一种化学发光免疫检测婴儿米粉中黄曲霉毒素B1的方法与流程

本发明涉及医学免疫体外诊断领域，更具体地说，涉及一种化学发光免疫检测婴儿米粉中黄曲霉毒素b1的方法。
背景技术：
：黄曲霉毒素b1(aflatoxinb1简写为afb1)是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。黄曲霉毒素b1是已知的化学物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素b1对包括人和若干动物具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏的损害。在天然食物中以黄曲霉毒素b1最为多见，危害性也最强，国家质检总局规定黄曲霉毒素b1是大部分食品的必检项目之一；它在wto确定的重点研究毒物中被列为首位。当食品、饲料制品未能及时晒干或储藏不当时极易受到黄曲霉毒素b1污染，黄曲霉毒素b1可通过直接或间接进入人类食物链，在机体内干扰信息rna和dna的合成，进而影响细胞蛋白质的合成，导致机体全身性的损害，其主要靶器官是肝脏，严重时可引起肝硬化、肝癌甚至死亡。并且，黄曲霉毒素b1十分耐热，分解温度为268℃，故在烹调过程中很难将其破坏。因此，把好食物及饲料入口关，建立简便、快速、灵敏的黄曲霉毒素b1检测方法显得至关重要。国内早期检测黄曲霉毒素常用的方法有薄层色谱法(tlc)和高效液相色谱法(hplc)，但二者均存在着检测时间长、仪器设备昂贵、操作复杂且不适于大批量样品的检测、需专业人员进行操作等缺点。免疫化学分析法的应用开辟了黄曲霉毒素b1检测的新领域，目前常用的方法有放射免疫分析法、荧光免疫分析法和酶联免疫分析法等。其中，放射免疫分析虽然高灵敏、高特异，但存在有效期短、具有放射性污染的缺点；荧光免疫分析法虽然特异性强、敏感性高、速度快，但非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，程序也比较复杂；酶联免疫分析法是70年代出现的新的免疫测定技术，其原理是抗原(或抗体)吸附于载体上的免疫吸附剂和用酶标记的抗体(或抗原)与标本中的待测物(抗原或抗体)起特异的免疫学反应，然后加入酶底物进行显色反应，通过颜色的深浅来判断样品中待测物的含量，虽然灵敏度高、特异性强，但存在内源性酶干扰、终止液为具有腐蚀性的硫酸、底物大部分有毒或为致癌物质、吸光度的检测易受到划痕等多种外在因素的影响等缺点。化学发光免疫分析法是在抗原抗体特异性结合的基础上，依据化学发光检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度进行检测，从而确定待测物含量的一种痕量分析方法。吖啶酯是一类良好的荧光试剂，发光效率高，光猝灭效应小，反应条件温和，不受连接臂长短的影响，近年来受到免疫化学工作者的广泛关注。吖啶酯可以通过标记抗原、抗体和dna等生物大分子，实现化学发光免疫分析。化学发光免疫分析法因灵敏度高、线性动力学范围宽、光信号持续时间长、分析方法简便快捷、结果稳定、误差小、安全性好及使用期长等优点，近年来在食品、临床、兽医、生命科学、环境等领域起到重要作用，是快速检测食品、饲料中微量毒素残留的重要手段。黄曲霉毒素具有很强的毒性和致癌性。黄曲霉毒素是微生物产生的，不像三聚氰胺属于恶意添加。黄曲霉毒素是脂溶性的，如果牛饲料中存在黄曲霉毒素，牛肉中含量不会很高。但内脏特别是肝脏中含量会高。黄曲霉毒素非常耐热，加热到280°都不会被破坏，所以米粉中只要含有，就不会被去除。紫外线只能少量破坏。从而，这导致在米粉中可能会含有黄曲霉毒素，由于婴儿在成长时期，几乎都会选择一定量的米粉喂养，这便需要对婴儿米粉(或者其他食品)进行黄曲霉毒素b1的检测，根据《gb10765-2010食品安全国家标准婴儿配方食品》中规定：黄曲霉毒素m1或黄曲霉毒素b1≤0.5μg/kg。目前，虽然针对黄曲霉毒素b1的检测方法及检测试剂盒的产品也有不少，但这些检测产品检出限较高，应用于常规的检测，对于婴儿食品中的黄曲霉毒素b1的检测，难以达到效果，即使有一些较为精密的检测产品，但检测成本高，一般的，因此，需要提供一种方便快速同时检出限相对较低(满足婴儿食品中的黄曲霉毒素b1的检测)的方法。技术实现要素：为了解决上述现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种更加快速、灵敏的afb1含量检测方法。本发明的技术方案为：一种化学发光免疫检测婴儿米粉中黄曲霉毒素b1的方法，包括以下步骤：(1)样品前处理：将婴儿米粉与水按照5％稀释为样品液，37℃保湿封闭，备用；(2)制备黄曲霉毒素b1抗原afb1-bsa：用黄曲霉毒素b1(afb1)与羧甲基羟胺半盐酸盐在吡啶中反应生成黄曲霉毒素b1肟(afb1o)，再用活性酯法将afb1o与载体蛋白偶联合成完全抗原。采用该方法，afb1的肟化率和afb1o的利用率均较高。(3)吖啶酯标记的黄曲霉毒素抗原afb1-bsa-ae的制备：称取吖啶酯酸1mg溶解于200uln,n-二甲基甲酰胺中，取该溶液50μl缓慢滴入250μl3.5mg/ml的afb1-bsa溶液中，并加入40μl0.1mol/lpbs，于25℃避光、150r/min反应过夜，反应结束后，用蒸馏水4℃透析2d，备用。(4)建立标准曲线：用二抗包被2条化学发光板，37℃温育2h；洗板3次，每孔加入350μl蒸馏水，37℃保湿封闭1.5h；洗板3次，每孔加入等量afb1单克隆抗体，37℃温育45min；加入浓度分别为0、0.02、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的afb1标准品各50μl和经稀释的afb1-bsa-ae各50μl，混匀，空白孔加入100μlpbs，37℃恒温45min；洗板4次，每孔加入tritonx-100吖啶酯启动剂100μl，然后通过化学发光仪加入启动剂ctab100μl，边加边测，共测定10次，取平均值；计算各浓度的结合率，制作标准曲线。(5)加样进行免疫反应测定：用二抗进行包被，37℃温育2h；洗板3次，每孔加入350μl样品液，37℃保湿封闭1.5h；洗板3次，加入afb1单克隆抗体4μg/ml进行竞争性化学发光检测。(6)读值定量：根据检测的结果对比标准曲线获得黄曲霉毒素b1的含量。进一步，制作标准曲线时，结合率(％)＝b/b0×100％，其中b0为不加afb1的发光值，b为加afb1的发光值。进一步，制作标准曲线时，每孔按照1∶1800加入afb1单克隆抗体100μl，并按照1∶500稀释afb1-bsa-ae。进一步，在步骤(4)和步骤(5)中，采用15μg/ml兔抗鼠igg二抗进行包被。发明提供了一种化学发光免疫检测婴儿米粉中黄曲霉毒素b1的方法，与现有技术相比，具有更加快速、灵敏的效果：本申请的所述检测的线性范围为0.1～5.0ng/ml，回收率为75％～115％，变异系数为0.36％～1.20％，能灵敏准确地检测样品中的afb1含量。上述方法的检出限能够满足婴儿食品的黄曲霉毒素b1的检测。附图说明图1为吖啶酯化学发光法检测afb1方法的标准曲线。具体实施方式以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。实施例1一种化学发光免疫检测婴儿米粉中黄曲霉毒素b1的方法，包括以下步骤：(1)样品前处理：将婴儿米粉与水按照5％稀释为样品液，，37℃保湿封闭，备用；(2)制备黄曲霉毒素b1抗原afb1-bsa：用黄曲霉毒素b1(afb1)与羧甲基羟胺半盐酸盐在吡啶中反应生成黄曲霉毒素b1肟(afb1o)，再用活性酯法将afb1o与载体蛋白偶联合成完全抗原。具体的，包括以下过程：a.黄曲霉毒素b1肟(afb10)的制备：取一定量afb1溶于甲醇：吡啶(1：1)溶液中，加入羧甲基羟胺半盐酸盐，70℃下搅拌作用5h。反应过程中每隔30min取反应液做薄层层析(tlc)，监测afb1o合成反应进程。用适量甲醇溶解afb1o，紫外分光光度计进行扫描，测定最大吸收峰处的光吸收值，计算afb-和afb-o浓度。b.afb10与戴体蛋白的连接：用dmf溶解afb1o，加入dcc和nhs，室温磁力搅拌下反应4h。取适量bsa(或hsa)溶解于碳酸盐缓冲液中，磁力搅拌下将afb1o溶液逐滴加入蛋白溶液中，室温下反应2h。反应溶液用pbs透析。afb1的肟化率和afb1o的利用率较高(经检测，afb1的肟化率和afb1o的利用率分别为85％和56％)，合成的完全抗原经检验具有较好的免疫效果，保存360d后抗原效价没有明显变化。并且，选择合成相对低结合比的完全抗原，不仅可以降低生产成本，而且有助于提高抗体的选择和亲和力。(3)吖啶酯标记的黄曲霉毒素抗原afb1-bsa-ae的制备：称取吖啶酯酸1mg溶解于200uln,n-二甲基甲酰胺中，取该溶液50μl缓慢滴入250μl3.5mg/ml的afb1-bsa溶液中，并加入40μl0.1mol/lpbs，于25℃避光、150r/min反应过夜，反应结束后，用蒸馏水4℃透析2d，备用。(4)建立标准曲线：采用15μg/ml兔抗鼠igg二抗包被2条化学发光板，37℃温育2h；洗板3次，每孔加入350μl蒸馏水，37℃保湿封闭1.5h；洗板3次，每孔按照1∶1800加入afb1单克隆抗体100μl，37℃温育45min；加入浓度分别为0、0.02、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的afb1标准品各50μl和按照1∶500稀释的afb1-bsa-ae各50μl，混匀，空白孔加入100μlpbs，37℃恒温45min；洗板4次，每孔加入tritonx-100吖啶酯启动剂100μl，然后通过化学发光仪加入启动剂ctab100μl，边加边测，共测定10次，取平均值；计算各浓度的结合率，制作标准曲线。制作标准曲线时，结合率(％)＝b/b0×100％，其中b0为不加afb1的发光值，b为加afb1的发光值。标准曲线如图1所示。(5)加样进行免疫反应测定：采用15μg/ml兔抗鼠igg二抗进行包被，37℃温育2h；洗板3次，每孔加入350μl样品液，37℃保湿封闭1.5h；洗板3次，加入afb1单克隆抗体4μg/ml进行竞争性化学发光检测。(6)读值定量：根据检测的结果对比标准曲线获得黄曲霉毒素b1的含量。实施例2步骤同实施例1，样品来源不同。检测结果：实施例测得afb1含量(ng/ml)实施例10.18实施例20.32当前第1页12