呋喃苦参黄连素片的质量检测方法与流程

本发明涉及药品检测技术领域，具体涉及呋喃苦参黄连素片的检测方法。

背景技术：

呋喃苦参黄连素片为抗菌消炎药，用于急性菌痢,肠炎等。呋喃苦参黄连素片处方为呋喃唑酮31.5g、苦参流浸膏150g、黄连素32.5g与辅料适量制成1000片。该标准收载于国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-1499)-2004，原标准含量测定仅有呋喃唑酮一种成分，采用紫外吸收系数法测定，然而由于该处方是由多组分药品组成，而原标准采用取本品10片，除去包衣，称重，研细，精密称定适量(约相当于呋喃唑酮15mg)，置200ml容量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺30ml溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密刻取续滤液5ml置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。而测定时呋喃唑酮采用加水溶解，水溶解的呋喃唑酮稳定性差，因此导致采用紫外分光光度法分析误差较大，测量的数据不够准确。

现有专利(CN 102018755 B)公开了呋喃苦参黄连素片的质量检测方法，主要采用薄层色谱法进行鉴别，同时采用分光光度法对呋喃唑酮的含量进行测定，采用高效液相色谱法对黄连素的含量进行测定。但此种检测方法检测过程过于繁琐，而且仍无法准确的检测到呋喃唑酮的含量，对于苦参的含量更是无法掌握。

目前，中华人民共和国农业部已经将呋喃唑酮列为禁止使用的药物，不得在动物性食品中检出。FDA也于2002年禁止了硝基呋喃类(包括呋喃唑酮)在动物性食品中的使用。因此，如何能够安全的使用呋喃苦参黄连素片就需要研发人员研发一种全新的检测方法，使其能够准确的检测到呋喃苦参黄连素片中各主要成分的含量。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种呋喃苦参黄连素片的质量检测方法，使其能够准确的测量出呋喃苦参黄连素片中各主要成分的含量。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的，具体操作步骤如下：

1、标准品溶液的配制

1.1呋喃唑酮标准品溶液配制：精密称取呋喃唑酮标准品7.09mg，置于100mL棕色容量瓶中，采用N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液定容至刻度线位置处，摇匀；精密量取2ml至10mL棕色容量瓶中，采用N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液定容至刻度线位置处，摇匀；制得浓度为14.18μg·mL^-1呋喃唑酮标准品溶液；

1.2盐酸小檗碱标准品溶液配制：精密称取盐酸小檗碱标准品8.24mg，溶解于100mL棕色容量瓶中，采用N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液定容至刻度线位置处，摇匀；精密量取2ml至10mL棕色容量瓶中，采用N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液定容至刻度线位置处，摇匀；制得浓度为16.48μg·mL^-1盐酸小檗碱标准品溶液；

1.3苦参碱及氧化苦参碱标准品溶液配制：精密称取苦参碱标准品11.99mg，氧化苦参碱标准品10.80mg，分别置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取5ml，置25ml量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

2、供试品溶液制备

2.1呋喃唑酮及盐酸小檗碱供试品溶液制备：取呋喃苦参黄连素片20片，剥去糖衣并精密称定，研细，精密称取15.75mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液80ml，振摇提取5min，采用N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液定容至刻度线位置处，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

2.2苦参碱及氧化苦参碱供试品溶液制备：取呋喃苦参黄连素片20片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取0.9548g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷25ml、浓氨试液2.5ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，水浴蒸至近干，残渣加甲醇：磷酸盐缓冲溶液＝7：93的混合溶液溶解至10ml量瓶中，加甲醇：磷酸盐缓冲溶液＝7：93的混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

3、阴性样品溶液制备

3.1呋喃唑酮阴性样品溶液制备：取按照国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-1499)-2004公布的呋喃苦参黄连素片处方工艺，去除呋喃唑酮原料药，制成呋喃唑酮阴性样品，按照“2.1样品溶液制备”方法同法制成呋喃唑酮阴性样品溶液；

3.2盐酸小檗碱阴性样品溶液制备：取按照国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-1499)-2004公布的呋喃苦参黄连素片处方工艺，去除黄连素原料药，制成盐酸小檗碱阴性样品，按照“2.1样品溶液制备”方法同法制成盐酸小檗碱阴性样品溶液；

3.3苦参阴性样品溶液制备：取按照国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-1499)-2004公布的呋喃苦参黄连素片处方工艺，去除苦参流浸膏原料药，制成苦参阴性样品，按照“2.2样品溶液制备”方法同法制成盐酸小檗碱阴性样品溶液；

4、色谱条件

4.1呋喃唑酮及盐酸小檗碱检测的色谱条件

采用氨基色谱柱：Inertsil NH2 5μm 4.6×250mm C/N 5020-05546；测定呋喃唑酮的流动相为乙腈：无水乙醇：2％磷酸溶液＝92：6：2，测定盐酸小檗碱的流动相为乙腈：无水乙醇：2％磷酸溶液＝84：8：8，流速均为1.0mL·min^-1；柱温：30℃；检测波长：呋喃唑酮365nm，盐酸小檗碱350nm；进样量：10μL；检测器：VWD检测器；

4.2苦参碱及氧化苦参碱检测的色谱条件

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱：Promosil C18 5μm 4.6×250mm；以甲醇：磷酸盐缓冲溶液＝7：93为流动相；检测波长为220nm；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；进样量：5μL；检测器：VWD检测器；

5、测定

5.1呋喃唑酮及盐酸小檗碱测定：分别精密吸取标准品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，记录7min的色谱图，即得；

5.2苦参碱及氧化苦参碱测定：分别精密吸取标准品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，记录30min的色谱图，即得。

作为本发明的优选，本发明所述的磷酸盐缓冲溶液配制时均是将磷酸二氢钾3.404g溶解于1000ml水中，然后用磷酸调节pH值至3.0。

本发明步骤2.2超声处理时功率500w，频率40kHz。

本发明的优点和积极效果：

(1)本发明所述的检测方法采用高效液相色谱分析方法检测呋喃唑酮的含量，测量准确性高，误差小，重现性好，而且还增加了盐酸小檗碱、苦参碱及氧化苦参碱的含量测定，能更有效的控制盐酸小檗碱的限度，制定苦参提取物中苦参碱及氧化苦参碱的含量，从而更有效控制药物剂量，为工艺生产提供可靠依据。

(2)本发明所述的检测方法中呋喃唑酮与盐酸小檗碱供试品处理方法一致，均采用氨基色谱柱分析，分析时间短，进针时间为7min，而且流动相组份一致，仅为比例不同，检测方便。

附图说明

图1是呋喃唑酮标准品溶液的高效液相色谱图。

图2是批号为201601010呋喃唑酮样品高效液相色谱图。

图3是呋喃唑酮阴性样品溶液的高效液相色谱图。

图4是盐酸小檗碱标准品溶液的高效液相色谱图。

图5是批号为201601010盐酸小檗碱样品高效液相色谱图。

图6是盐酸小檗碱阴性样品溶液的高效液相色谱图。

图7是苦参碱标准品溶液的高效液相色谱图。

图8是氧化苦参碱标准品溶液的高效液相色谱图。

图9是批号为201601010苦参样品溶液的高效液相色谱图。

图10是苦参阴性样品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

仪器与试药

仪器：安捷伦1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技中国有限公司)；岛津2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；安捷伦1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技中国有限公司)；GWA-UN4超纯水器(北京普析通用仪器有限责任公司)；FA1104N万分之一分析天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂制造)

试药及试剂：呋喃苦参黄连素片(哈尔滨华雨制药集团有限公司；批号：2016010102)；按照国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-1499)-2004自制两批样品(批号为20161008；20161009)；N，N二甲基甲酰胺(天津市康科德科技有限公司，色谱纯，批号：100817)；无水乙醇(天津市康科德科技有限公司，色谱纯，批号：100226)；乙腈(色谱纯，Fisher chemical，批号：154450)；甲醇(色谱纯，Fisher chemical，批号：154448)；磷酸(天津市光复精细化工研究所，批号：20160705)；磷酸二氢钾(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20110426)；水(二次去离子水)；呋喃唑酮标准品(批号：100466-201202，供含量测定用，中国食品药品检定研究院)；盐酸小檗碱标准品(批号：110713-201212，供含量测定用，中国食品药品检定研究院)；苦参碱标准品(批号：101128-201001，供含量测定用，中国食品药品检定研究院)；氧化苦参碱标准品(批号：110780-201007，供含量测定用，中国食品药品检定研究院)。

实施例1

1、标准品溶液的配制

1.1呋喃唑酮标准品溶液配制：精密称取呋喃唑酮标准品7.09mg，置于100mL棕色容量瓶中，采用N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液定容至刻度线位置处，摇匀；精密量取2ml至10mL棕色容量瓶中，采用N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液定容至刻度线位置处，摇匀；制得浓度为14.18μg·mL^-1呋喃唑酮标准品溶液；

1.2盐酸小檗碱标准品溶液配制：精密称取盐酸小檗碱标准品8.24mg，溶解于100mL棕色容量瓶中，采用N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液定容至刻度线位置处，摇匀；精密量取2ml至10mL棕色容量瓶中，采用N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液定容至刻度线位置处，摇匀；制得浓度为16.48μg·mL^-1盐酸小檗碱标准品溶液；

1.3苦参碱及氧化苦参碱标准品溶液配制：精密称取苦参碱标准品11.99mg，氧化苦参碱标准品10.80mg，分别置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取5ml，置25ml量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液(磷酸二氢钾3.404g溶解于1000ml水中，用磷酸调节pH值至3.0)稀释至刻度，摇匀，即得；

2、供试品溶液制备

2.1呋喃唑酮及盐酸小檗碱供试品溶液制备：取呋喃苦参黄连素片20片，剥去糖衣并精密称定，研细，精密称取15.75mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液80ml，振摇提取5min，采用N，N二甲基甲酰胺：无水乙醇＝2：3的混合溶液定容至刻度线位置处，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；

2.2苦参碱及氧化苦参碱供试品溶液制备：取呋喃苦参黄连素片样品20片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取0.9548g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷25ml、浓氨试液2.5ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，水浴蒸至近干，残渣加甲醇：磷酸盐缓冲溶液磷酸二氢钾3.404g溶解于1000ml水中，用磷酸调节pH值至3.0)＝7：93的混合溶液溶解至10ml量瓶中，加甲醇：磷酸盐缓冲溶液(磷酸二氢钾3.404g溶解于1000ml水中，用磷酸调节pH值至3.0)＝7：93的混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

3、阴性样品溶液制备

3.1呋喃唑酮阴性样品溶液制备：取按照按照国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-1499)-2004公布的呋喃苦参黄连素片处方工艺，去除呋喃唑酮原料药，制成呋喃唑酮阴性样品，按照“2.1样品溶液制备”方法同法制成呋喃唑酮阴性样品溶液；

3.2盐酸小檗碱阴性样品溶液制备：取按照按照国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-1499)-2004公布的呋喃苦参黄连素片处方工艺，去除黄连素原料药，制成盐酸小檗碱阴性样品，按照“2.1样品溶液制备”方法同法制成盐酸小檗碱阴性样品溶液；

3.3苦参阴性样品溶液制备：取按照按照国家食品药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-1499)-2004公布的呋喃苦参黄连素片处方工艺，去除苦参流浸膏原料药，制成苦参阴性样品，按照“2.2样品溶液制备”方法同法制成盐酸小檗碱阴性样品溶液；

4、色谱条件

4.1呋喃唑酮及盐酸小檗碱检测的色谱条件

采用氨基色谱柱：Inertsil NH2 5μm 4.6×250mm C/N 5020-05546；测定呋喃唑酮的流动相为乙腈：无水乙醇：2％磷酸溶液＝92：6：2，测定盐酸小檗碱的流动相为乙腈：无水乙醇：2％磷酸溶液＝84：8：8，流速均为1.0mL·min^-1；柱温：30℃；检测波长：呋喃唑酮365nm，盐酸小檗碱350nm；进样量：10μL；检测器：VWD检测器；

4.2苦参碱及氧化苦参碱检测的色谱条件

采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱：Promosil C18 5μm 4.6×250mm；以甲醇：磷酸盐缓冲溶液(磷酸二氢钾3.404g溶解于1000ml水中，用磷酸调节pH值至3.0)＝7：93为流动相；检测波长为220nm；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；进样量：5μL；检测器：VWD检测器；

5、测定

5.1呋喃唑酮及盐酸小檗碱测定：分别精密吸取标准品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，记录7min的色谱图，具体测定结果见图1至图6。

5.2苦参碱及氧化苦参碱测定：分别精密吸取标准品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，记录30min的色谱图，具体测定结果见图7至图10。

方法学考查

(1)线性关系：按照步骤1.1的方法制得呋喃唑酮标准品溶液；按照步骤1.2的方法制得盐酸小檗碱标准品溶液；按照步骤1.3的方法分别制得苦参碱及氧化苦参碱标准品溶液；将上述四种溶液中每种溶液进样时进样量分别为0.1、1、3、5、8、10μL，然后按照步骤4.1的色谱条件对呋喃唑酮及盐酸小檗碱进行测定，按照步骤4.2的色谱条件对苦参碱及氧化苦参碱进行测量，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，作线性关系曲线，峰面积对浓度作线性方程，得线性方程结果见表1。

表1线性关系方程

(2)精密度实验：取步骤1.1制得的呋喃唑酮标准品溶液及步骤1.2制得的盐酸小檗碱标准品溶液，按照步骤4.1色谱条件下连续进样6次，测得呋喃唑酮、盐酸小檗碱的峰面积，计算得相对标准偏差分别为0.23％和0.51％(n＝6)；取步骤1.3制得的苦参碱及氧化苦参碱标准品溶液，按照步骤4.2色谱条件下连续进样6次，测得苦参碱及氧化苦参碱的峰面积，计算得相对标准偏差分别为0.18％和0.26％(n＝6)，结果表明仪器精密度良好，结果见表2。

表2精密度测试实验数据

(3)重现性实验：取批号2016010102的呋喃苦参黄连素片6份，分别按照步骤2下的各自供试品溶液的制备方法制备样品溶液，并按照步骤4下的各自色谱条件下进行测定，测得呋喃唑酮、盐酸小檗碱峰面积，采用外标法，根据标示量计算标示含量，呋喃唑酮标示量为31.5mg/片，盐酸小檗碱标示量为32.5mg/片，苦参碱及氧化苦参碱的含量，计算得呋喃唑酮、盐酸小檗碱、苦参碱及氧化苦参碱的相对标准偏差分别为1.08％、1.02％、1.99％、2.26％，由实验数据表明方法重复性良好，具体结果见表3。

表3重现性实验数据

(4)稳定性试验：取批号为2016010102呋喃苦参黄连素片样品溶液，分别按照步骤4下的各自色谱条件分别测定0、3、6、9、12、24h的色谱图峰面积，测定其稳定性。根据呋喃唑酮、盐酸小檗碱、苦参碱及氧化苦参碱的峰面积，计算得相对标准偏差分别为2.86％，0.46％，0.40％，1.85％和2.52％，由实验数据说明样品溶液在24h内基本稳定，具体结果见表4。

表4稳定性实验数据

(5)回收率试验：精密称取批号为2016010102呋喃苦参黄连素片样品6份，分别置于容量瓶中，在每份样品中加入按步骤1.1呋喃唑酮配制方法，制成浓度为0.718mg/ml的呋喃唑酮标准品溶液，每份精密加入1.00ml，按照步骤2.1供试品溶液的制备方法以及按照步骤4.1色谱条件进行测定。实验结果表明各组分的回收率较好，准确率较高，具体结果见表5。

表5呋喃唑酮加标回收率试验

精密称取批号为2016010102呋喃苦参黄连素片样品6份，分别置于容量瓶中，在每份样品中加入按步骤1.2盐酸小檗碱配制方法，制成浓度为0.751mg/ml的盐酸小檗碱标准品溶液，每份精密加入1.00ml，按照步骤2.1供试品溶液的制备方法以及按照步骤4.1色谱条件进行测定。实验结果表明各组分的回收率回收率较好，准确率较高，具体结果见表6。

表6盐酸小檗碱加标回收率试验

精密称取批号为2016010102呋喃苦参黄连素片样品6份，分别置于锥形瓶中，在每份样品中加入按步骤1.3项下，苦参碱加甲醇配制成浓度为0.4796mg/ml的苦参碱标准品溶液，每份精密加入3.00ml，放置水浴中蒸去甲醇溶剂，按照步骤2.2供试品溶液的制备方法以及按照步骤4.2色谱条件进行测定。实验结果表明各组分的回收率较好，准确率较高，具体结果见表7。

表7苦参碱加标回收率试验

精密称取批号为2016010102呋喃苦参黄连素片样品6份，分别置于锥形瓶中，在每份样品中加入按步骤1.3项下，氧化苦参碱加甲醇配制成浓度为0.432mg/ml的氧化苦参碱标准品溶液，每份精密加入2.00ml，放置水浴中蒸去甲醇溶剂，按照步骤2.2供试品溶液的制备方法以及按照步骤4.2色谱条件进行测定。实验结果表明各组分的回收率较好，准确率较高，具体结果见表8。

表8氧化苦参碱加标回收率试验

样品含量测定：按照步骤2供试品溶液的制备方法以及按照步骤4色谱条件进行测定供试品溶液，呋喃唑酮、盐酸小檗碱的标示含量及苦参碱与氧化苦参碱总量见表9。

表9样品测定结果