检测30项食物过敏原IgG抗体的试剂盒及制备方法与流程

本发明涉及生物医学体外诊断技术领域，尤其涉及一种检测30项食物过敏原IgG抗体的试剂盒及制备方法。

背景技术：

目前，临床实验室检测样本中的食物过敏原一般是采用酶联免疫法(Elisa)进行检测，

该方法是将过敏原包被在96微孔板中，通过临床样本的孵育反应，最后通过酶标仪进行结果判读，采用该方法通常一次可以检测14项食物过敏原IgG，而且一次实验只能检测单一指标，通量低，检测成本高，对于扩大过敏原检测项目存在着局限性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测30项食物过敏原IgG抗体的试剂盒及制备方法，从而解决现有技术中存在的前述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种检测30项食物过敏原IgG抗体的试剂盒，包括：膜条，平行设置在所述膜条上的30条检测线、质控线和临界值线，所述30条检测线依次由：西兰花，卷心菜，胡萝卜，菜花，芹菜，黄瓜，茄子，嫩豌豆，青椒，生菜，蘑菇，洋葱，欧芹，杂色豌豆，马铃薯，菠菜，南瓜，青豆，甘薯，香菜，西红柿，小白菜，大麦(全麦粒)，荞麦，麦芽，小米，燕麦，大米，小麦，玉米共30种食物特异性IgG过敏原包被而成。

优选地，还包括透明的PVC胶片，所述膜条固定在所述PVC胶片上。

优选地，所述膜条为硝酸纤维素膜。

优选地，还包括样本稀释液、浓缩洗液、酶结合物和底物液，所述样本稀释液为含有山羊血清的Tris缓冲液，所述浓缩洗液为10×的Tris缓冲液，所述酶结合物为碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，所述底物液为NBT/BCIP。

一种检测30项食物过敏原IgG抗体试剂盒的制备方法，包含膜条的制备方法，所述膜条的制备方法包括如下步骤：

S1，使用包被缓冲液，将西兰花，卷心菜，胡萝卜，菜花，芹菜，黄瓜，茄子，嫩豌豆，青椒，生菜，蘑菇，洋葱，欧芹，杂色豌豆，马铃薯，菠菜，南瓜，青豆，甘薯，香菜，西红柿，小白菜，大麦(全麦粒)，荞麦，麦芽，小米，燕麦，大米，小麦，玉米共30种常见食物特异性过敏原和抗羊IgG，人IgG稀释至相对的包被浓度，配制过敏原包被液；其中，所述过敏原采用冻干粉，所述包被缓冲液

为含稳定剂的30mmol/L的三羟甲基胺基甲烷缓冲液溶解，所述过敏原包被液的浓度为0.1mg/ml-1mg/ml；

S2，将配制好的过敏原包被液点样包被在硝酸纤维素膜上，形成具有检测线、质控线和临界值线的膜条；其中，加样参数为0.7-1ul/cm；

S3，使用牛血清白蛋白、酪蛋白或新生牛血清对所述膜条进行非特异性封闭，其中，牛血清白蛋白质量比为0.9-1.3％，酪蛋白质量比为0.08-0.12％；

S4，将封闭好的所述膜条放置在湿度低于30％的条件下干燥，得到制备好的膜条。

优选地，S2中，使用高精度自动点样仪将配制好的过敏原包被液点样包被在硝酸纤维素膜上。

优选地，还包括步骤：

通过定制的双面胶将制备好的膜条按相关序列粘贴固定于PVC衬板上；

使用斩切机将组装好的条斩切成单人份。

本发明的有益效果是：本发明实施例提供的检测30项食物过敏原IgG抗体的试剂盒及制备方法，采用线性免疫分析法，将西兰花，卷心菜，胡萝卜，菜花，芹菜，黄瓜，茄子，嫩豌豆，青椒，生菜，蘑菇，洋葱，欧芹，杂色豌豆，马铃薯，菠菜，南瓜，青豆，甘薯，香菜，西红柿，小白菜，大麦(全麦粒)，荞麦，麦芽，小米，燕麦，大米，小麦，玉米共30种食物特异性IgG过敏原和质控线及临界值线平行包被在硝酸纤维素膜上制备的膜条，不仅灵敏度(信号值)高，稳定性高，而且，使用该试剂盒，可以实现通过一份临床样本和一次检测反应，即可检测人血清中的30种食物过敏原的IgG抗体，克服了当前Elisa方法学试剂盒相关抗体逐一单独检测在操作上的繁琐，大大提高了检测效率。

附图说明

图1是本发明实施例提供的试剂盒的膜条的布线结构示意图；

图2是本发明实施例提供的试剂盒的膜条的布线截面示意图；

图3是三羟甲基氨基甲烷的浓度对平均信号值的影响；

图4是牛血清白蛋白的浓度对平均信号值的影响；

图5是酪蛋白的浓度对平均信号值的影响；

图6是本发明实施例提供的膜条在不同时间时的平均信号值。

图1和2中，各符号的含义如下：

1质控线，2临界值线，3-32依次为包被有如下30种食物特异性过敏原的检测线：西兰花，卷心菜，胡萝卜，菜花，芹菜，黄瓜，茄子，嫩豌豆，青椒，生菜，蘑菇，洋葱，欧芹，杂色豌豆，马铃薯，菠菜，南瓜，青豆，甘薯，香菜，西红柿，小白菜，大麦(全麦粒)，荞麦，麦芽，小米，燕麦，大米，小麦，玉米，33PVC胶片，34双面胶，35膜条。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1-2所示，本发明实施例提供了一种检测30项食物过敏原I gG抗体的试剂盒，包括：膜条，平行设置在所述膜条上的30条检测线、质控线和临界值线，所述30条检测线依次由：西兰花，卷心菜，胡萝卜，菜花，芹菜，黄瓜，茄子，嫩豌豆，青椒，生菜，蘑菇，洋葱，欧芹，杂色豌豆，马铃薯，菠菜，南瓜，青豆，甘薯，香菜，西红柿，小白菜，大麦(全麦粒)，荞麦，麦芽，小米，燕麦，大米，小麦，玉米共30种食物特异性IgG过敏原包被而成。

本发明实施例提供的试剂盒，还可以包括透明的PVC胶片，所述膜条固定在所述PVC胶片上。

其中，所述膜条可以为硝酸纤维素膜。

本发明实施例提供的试剂盒，还可以包括样本稀释液、浓缩洗液、酶结合物和底物液，所述样本稀释液为含有山羊血清的Tris缓冲液，所述浓缩洗液为10×的Tris缓冲液，所述酶结合物为碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，所述底物液为NBT/BCIP。

利用上述结构的试剂盒进行检测的试验原理为，检测时，膜条与稀释的血清样本共同温育使血清中的抗体与膜条上的抗原结合。利用碱性磷酸酶标记羊抗人IgG检测此结合抗体。加入底物后，结合抗体上标记的酶催化底物反应，并在过敏原包被的位置产生可见的条带。根据条带是否显色，可判断受试者的抗体特性，如果明显显色判定为该抗体阳性，如果不显色则判定为阴性。通过以硝酸纤维素膜为载体进行包被，实现30种食物过敏原联合检测，大大提高了检测效率。

本发明实施例提供的试剂盒中，除了膜条以外的其他组分的具体信息如下：

孵育槽 2个；

结果判读卡 1套。

上述结构的试剂盒，在实际使用过程中，可以先进行以下的预处理：

浓缩洗液的稀释：稀释前应使其全部溶解。将浓缩洗液(10×)与蒸馏水或纯化水1:9稀释。例如：1份浓缩洗液(10×)加9份蒸馏水或纯化水。

酶结合物的配制：10倍浓缩。吸取所需酶结合物，并用样本缓冲液1:10稀释。

其检测的使用方法可以包括如下步骤：

1.将抗原膜条置于孵育槽中，带有文字标记的一面朝上；每槽加入1.5ml样本缓冲液，将膜条在室温下摇摆摇床轻微晃动5分钟，其后弃去孵育槽中液体。

2.每槽加入1.5ml稀释的血清样品，室温下在摇摆摇床上轻微晃动孵育30分钟。

3.弃去孵育槽中液体，每槽加入1.5ml清洗缓冲液，室温下在摇摆摇床上轻微晃动5分钟，弃去孵育槽中液体。再重复洗涤2次。

4.弃去孵育槽中液体，每槽加入1.5ml稀释后的酶结合物，室温下在摇摆摇床上轻微晃动孵育30分钟。

5.重复步骤3。

6.弃去孵育槽中液体，每槽加入1.5ml底物液，室温下在摇摆摇床上轻微晃动孵育10分钟。

7.弃去孵育槽中液体，每槽加入1.5ml蒸馏水或纯化水，室温下在摇摆摇床上轻微晃动1分钟，弃去孵育槽中液体。再重复洗涤2次。

8.膜条干燥后，可将抗原膜条粘贴于结果记录单上，以便保存实验结果。

上述结构的试剂盒，其性能鉴定的方法为：

位于检测膜条标志下方反应区域依次有质控线、临界值线。如果质控线出现强的颜色反应，临界值线有微弱显色，并且质控线显色强于临界值线，则说明实验结果有效。如果质控线未出现强的颜色反应，则说明实验结果无效。

可将结果判读卡的标示条带与膜条上的相应条带对齐，比对检测条带位置。

根据抗原条带显色程度，可将结果判读为阴性和阳性。

阳性：抗原条带显色较临界值线一致或更深；

阴性：抗原条带显色较临界值线浅。

实施例二

本发明实施例提供了一种检测30项食物过敏原IgG抗体试剂盒的制备方法，包含膜条的制备方法，所述膜条的制备方法包括如下步骤：

S1，使用包被缓冲液，将西兰花，卷心菜，胡萝卜，菜花，芹菜，黄瓜，茄子，嫩豌豆，青椒，生菜，蘑菇，洋葱，欧芹，杂色豌豆，马铃薯，菠菜，南瓜，青豆，甘薯，香菜，西红柿，小白菜，大麦(全麦粒)，荞麦，麦芽，小米，燕麦，大米，小麦，玉米共30种常见食物特异性过敏原和抗羊IgG，人IgG稀释至相对的包被浓度，配制过敏原包被液；其中，所述过敏原采用冻干粉，所述包被缓冲液为含稳定剂的30mmol/L的三羟甲基胺基甲烷缓冲液溶解，所述过敏原包被液的浓度为0.1mg/ml-1mg/ml；

S2，将配制好的过敏原包被液点样包被在硝酸纤维素膜上，形成具有检测线、质控线和临界值线的膜条；其中，加样参数为0.7-1ul/cm；

S3，使用牛血清白蛋白、酪蛋白或新生牛血清对所述膜条进行非特异性封闭，其中，牛血清白蛋白质量比为0.9-1.3％，酪蛋白质量比为0.08-0.12％；

S4，将封闭好的所述膜条放置在湿度低于30％的条件下干燥，得到制备好的膜条。

其中，S1中，采用30mmol/L的三羟甲基氨基甲烷制备得到的膜条，如图3所示，在检测食物过敏原IgG抗体的过程中，得到的平均信号值最大，其中，平均信号值通过各指标显色灰度减去背景灰度计算所得。

S3中，采用质量比为0.9-1.3％牛血清白蛋白封闭得到的膜条，如图4所示，在检测食物过敏原IgG抗体的过程中，得到的平均信号值最大，其中，平均信号值通过各指标显色灰度减去背景灰度计算所得。

采用质量比为0.08-0.12％酪蛋白封闭得到的膜条，如图5所示，在检测食物过敏原IgG抗体的过程中，得到的平均信号值最大，其中，平均信号值通过各指标显色灰度减去背景灰度计算所得。

如图6所示，曲线2为采用现有技术制备得到的产品随时间变化的平均信号值的变化曲线，曲线1为采用本发明实施例提供的方法制备得到的膜条随时间变化的平均信号值的变化曲线。

从图6中可以看出，采用本发明提供的方法制备得到的膜条，通过采用现有方法检测其在不同时间的平均信号值，可知，2-8℃稳定性不低于24个月。

而采用现有技术中的方法制备得到的膜条，2-8℃稳定性为12个月。

因此，采用本发明实施例提供的方法制备得到的膜条，灵敏度(平均信号值)，稳定性均优于现有技术产品。

本发明的一个优选实施例中，S2中，可以使用高精度自动点样仪将配制好的过敏原包被液点样包被在硝酸纤维素膜上。

采用上述方法，可以提高操作效率和操作精准度。

本发明实施例提供的检测30项食物过敏原IgG抗体试剂盒的制备方法，制备好上述膜条后，还包括步骤：

通过定制的双面胶将制备好的膜条按相关序列粘贴固定于PVC衬板上；

使用斩切机将组装好的条斩切成单人份。

通过采用本发明公开的上述技术方案，得到了如下有益的效果：本发明实施例提供的检测30项食物过敏原IgG抗体的试剂盒及制备方法，采用线性免疫分析法，将西兰花，卷心菜，胡萝卜，菜花，芹菜，黄瓜，茄子，嫩豌豆，青椒，生菜，蘑菇，洋葱，欧芹，杂色豌豆，马铃薯，菠菜，南瓜，青豆，甘薯，香菜，西红柿，小白菜，大麦(全麦粒)，荞麦，麦芽，小米，燕麦，大米，小麦，玉米共30种食物特异性IgG过敏原和质控线及临界值线平行包被在硝酸纤维素膜上制备的膜条，不仅灵敏度(信号值)高，稳定性高，而且，使用该试剂盒，可以实现通过一份临床样本和一次检测反应，即可检测人血清中的30种食物过敏原的IgG抗体，克服了当前Elisa方法学试剂盒相关抗体逐一单独检测在操作上的繁琐，大大提高了检测效率。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可。

本领域人员应该理解的是，上述实施例提供的方法步骤的时序可根据实际情况进行适应性调整，也可根据实际情况并发进行。

上述实施例涉及的方法中的全部或部分步骤可以通过程序来指令相关的硬件来完成，所述的程序可以存储于计算机设备可读取的存储介质中，用于执行上述各实施例方法所述的全部或部分步骤。所述计算机设备，例如：个人计算机、服务器、网络设备、智能移动终端、智能家居设备、穿戴式智能设备、车载智能设备等；所述的存储介质，例如：RAM、ROM、磁碟、磁带、光盘、闪存、U盘、移动硬盘、存储卡、记忆棒、网络服务器存储、网络云存储等。

最后，还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、商品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、商品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、商品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。