一种有效分离提纯糖基化磷脂酰乙醇胺的方法与流程

本发明涉及有效分离提纯糖基化磷脂酰乙醇胺的方法。

背景技术：

糖基化磷脂酰乙醇胺(amadoriphosphatidylethanolamine，amadori-pe)是食品或生物体中的磷脂酰乙醇胺和还原糖等化合物的醛酮基发生羰胺反应而产生的一类潜在化学危害物。目前已见报道的研究表明，糖基化磷脂酰乙醇胺与糖尿病及其并发症、衰老性功能障碍以及癌症等疾病的发生存在相关性。糖基化磷脂酰乙醇胺的前体物质——磷脂广泛存在于日常膳食中。磷脂类食品在加工、储藏过程中都可能引发糖基化磷脂酰乙醇胺的安全性问题。

制备获得高纯度的糖基化磷脂酰乙醇胺标准样品是检测糖基化脂类的关键技术前提。糖基化磷脂酰乙醇胺的制备主要是将糖基化磷脂酰乙醇胺和非糖基化磷脂酰乙醇胺进行分离，目前已见报道的关于糖基化磷脂酰乙醇胺的分离方法主要有液相色谱分离法和薄层色谱分离法。jeong-hooak等人(jeong-hooakkntm.syntheticallypreparedamadori-glycatedphosphatidylethanolaminecantriggerlipidperoxidationviafreeradicalreactions[j].febsj.2000,481:26-30.)将含有糖基化磷脂酰乙醇胺的样品通过bondelut苯硼酸(pba)筒固相萃取柱，所得脂质提取物再溶解于1ml甲醇-30％氢氧化铵(95:5，v:v)中，然后装载在相同溶剂的pba平衡柱上。用另外3ml甲醇-30％氢氧化铵(95:5，v:v)进行洗脱，弃去洗脱液。再用5ml甲醇洗脱回收糖基化磷脂酰乙醇胺，并在相同条件下通过高效液相色谱柱进行纯化。目前，该方法在糖基化磷脂酰乙醇胺的相关研究中被大量引用。但该方法前处理操作麻烦，且并未公开用高效液相色谱法检测糖基化磷脂酰乙醇胺的检测条件。utzmann等人(utzmanncm,lederermo.identificationandquantificationofaminophospholipid-linkedmaillardcompoundsinmodelsystemsandeggyolkproducts[j].journalofagriculturalandfoodchemistry.2000,48(4):1000-1008.)通过三氟甲磺酸酯、磷脂酰乙醇胺和1,8-二氮杂双环制备异亚丙基-糖基化磷脂酰乙醇胺，再加入三氟酸-水转化成糖基化磷脂酰乙醇胺产物。在高真空中除去溶剂，将残余物溶于氯仿中，通过柱色谱用氯仿-甲醇-水(体积比95:35:5)进行洗脱纯化，洗脱液通过薄层色谱柱进行检测，0.1％(w/v)的2,7-二氯荧光素甲醇溶液作为喷雾试剂。再将试剂蒸发，残余物溶解于甲醇中，通过膜过滤器，汽提出甲醇，高真空干燥得到糖基化磷脂酰乙醇胺。sookwong等人(sookwongp,nakagawak,fujitai,etal.amadori-glycatedphosphatidylethanolamine,apotentialmarkerforhyperglycemia,instreptozotocin-induceddiabeticrats[j].lipids.2011,46(10):943-952.)通过folch法分离提取糖基化反应液中的脂溶性产物，再将萃取液蒸发至干，将残余物溶解于10ml氯仿-甲醇(2:1，v:v)中，然后通过制备型反相柱用甲醇-5mm乙酸铵水溶液(99:1，v:v)进行分离洗脱，制得糖基化磷脂酰乙醇胺。

由于糖基化磷脂酰乙醇胺几乎没有紫外吸收特征，只利用液相色谱法很难检测到糖基化磷脂酰乙醇胺的信号，分离提纯效率低。使用薄层色谱法则需要加入荧光性衍生试剂进行表征，然后再除去荧光性试剂，操作麻烦，且可能造成糖基化磷脂酰乙醇胺的损失。本发明方法通过固相萃取提取样品中的脂溶性产物，再通过液相色谱串联质谱检测仪获得糖基化磷脂酰乙醇胺的检测信号，确定柱保留时间。通过收集固定柱保留时间通过的分离液，氮气吹干后得到高纯度的糖基化磷脂酰乙醇胺样品。该方法操作快速，准确度高，制得糖基化磷脂酰乙醇胺的纯度高于95％。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种有效分离提纯糖基化磷脂酰乙醇胺的方法，本发明还提供了采用该方法分离提纯后得到的糖基化磷脂酰乙醇胺。该方法操作快速，准确度高，得率高，样品纯度高。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种有效分离提纯糖基化磷脂酰乙醇胺的方法，所述方法包括：

(1)将含有糖基化磷脂酰乙醇胺的样品通过固相萃取柱进行分离，固相萃取柱分离所用的洗脱液为氯仿和甲醇的混合液，收集通过固相萃取柱的洗脱液；

(2)将步骤(1)收集的洗脱液干燥后用甲醇溶液复溶，然后将复溶后的溶解液采用液相色谱进行分离，液相色谱分离所用的洗脱液为水和甲醇的混合液，根据糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留时间收集通过液相色谱柱的洗脱液。

优选地，所述步骤(1)中氯仿和甲醇的混合液中氯仿与甲醇的体积比为2:8～4:6。

优选地，所述步骤(1)中固相萃取柱为c18固相萃取柱。

优选地，所述骤(1)中固相萃取柱分离所用的洗脱液的体积为样品体积的0.5～10倍。

优选地，所述骤(1)中固相萃取柱分离所用的洗脱液的体积为样品体积的2～5倍。

优选地，所述步骤(2)中水和甲醇的混合液中水与甲醇的体积比为0:100～10:90。

优选地，所述步骤(2)中甲醇溶液是体积浓度为100％的甲醇溶液。

优选地，所述步骤(2)中糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留时间是通过液相色谱串联质谱仪测定的。

优选地，所述步骤(2)中糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留时间为5.0～6.0分钟。

优选地，所述步骤(2)中干燥是采用氮气吹干的。

本发明提供了一种采用上述所述的方法分离提纯后得到的糖基化磷脂酰乙醇胺。

本发明方法利用固相萃取柱进行粗提纯，提纯液用氮气吹干后复溶，富集了样品中的糖基化磷脂酰乙醇胺，再通过液相色谱串联质谱仪获得检测信号确定糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留时间，根据糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留时间收集洗脱液，进行精提纯。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过固相萃取柱洗脱分离，去除样品中大部分的极性成分，洗脱液经过氮气吹干后复溶，样品中的糖基化磷脂酰乙醇胺得到富集，有利于提高糖基化磷脂酰乙醇胺的提取率；

(2)本发明通过液相色谱串联质谱仪获得糖基化磷脂酰乙醇胺的检测信号，根据检测信号确定糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留时间，避免糖基化磷脂酰乙醇胺弱紫外吸收性质的影响，方法操作快速准确；

(3)本发明所得的糖基化磷脂酰乙醇胺产物纯度高，可用作食品、生物和医学的检测标准品。

附图说明

图1为不同体积比的氯仿与甲醇提取液对糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺提取量的影响，图中：1-1:50％甲醇；1-2:60％甲醇；1-3:80％甲醇；1-4：100％甲醇；

图2为不同流动相比例时糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的hplc-ms/ms色谱图，图中：2-1:85％甲醇；2-2:90％甲醇；2-3:98％甲醇；2-4:100％甲醇；

图3为本发明实施例3中纯化后1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的液相色谱图；

图4为本发明实施例3中糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的一级质谱图；

图5为本发明实施例3中糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的二级质谱图；

图6为本发明实施例3中纯化前1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的液相色谱图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：不同体积比的氯仿与甲醇提取液对糖基化磷脂酰乙醇胺提取量的影响

以糖基化1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺为例，比较氯仿与甲醇体积比0:1～1:0范围内糖基化1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的提取量。结果如图1所示，比较糖基化1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的色谱图和选择离子检测模式下的峰面积可知，当氯仿：甲醇体积比大于1时，提取样品液中含有更多非极性成分的干扰，较难分离得到糖基化1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺(如图1中1-1,1-2所示)。当氯仿：甲醇体积比小于0.25时，发现选择离子监测模式下糖基化1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的积分峰面积很小，说明当氯仿：甲醇体积比小于0.25时，对样品液中糖基化1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的提取率较低(如图1中1-3,1-4所示)。因此，综合考虑，氯仿与甲醇提取液的体积比为2:8～4:6。

实施例2：流动相对糖基化磷脂酰乙醇胺的峰形和保留时间影响显著

磷脂酰乙醇胺的磷酸头部基团发生糖化反应后极性增强，本实验以1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺为例，采用反相色谱分离的方法对样品中的1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺和糖基化1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺进行分离和纯化。不同流动相比例时糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的hplc-ms/ms色谱图如图2所示。实验表明，在本实验hplc-ms/ms检测方法中，90％以下甲醇作为流动相时，糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺在色谱图上几乎没有明显的色谱峰。90％以上甲醇作为流动相可以分离非糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺和糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺。当100％甲醇作为流动相时，糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺在色谱图上的响应峰面积最大，但是色谱图上有拖尾现象。98％甲醇作为流动相时，糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺在色谱图上的峰形较好，但相应峰面积偏小。综合考虑，糖基化磷脂酰乙醇胺的流动相比例为水与甲醇的体积比为0:100～10:90。

实施例3：糖基化1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的分离提纯

取5ml反应完成的糖基化磷脂酰乙醇胺反应溶液倒入已活化的c18固相萃取柱，缓慢加入10ml(2倍反应液体积)体积比为2:8的氯仿-甲醇洗脱液进行洗脱分离；收集通过固相萃取柱的洗脱液，氮气吹干后用3ml100％浓度的甲醇溶液复溶；

(2)取复溶液的上层澄清液进入液相色谱串联质谱仪进行检测，色谱柱为venusilasbc18(5μm，4.6×150mm)，洗脱液为体积比0.1:99.9的水-甲醇溶液，流速0.5ml/min，色谱柱温度25℃，获得检测信号，确定柱保留时间为5.0-6.0min，液相色谱图如图3和4所示，质谱图如5所示。不接质谱检测器，相同条件下，收集5.5-6.0min通过液相色谱柱的溶液，氮气吹干得到纯度97.0％的糖基化1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺样品。

将反应完成的糖基化磷脂酰乙醇胺反应溶液直接通过液相色谱进行检测，检测条件与本实施例步骤(2)的色谱条件相同，结果如图6所示。

将图3与图6对比发现，经过本发明方法的步骤(1)提纯后样品中糖基化磷脂酰乙醇胺的纯度大幅度提高。

实施例4：糖基化1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的分离提纯

取5ml反应完成的糖基化1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺反应溶液倒入已活化的c18固相萃取柱，缓慢加入15ml(3倍反应液体积)体积比为3:7的氯仿-甲醇洗脱液进行洗脱分离；收集通过固相萃取柱的洗脱液，氮气吹干后用3ml100％浓度的甲醇溶液复溶；

(2)取复溶液的上层澄清液进入液相色谱串联质谱仪进行检测，色谱柱为venusilasbc18(5μm，4.6×150mm)，洗脱液为体积比10:90的水-甲醇溶液，流速0.5ml/min，色谱柱温度30℃，获得检测信号，确定柱保留时间为5.0-6.0min。不接质谱检测器，相同条件下，收集5.3-5.8min通过液相色谱柱的溶液，氮气吹干得到纯度98.5％的糖基化1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺样品。

实施例5：糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的分离提纯

取3ml反应完成的糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺反应溶液倒入已活化的c18固相萃取柱，缓慢加入15ml(5倍反应液体积)体积比为4:6的氯仿-甲醇洗脱液进行洗脱分离；收集通过固相萃取柱的洗脱液，氮气吹干后用3ml100％浓度的甲醇溶液复溶；

(2)取复溶液的上层澄清液进入液相色谱串联质谱仪进行检测，色谱柱为venusilasbc18(5μm，4.6×150mm)，洗脱液为体积比5:95的水-甲醇溶液，流速0.5ml/min，色谱柱温度35℃，获得检测信号，确定柱保留时间为5.0-6.0min。不接质谱检测器，相同条件下，收集5.3-5.6min通过液相色谱柱的溶液，氮气吹干得到纯度97.5％的糖基化1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺样品。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。