一种梨树叶片氮素含量的无损测量方法与流程

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种梨树叶片氮素含量的无损测量方法。

背景技术：

氮素是梨树生长发育、产量形成和品质提高的基础。传统的植物氮素营养诊断方法是基于叶片的实验室分析，通过叶片矿质营养分析判断果树营养状况是指导果树施肥的重要手段。而实验室内叶营养化学分析方法，普遍要求破坏植物样本，从采集大量的样本、烘干、称重、研磨直到使用有潜在危害性药品进行测试，需耗费大量的时间、人力和物力(Wang et al.,2012)。由于花费时间过长，以至于结果的适时性不强。实时、无损而准确地了解作物生长情况，是精确作物管理的基础。建立作物氮素营养的实时监控技术，对于及时掌握作物生长情况、合理指导生长过程中的追肥调控、保障作物产量与品质的具有重要的研究意义。近年来，随着光谱技术的快速发展与不断完善，尤其是利用可见和近红外光谱(VIS/NIR)数据对多种植物生化组分含量进行快速与准确测定已成为现实。目前所建立的诸多预测模型适用范围很狭窄，不同作物品种间不能通用。虽然现在果树上的研究日渐增多(朱西存等，2010；刘燕德等，2008；Menesattia et al，2010；)，但是对梨树叶片氮素的定量化预测还未见报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，以梨树鲜叶为研究对象，采用便携式地物光谱仪测定其可见和近红外反射光谱，建立梨树鲜叶全氮素含量与可见和近红外光谱之间的定量模型，为梨树叶片氮素快速诊断和合理施用氮肥提供依据，解决了现有检测方法费时、费力，费用高等问题。。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：一种梨树叶片氮素含量的无损测量方法，包括以下步骤：

(1)选定健康的梨树叶片样本，使用便携式地物光谱仪原位采集可见和近红外光谱值；

(2)从梨树上采下步骤(1)中所述样本，测定氮素含量；

(3)对步骤(1)中得到的光谱值，采用主成分分析法剔除异常样本，用偏最小二乘回归建立校正模型并采用留一法交叉验证形式进行检验，从而得到步骤(1)所述光 谱值相对步骤(2)所述氮素含量的定量校正模型；

(4)使用便携式地物光谱仪采集待测的梨树叶片样品的可见和近红外光谱值，通过步骤(3)的优化模型计算得到所述样品的氮素含量。

步骤(1)中，所述原位采集的方法包括以下步骤：将便携式地物光谱仪的光纤组装进植被探头，植被探头配合叶片夹持器的黑色参考板夹持叶片，所述植被探头和叶片夹持器构成一个自带光源的暗室，植被探头采集叶片光谱。

所述采集叶片光谱采集点为每片叶片的叶中、的叶脉对称位置的取两个点，每点采集5-10条，输出波段数2151个。

为使植被探头采集的光谱具有代表性，首先要确定能代表整张叶片光谱的叶表采集部位。本发明分别采集了叶尖、叶中、叶基三个部位，每个部位采集叶脉对称的两个点。采集的6个点范围也基本上覆盖了整张叶片，这6个点的光谱反射率平均值即为叶片光谱反射率。然后，通过对叶尖、叶中、叶基和平均光谱的反射率进行方差分析，从分析结果可以看出，叶片三个部位中只有叶中的光谱反射率和整张叶片的平均光谱反射率在0.05水平上始终没有差异，因此可以认为叶中的光谱反射率最能代表整张叶片的反射率，如此便可大大减少采集光谱的时间，提高了光谱采集的精度。

步骤(1)中，所述样本数量为100个以上，优选的所述样本数量为400～1000个。

步骤(1)中，所述光谱仪的测定波段值为350～2500nm，分辨率为3～10nm；优选的，光谱扫描范围为350-1000nm时的分辨率为3nm，光谱扫描范围为1000-2500nm时的分辨率为10nm。

步骤(1)和(4)中，所述梨树叶片为梨树树冠外围当年生枝条中下部的叶片。步骤(2)中，所述测定氮素含量包括以下步骤：(a)将采下的叶片于105～110℃恒温杀青30min以上，再在60～70℃烘至恒重，粉碎、过筛，得到待测样品；(b)使用元素分析仪测定每份步骤(a)中得到的待测样品的氮素含量，每份样品测定2次，取其平均值，所述测定样品的有效数据为平行样本之间的相对误差不得高于5％，所述过筛的筛子为不低于100目，优选为100～200目。

步骤(2)中，所述测定氮素含量还可以包括以下步骤：(c)以GBW10020柑橘叶作为标样，测定所述标样的氮素含量，对步骤(b)中得到的待测样品氮素含量进行校正，以确保化学分析过程的准确性。

步骤(1)和(4)中使用的光谱仪为便携式地物光谱仪。为最大程度降低实验误差， 步骤(1)和(4)中使用同一台光谱仪，所述光谱仪的植被探头直径1.5cm，内置卤素光源。

可在梨树膨大期采集树叶，计算氮素含量，以指导后续施肥，所述膨大期包括膨大I期或膨大II期，所述膨大I期为花后50天，所述膨大II期为花后80天。

有益效果：本发明方法可以快速、无损、廉价地得到梨树叶片氮素含量，并通过一定数量的叶片氮素含量评估树体氮素营养状况，本发明方法不需要化学试剂、无损和操作简单。

附图说明

图1田间两种不同光谱测量方式示意图；

图2三种不同光谱测量方法原始光谱曲线图；

图3三种不同光谱测量方法下原始光谱和氮素含量相关关系图；

图4建模集氮素含量拟合图，其中样本量为1000；

图5外部验证集氮素含量结果，其中样本量为400；

图6叶片氮素含量和产量二次多项式拟合，其中，图a和图b分别是2014年花后50天与花后80天叶片氮素含量与当年产量拟合曲线；图c和图d分别是2015年花后50天与花后80天叶片氮素含量与当年产量拟合曲线。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

(1)梨树叶片可见和近红外光谱值的采集

利用美国ASD公司生产的3便携式地物光谱仪测定叶片光谱。波段值为350～2500nm，输出波段数为2151个。植被探头直径1.5cm，内置卤素光源。本实验探究了三种不同田间叶片光谱值测量方法(图1和图2)，分别是25°裸光纤、植被探头配合叶片夹持器白色参考板以及植被探头配合叶片夹持器黑色参考板。①25°裸光纤法：选择天气晴朗，无风或风速很小时进行，测定时间为10:00-14:00，直接将光纤头对准叶片正面和叶脉中部两端对称的两个点，每点采集5-10条光谱，每采集4-8个样品后利用参考白板校正。②植被探头配合叶片夹持器白色参考板，夹持叶片测量。由于具有内置稳定光源，一般采集10-20个样品后利用参考白板校正(下同)。③植被探头配合叶片 夹持器黑色参考板，夹持叶片测量(图1)。使用植被探头结合叶片夹持器时，植被探头对准叶片正面和叶脉中部两端对称的两个点，每点采集5-10条光谱。结果表明植被探头配合叶片夹持器(黑色参考板)具有较高的信噪比(图3)，该方法下的叶片氮素含量和原始光谱之间具有较好的相关性，整个波段的相关系数大于前两种方法。

为使植被探头采集的光谱具有代表性，首先要确定能代表整张叶片光谱的叶表采集部位。本发明分别采集了叶尖、叶中、叶基三个部位，每个部位采集叶脉对称的两个点。采集的6个点范围也基本上覆盖了整张叶片，这6个点的光谱反射率平均值即为叶片光谱反射率。然后，通过对叶尖、叶中、叶基和平均光谱的反射率进行方差分析，选取反射率差别大小不等的10个波长统计见表1，方差采用DUNCAN、LSD在0.05水平下(Spss)，波长在所述的2151个输出波段数中随机选取。

可以看出，叶片三个部位中只有叶中的光谱反射率和整张叶片的平均光谱反射率在0.05水平上始终没有差异。因此可以认为叶中的光谱反射率最能代表整张叶片的反射率，如此便可大大减少采集光谱的时间，提高了光谱采集的精度。

表1叶片不同部位光谱反射率差异性分析

注：表1中小写字母表示不同反射率之间的比较结果，凡有相同字母的表示差异不显著(p<0.05)

(2)采集的叶片为梨树树冠外围当年生枝条中下部，采集时期为花后50天和花后80天，见图6。

(3)梨树叶片氮素含量测定

叶片可见和近红外光谱值测定后，将叶片采下带回室内，于105℃恒温杀青30min后70℃烘至恒重，用不锈钢料理机粉碎后过筛(100目)。使用元素分析仪测定氮素含量，每份样品测定2次，取其平均值，平行样本之间的相对误差不得高于5％，分析的过程中同时加入GBW10020柑橘叶测定，以确保化学分析过程的准确性。

(4)梨树叶片氮素含量无损诊断模型构建

将每个样品测定的原始光谱值用ViewSpecPro软件求得平均值后导出。将所有样本随机划分为建模集(样本量1000)和验证集(420)。以光谱值为X，氮素含量为Y运用Unscrambler 9.7(CAMO公司，挪威)中偏最小二乘法(PLS)功能构建模型，默认最大主成分数为20，避免出现模型过拟合或拟合不足的情况。再通过留一法交叉验证，自动输出最优主成分下的PLS模型。对于所建立的定量校正模型，利用主成分分析法剔除偏离度较大样本，最后建立优化模型。定量分析模型需要具有较低的内部交叉验证均方根差(RMSE)和较高的决定系数(R²)。0.66≤R²≤0.80表明模型只能起到近似定量预测的效果，0.81≤R²≤0.90表明模型的预测效果不错，R²≥0.90表明模型的预测效果很好。

优化模型对叶片氮素含量的建模和外部验证结果如图4和图5所示，建模样本量1000，R²为0.86，外部验证样本量为420，R²为0.85，表明该方法准确度和稳定性较优。