所述锌试剂溶液中含有0.ri00g/L的5- (2-羧基苯基)-1-(2-羟基-5-磺基苯基)-3-苯基甲单钠盐。
[0011]所述检测试剂可以固化在棉浆纸、滤纸、玻璃纤维或塑料的固相载体上，也可以直接配制成液体使用。
[0012]为便于运输可检测，该试剂盒还包括开设有多个反应孔的检测卡体，所述检测试剂固化在棉浆纸、滤纸、玻璃纤维或塑料等的固相载体上后制作成试剂垫分别置于所述反应孔内。
[0013]本发明的优点在于将诊断前列腺炎所用的具有代表性的七个指标联合起来在临床上一次性进行检测，根据标本在七个孔内的颜色变化即可判断该指标正常与否，为前列腺炎的正确诊断提供了有效帮助，避免了因为检测人员的视觉疲劳造成的漏检。同时该试剂盒操作简便，快速准确，无需特殊仪器，更易于在临床上推广。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例来详细说明本发明试剂盒的制备方法和使用方法。
[0015]实施例1:
本发明所述的前列腺炎联检试剂盒，包括标本稀释液、显色液以及设置有七个反应孔的检测卡体，在七个反应孔内分别设置有用于检测PH值、白细胞酯酶、卵磷脂小体、柠檬酸、锌、酸性磷酸酶和弹性蛋白酶的固体试剂，该固体试剂为含有检测试剂的由棉浆纸、滤纸、玻璃纤维或塑料等载体制作的试剂垫。七个反应孔中的试剂垫的具体制作方法如下:
1、检测pH值的固体试剂垫:将0.5~100g/L溴百里酚蓝钠盐和20倍的纯化水配制的溶液取10 μ L涂覆于直径5.5mm的载体上，除湿干燥(温度18~25°C，湿度≤30%)而成；2、检测白细胞酯酶的固体试剂垫:由Tris-HCl缓冲液，糖和5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯溶液配制后涂覆于载体上，除湿干燥而成；其中Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01~2 mol/L, pH 7.0-10.0 ;糖为蔗糖、葡萄糖、海藻糖或乳糖，浓度为3(T60g/L;5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯溶液的浓度为0.00rimol/L ；
先制备Tris-HCl缓冲液,再加入海藻糖(或其他糖类)，最后加入5-溴-4-氯-3- Π引哚乙酸酯溶液，得到液体试剂，取10 μ L液体试剂置于直径5.5mm的载体上，除湿干燥(温度18~25°C，湿度≤30%)即可；
3、检测卵磷脂小体的固体试剂垫:由硼酸盐缓冲液、锌试剂溶液和氯化锌溶液反应后涂覆于载体上，经真空冷冻干燥而成；硼酸盐缓冲液的PH为7-10，其中氯化钾:0.riOOg/L，硼酸:0.l~100g/L，氢氧化钠:0.0fl0g/L ;锌试剂溶液中含有0.1~100g/L的5-(2-羧基苯基)-1-(2-羟基-5-磺基苯基)-3-苯基甲单钠盐；氯化锌溶液中氯化锌含量为
0.ri00g/L ； 首先将硼酸盐缓冲液和锌试剂溶液按1:1比例进行反应，得到的产物记为A，取氯化锌溶液500 μ L，加入20 μ L生理盐水，得到的溶液记为B，将A和B按1:5的比例进行反应，得到的产物记为C，取10 μ L的产物C置于直径5.5mm的载体上，经真空冷冻干燥即可；
4、检测柠檬酸的固体试剂垫:由硫酸铁铵溶液(0.00rimol/L)和磺基水杨酸溶液(0.001~lmol/L)按1:15的比例配制后取10 μ L液体试剂置于直径5.5mm的载体上，除湿干燥(温度18~25°C，湿度≤30%)即可；
5、检测锌的固体试剂垫:由硼酸盐缓冲液和锌试剂溶液按10:1的比例反应、稀释后涂覆于载体上，经真空冷冻干燥而成；其中硼酸盐缓冲液包括以下组份:氯化钾0.rioog/L，硼酸0.1~100g/L，氢氧化钠0.01~10g/L，pH值7.0-10.0 ;锌试剂溶液中含有0.1~100g/L的5- (2-羧基苯基)-1-(2-羟基-5-磺基苯基)-3-苯基甲单钠盐；
首先制备硼酸盐缓冲液，将硼酸盐缓冲液和锌试剂溶液按10:1的比例反应后，再加入6倍的硼酸盐缓冲液进行稀释，然后取稀释后的液体试剂10 μ L置于直径5.5mm的载体上，经真空冷冻干燥即可；
6、检测酸性磷酸酶的固体试剂垫:将包含柠檬酸0.r75g/L,磷酸苯二钠:0.1~90δ/L，4-氨基安替比林:0.l~65g/L，氢氧化钠:0.l~88g/L组分的底物液倍比稀释2次后取得的稀释液置于直径5.5mm的载体上，除湿干燥(温度18~25°C，湿度≤30%)即可；
7、检测弹性蛋白酶的固体试剂垫:由缓冲液、底物溶液配制后涂覆于载体上，除湿干燥而成；其中缓冲液为0.1~1.0M的磷酸盐或者Tris-HCl缓冲液，pH 6.(T9.0 ;底物溶液为地衣红弹性蛋白或刚果红弹性蛋白，浓度0.r5mg/L0
[0016]本发明试剂盒所用的标本稀释液为质量百分比浓度8.5^9.0%的氯化钠水溶液，即生理盐水。
[0017]本发明试剂盒所用的酸性磷酸酶显色液中包括以下组分:铁氰化钾0.ri00g/L,碳酸氢钠0.1~100g/L、氢氧化钠0.0TlOg/Lo
[0018]本发明试剂盒的检测方法如下:
(I )、标本预处理:将EPS (前列腺按摩液)使用标本稀释液稀释(1:4)，记为A，再用生理盐水稀释(1:20)，记为B。
[0019](2)、加样:第1、2、3、4、5、7孔中加六液，25口 I/孔；第6孔(酸性磷酸酶检测孔)中加B液25 u 10
[0020](3)、温育:37°C，15min。
[0021](4)、加显色液:在第6孔(酸性磷酸酶检测孔)中加酸性磷酸酶显色液25 yl。
[0022](5)、记录结果:观察颜色变化，和试剂盒提供的比色卡进行比对，判读结果:
第I ?L，pH指标:阴性显黄色，弱阳性显绿色，强阳性显蓝色。
[0023]第2孔，白细胞指标:阴性显无色，弱阳性显绿色，强阳性显蓝色；
第3孔，卵磷脂小体指标:阴性显粉红色，阳性显蓝色；
第4孔，柠檬酸指标:阴性显米黄色，阳性显橙红色；
第5孔，锌指标:阴性显蓝色，阳性显桔红色；
第6孔，酸性磷酸酶指标:阴性显红色，弱阳性显橙红色，强阳性显黄色；
第7孔，弹性蛋白酶指标: 阴性显白色，弱阳性显浅红色，强阳性显深红色。
[0024]实施例2:
本发明所述的前列腺炎联检试剂盒，包括标本稀释液、显色液以及设置有七个反应孔的检测卡体，在七个反应孔内分别设置有用于检测PH值、白细胞酯酶、卵磷脂小体、柠檬酸、锌、酸性磷酸酶和弹性蛋白酶的固体试剂，该固体试剂为含有检测试剂的由棉浆纸、滤纸、玻璃纤维或塑料等载体制作的试剂垫。七个反应孔中的试剂垫的具体制作方法如下:
1、检测pH值的固体试剂垫:将0.5~100g/L溴百里酚蓝钠盐和20倍的纯化水配制的溶液取10 ii L涂覆于直径5.5mm的载体上，除湿干燥(温度18~25°C，湿度≤30%)而成；
2、检测白细胞酯酶的固体试剂垫:由Tris-HCl缓冲液，糖和5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯溶液配制后涂覆于载体上，除湿干燥而成；其中Tris-HCl缓冲液的浓度为0.0f 2 mol/L, pH 7.(Tl0.0 ;糖为蔗糖、葡萄糖、海藻糖或乳糖，浓度为3(T60g/L;5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯溶液的浓度为0.00rimol/L ；
先制备Tris-HCl缓冲液,再加入海藻糖(或其他糖类)，最后加入5-溴-4-氯-3- H引哚乙酸酯溶液，得到液体试剂，取10 y L液体试剂置于直径5.5mm的载体上，除湿干燥(温度18~25°C，湿度≤30%)即可；
3、检测卵磷脂小体的固体试剂垫:由硼酸盐缓冲液、锌试剂溶液和氯化锌溶液反应后涂覆于载体上，经真空冷冻干燥而成；硼酸盐缓冲液的PH为7-10，其中氯化钾:0.riOOg/L，硼酸:0.l~100g/L，氢氧化钠:0.0广1(^/1;锌试剂溶液中含有0.ri00g/L的5-(2-羧基苯基)-1-(2-羟基-5-磺基苯基)-3-苯基甲单钠盐；氯化锌溶液中氯化锌含量为
0.ri00g/L ；
首先将硼酸盐缓冲液和锌试剂溶液按1:1比例进行反应，得到的产物记为A，取氯化锌溶液500 u L，加入20 ii L生理盐水，得到的溶液记为B，将A和B按1:5的比例进行反应，得到的产物记为C，取10 y L的产物C置于直径5.5mm的载体上，经真空冷冻干燥即可；
4、检测柠檬酸的固体试剂垫:由硫酸铁铵溶液(0.00rimol/L)和磺基水杨酸溶液(0.001~lmol/L)按1:15的比例配制后取10 ii L液体试剂置于直径5.5mm的载体上，除湿干燥(温度18~25°C，湿度≤30%)即可；
5、检测锌的固体试剂垫:由硼酸盐缓冲液和锌试剂溶液按10:1的比例反应、稀释后涂覆于载体上，经真空冷冻干燥而成；其中硼酸盐缓冲液包括以下组份:氯化钾0.riOOg/L，硼酸0.1~100g/L，氢氧化钠0.01~10g/L，pH值7.0~10.0 ;锌试剂溶液中含有0.1~100g/L的5- (2-羧基苯基)-1-(2-羟基-5-磺基苯基)-3-苯基甲单钠盐；
首先制备硼酸盐缓冲液，将硼酸盐缓冲液和锌试剂溶液按10:1的比例反应后，再加入6倍的硼酸盐缓冲液进行稀释，然后取稀释后的液体试剂10 μ L置于直径5.5mm的载体上，经真空冷冻干燥即可；
6、检测酸性磷酸酶的固体试剂垫:将包含柠檬酸0.r75g/L,磷酸苯二钠:0.1~90δ/L，4-氨基安替比林:0.l~65g/L，氢氧化钠:0.l~88g/L组分的底物液倍比稀释2次后取得的稀释液置于直径5.5mm的载体上，除湿干燥(温度18~25°C，湿度≤30%)即可；
7、检测弹性蛋白酶的固体试剂垫:由缓冲液、底物溶液配制后涂覆于载体上，除湿干燥而成；其中缓冲液为0.1~1.0M的磷酸盐或者Tris-HCl缓冲液，pH 6.(T9.0 ;底物溶液为地衣红弹性蛋白或刚果红弹性蛋白，浓度0.r5mg/L0
[0025]本发明试剂盒所用的标本稀释液为质量百分比浓度8.5^9.0%的氯化钠水溶液，即生理盐水。
[0026]本发明试剂盒所用的酸性磷酸酶显色液中包括以下组分:铁氰化钾0.ri00g/L,碳酸氢钠0.1~100g/L、氢氧化钠0.0TlOg/Lo
[0027]本发明试剂盒所用的弹性蛋白酶显色液中包括盐酸、乙酸、硝酸或硫酸溶液50~80% (V/V)。
[0028]本发明试剂盒的检测方法如下:
(I )、标本预处理:将EPS (前列腺按摩液)使用标本稀释液稀释(1:4)，记为A，再用生理盐水稀释(1:20)，记为B。
[0029](2)、加样:第1、2、3、4、5、7孔中加六液，25口 I/孔；第6孔(酸性磷酸酶检测孔)中加B液25 μ 1，第7孔再加弹性蛋白酶显色液25 μ I。
[0030](3)、温育:37°C，15min。
[0031](4)、加显色液:在第6孔(酸性磷酸酶检测孔)中加酸性磷酸酶显色液25 μ I。
[0032](5)、记录结果:观察颜色变化，和试剂盒提供的比色卡进行比对，判读结果:
第I ?L，pH指标:阴性显黄色，弱阳性显绿色，强阳性显蓝色；
第2孔，白细胞指标:阴性显无色，弱阳性显绿色，强阳性显蓝色；
第3孔，卵磷脂小体指标:阴性显粉红色，阳性显蓝色；
第4孔，柠檬酸指标:阴性显米黄色，阳性显橙红色；
第5孔，锌指标:阴性显蓝色，阳性显桔红色；
第6孔，酸性磷酸酶指标:阴性显红色，弱阳性显橙红色，强阳性显黄色；
第7孔，弹性蛋白酶指标:阴性显白色，弱阳性显浅蓝色，强阳性显深蓝色。
【权利要求】
1.一种前列腺炎联检试剂盒，其特征在于:包括标本稀释液、显色液以及用于检测白细胞酯酶、卵磷脂小体、酸性磷酸酶、弹性蛋白酶的检测试剂，其中 检测白细胞酯酶的检测试剂由TriS-HCl缓冲液，糖和5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯溶液配制而成；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01~2 mol/L, pH 7.(Tl0.0，所述糖为蔗糖、葡萄糖、海藻糖或乳糖，浓度为3(T60g/L，所述5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯溶液的浓度为0.001~lmol/L ； 检测卵磷脂小体的检测试剂由硼酸盐缓冲液、锌试剂溶液和氯化锌溶液配制而成；所述硼酸盐缓冲液的PH为广10，其中氯化钾:0.1~100g/L，硼酸:0.fl00g/L，氢氧化钠:0.0fl0g/L ;所述锌试剂溶液中含有0.ri00g/L的5-(2-羧基苯基)-1-(2-羟基-5-磺基苯基)-3-苯基甲单钠盐；所述氯化锌溶液中氯化锌:0.ri00g/L ； 检测酸性磷酸酶的检测试剂由配制的底物液构成；所述的底物液包括以下组分:柠檬酸0.1~75g/L，磷酸苯二钠:0.1~90g/L，4-氨基安替比林:0.1~65g/L，氢氧化钠:0.1~88g/L ； 检测弹性蛋白酶的检测试剂由缓冲液、底物溶液配制而成；所述缓冲液为0.1~1.0M的磷酸盐或者Tris-HCl缓冲液，pH 6.(T9.0，所述底物溶液为地衣红弹性蛋白或刚果红弹性蛋白，浓度0.1~5mg/L。
2.根据权利要求1所述的前列腺炎联检试剂盒，其特征在于:所述标本稀释液为质量百分比浓度8.5^9.0%的氯化钠水溶液。
3.根据权利要求1所述的前列腺炎联检试剂盒，其特征在于:所述显色液为酸性磷酸酶显色液和弹性蛋白酶显色液，所述酸性磷酸酶显色液中包括以下组分:铁氰化钾 0.f 100g/L，碳酸氢 钠0.f 100g/L、氢氧化钠0.0ri0g/L ;所述弹性蛋白酶显色液中包括盐酸、乙酸、硝酸或硫酸溶液50-80%。
4.根据权利要求1所述的前列腺炎联检试剂盒，其特征在于:它还包括用于检测PH值、柠檬酸和锌的检测试剂；其中 检测PH值的检测试剂由溴百里酚蓝钠盐0.5^100g/L和纯化水配制而成； 检测柠檬酸的检测试剂由硫酸铁铵溶液和磺基水杨酸溶液按1:15的比例配制而成；其中硫酸铁铵溶液为0.0Of lmol/L，磺基水杨酸溶液为0.0Of lmol/L ； 检测锌的检测试剂由硼酸盐缓冲液和锌试剂溶液按10:1的比例配制而成；所述硼酸盐缓冲液包括以下组份:氯化钾0.fl00g/L，硼酸0.fl00g/L，氢氧化钠0.0fl0g/L，pH值7.0-10.0 ;所述锌试剂溶液中含有0.ri00g/L的5- (2-羧基苯基)-1-(2-羟基-5-磺基苯基)-3-苯基甲单钠盐。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的前列腺炎联检试剂盒，其特征在于:所述检测试剂固化在棉浆纸、滤纸、玻璃纤维或塑料的固相载体上。
6.根据权利要求1-4中所述的前列腺炎联检试剂盒，其特征在于:它包括开设有多个反应孔的检测卡体，所述检测试剂固化在棉浆纸、滤纸、玻璃纤维或塑料的固相载体上后制作成试剂垫分别置于所述反应孔内。
【文档编号】G01N33/68GK103743914SQ201410047716
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年2月11日 优先权日:2014年2月11日
【发明者】张中洲, 娄斌, 曹艺甜, 刘功成, 付光宇, 李晓霞, 王胜启, 陆莹 申请人:郑州安图生物工程股份有限公司