本发明涉及一种试剂盒及其制备方法，具体涉及一种抗链球菌溶血素o检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
免疫比浊法(turbidimetricinhibitionimmunoassay)是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂(聚乙二醇等)的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。
胶乳增强免疫比浊法即是将待测物质相对应的抗体/抗原包被在直径为纳米胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物形成网状结构，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的敏感性。
北京九强生物技术股份有限公司的专利公开了涉及胶乳致敏的方法及试剂(申请号201010615283.2)，具体而言，所发明的胶乳致敏的方法为先通过化学键将胶乳与无关蛋白结合，再使用戊二醛将抗原或抗体交联在无关蛋白上，从而使胶乳致敏。试剂二的制备过程需要两次离心换液，不利于工业化制备。
宁波美康生物科技股份有限公司的专利公开了一种抗链球菌溶血素o抗体的检测试剂盒(申请号201410804871.9)。其所述蛋白胶乳颗粒复合物为组合蛋白标记在聚苯乙烯胶乳颗粒上形成的复合物；所述组合蛋白由链球菌溶血素o和惰性蛋白通过化学交联而成。试剂二的制备过程需要一次超滤，两次离心换液，费时费力。
天津医科大学发明涉及一种带有间隔臂的羧化聚苯乙烯微球上偶联蛋白质的方法(申请号201210005525.5)。其所述将偶联了抗体的胶乳微球与残余的抗体分离时采用了切向流过滤技术，克服了离心分离工艺中抗体易脱落和失活的缺点。
综上，现有技术中的制备方法中为了达到去除过量组分、换缓冲液、改变ph值等目的均需要进行离心或超滤步骤，导致现有制备方法费时费力，不利于工业化。而且，现有技术记载的文件中引入了惰性蛋白或无关蛋白，该引入惰性蛋白或无关蛋白的过程繁琐，且成功率低、效率低且耗时。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：现有技术均需要用离心或超滤的步骤，费时费力，不利于工业化的问题，目的在于提供了一种抗链球菌溶血素o检测试剂盒及其制备方法，其通过各个组分的投料范围的优化，能有效达到无需离心、超滤等去过量组分的步骤，使致敏后的胶乳直接作为试剂二参与反应，大大提高了常规胶乳增强免疫比浊试剂的制备效率，避免了耗时耗力的离心、超滤等纯化过程。
本发明通过下述技术方案实现：
一种抗链球菌溶血素o检测试剂盒，包括试剂二，该试剂二为采用胶乳、缓冲液、edc和hepes混合反应后，再加入naoh调节ph至7.00～8.00，最后再加入slo、封闭剂i和封闭剂ii后制成的成品；成品中各物质的浓度为：
本发明通过上述组分的优化，能避免惰性蛋白或无关蛋白的引入，极大地简化操作步骤。并且，本发明基于多个实验，进而确定试剂二中各个组分的投料范围，按本发明所建立的投料范围进行投料则可以免去离心或超滤去除过量组分的目的，非常适用于产业化生产，提高生产效率，效果更加显著。
进一步，所述缓冲液为mes-naoh溶液，所述封闭剂i为tween-20溶液，所述封闭剂ii为bsa溶液。更进一步，所述mes-naoh溶液的浓度为25～50mm，ph值为6.00；所述tween-20溶液的浓度为20％；所述bsa溶液的浓度为10％。
本发明通过本发明的范围值的优选设置，能在在简化制备步骤的同时，有效提高检测准确度。
优选地，所述bsa溶液中还包含有3％的nan3。nan3的作用是防腐，添加入试剂二后终浓度变为0.03％，仍有防腐作用。
进一步，所述胶乳为带间隔臂胶乳。链球菌溶血素o分子量约为69kd，分子量较小，经致敏至胶乳后，形成空间位阻，遮盖被待测样本中的抗体识别位点，不利于抗原决定簇的暴露，不易被待测样本中的抗体所识别，反应效率低下。本发明同时可采用带间隔臂的胶乳替换常规胶乳，该设置方式能够有效降低抗原抗体结合的空间位阻问题，有利于抗原决定簇的暴露，从而被待测样本中的抗体迅速识别，发生特异性凝集反应，达到较好的胶乳增强免疫比浊测定的效果。
本发明所述的百分数浓度均指w/v浓度，即质量/体积浓度，单位为g/ml。上述组分中edc为碳二亚胺，hepes为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，slo为链球菌溶血素o，mes为2-吗啉乙磺酸，bsa为牛血清白蛋白。
为保证称量的准确性，edc添加的方式为：将edc配制成浓度为0.7～1.2％的edc溶液，edc溶液的用量为7.50ml/l～7.70ml/l。同时，本发明中所述naoh溶液的浓度优选设置为20％。
一种抗链球菌溶血素o检测试剂盒的制备方法，其中，试剂二的制备方法包括：
分别取胶乳、缓冲液、edc、hepes、slo、封闭剂i和封闭剂ii；配制edc溶液，配制naoh溶液；
将胶乳加入缓冲液中，再加入edc溶液进行活化，再加入hepes，用naoh溶液调节ph，加入slo进行化学交联，然后加入封闭剂i和封闭剂ii进行封闭，最后制成成品。
进一步，所述edc溶液进行活化的时间为15min。所述化学交联的时间为2h。所述封闭的时间为0.5h。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明控制过程非常精准严格，避免了常规胶乳致敏过程的离心、超滤等去杂过程，大大提高了常规胶乳增强免疫比浊试剂的制备效率，大大提高了生产效率；
2、本发明性能优越，制备过程非常简单、易行，大大节约了时间成本和人力成本，克服了现有技术的缺点。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
一种抗链球菌溶血素o检测试剂盒，包括试剂一和试剂二，本实施例中，该试剂二中各物质的浓度为：
本实施例中该试剂二的胶乳优选为带间隔臂胶乳。
缓冲液优选为浓度为25～50mm的mes-naoh溶液，其制备方法是：采用mes溶解后制成25～50mm浓度的溶液，然后采用naoh调节ph至6.0即制成mes-naoh溶液。封闭剂i优选为浓度为20％的tween-20溶液。
封闭剂ii优选为浓度为10％的bsa溶液，该bsa溶液中还含有3％的nan3；封闭剂ii的制备过程为：称取10g的bsa和3g的nan3后，将两者溶解到水中，并定容到100ml即制成bsa溶液。
以100ml为例，本实施例的试剂二的具体制备方法如下：
将naoh配制成浓度为20％的naoh溶液，将edc配制成浓度为0.9％的edc溶液；分别量取胶乳6ml、mes-naoh溶液14ml、edc溶液0.76ml、hepes0.5958g、slo7.6mg、tween-20溶液2ml和bsa溶液1ml；将hepes进行溶解。
将胶乳加入到缓冲液中，再加入edc溶液进行羧基的活化，活化时间为15min，再加入hepes，采用naoh溶液调节ph至7.60，加入slo进行化学交联，化学交联时间为2h，然后加入封闭剂i和封闭剂ii进行封闭，封闭时间为0.5h，最后定容到100ml即制成成品。
本实施例的试剂一为现有抗链球菌溶血素o检测试剂盒中的试剂一，本实施例中提供了其中一种试剂一的组成，具体组成成份如下：
以1000ml为例，本实施例的试剂一的具体制备方法如下：
量取约800ml纯化水，称取并溶解hepes23.83g，用20％naoh调节ph值至7.00，称取并溶解nacl9.00～15.00g，量取并溶解吐温-2010.0ml，称取并溶解peg600025.00～33.00g，量取并溶解防腐剂0.30ml，量取并溶解10％bsa10ml，最后定容到1000ml即制成成品。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中试剂二的制备的量不同，本实施例以500ml为例，本实施例的试剂二的具体制备方法如下：
分别量取胶乳30ml、缓冲液70ml、edc3.8ml、hepes2.9789g、slo38mg、封闭剂i10ml和封闭剂ii5ml；将edc配制成浓度为0.7～1.2％的edc溶液，将hepes进行溶解，将naoh配制成浓度为20％的naoh溶液；
将胶乳加入到缓冲液中，再加入edc溶液进行羧基的活化，活化时间为15min，再加入hepes，采用naoh溶液调节ph至7.40，加入slo进行化学交联，化学交联时间为2h，然后加入封闭剂i和封闭剂ii进行封闭，封闭时间为0.5h，最后定容到500ml即制成成品。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中试剂二制备方法不同，本实施例增加了离心的步骤，本实施例的具体设置如下：
分别量取胶乳6ml、缓冲液14ml、edc0.76ml、hepes0.5958g、slo7.6mg、封闭剂i2ml和封闭剂ii1ml；；将edc配制成浓度为0.7～1.2％的edc溶液；hepes溶解后采用naoh溶液调节ph值至7.50，获得复溶液；
将胶乳加入到缓冲液中，再加入edc溶液进行羧基的活化，活化时间为15min，18000r/min离心15min，再加入ph值为7.50的复溶液进行复溶，加入slo进行化学交联，化学交联时间为2h，18000r/min离心15min，再加入ph值为7.50的复溶液进行复溶，再用然后加入封闭剂i和封闭剂ii进行封闭，封闭时间为0.5h，最后定容到100ml即制成成品。
采用上述实施例1-实施例3制成的试剂盒进行检测，校准数据如表1所示，第三方质控测试结果如表2所示，采用40个样本做临床测试的检测结果如表3所示。
表1
表2
表3
通过上述表1-表3的数据结果可以证明：本发明不经过离心、超滤等去杂过程，依然能有效使检测结果十分准确。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中试剂二中各组分的添加量不同，本实施例中各组分的浓度低于本发明，本实施例的具体设置如下：
胶乳5.6ml、缓冲液14ml、edc溶液0.73ml、hepes0.5958g、slo7.2mg、封闭剂i2ml和封闭剂ii1ml；naoh调节溶液的ph值为6.90。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中试剂二中各组分的添加量不同，本实施例的具体设置如下：
胶乳5.9ml、缓冲液14ml、edc溶液0.755ml、hepes0.5958g、slo7.5mg、封闭剂i2ml和封闭剂ii1ml；naoh调节溶液的ph值为7.10。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中试剂二中各组分的添加量不同，本实施例的具体设置如下：
胶乳6.1ml、缓冲液14ml、edc溶液0.765ml、hepes0.5958g、slo7.7mg、封闭剂i2ml和封闭剂ii1ml；naoh调节溶液的ph值为7.90。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中试剂二中各组分的添加量不同，本实施例中各组分的浓度高于本发明，本实施例的具体设置如下：
胶乳6.4ml、缓冲液14ml、edc溶液0.79ml、hepes0.5958g、slo8.0mg、封闭剂i2ml和封闭剂ii1ml；naoh调节溶液的ph值为8.10。
采用上述实施例2和实施例4-实施例7制成的试剂盒进行检测，第三方质控测试结果如表4所示。
表4
通过上述实施例4-7的试验数据可知，通过本发明的范围值的优选设置，能在在简化制备步骤的同时，有效提高检测准确度，效果更加显著。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。