用于检测PEDV变异株抗体的胶体金试纸条及其制备方法

本发明属于动物疫病检测，具体涉及用于检测pedv变异株抗体的胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术：

1、流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)病毒病是由冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus，pedv)引起，主要的临床症状表现为：哺乳仔猪非常严重的呕吐和腹泻，最后脱水死亡，且发病急。流行性腹泻病毒病是猪的一种传染极强的肠道疾病。最早发现于1971年的英国，随后迅速扩散到世界各地。1976年开始，我国广东、上海等地报道了该病的发生。所有猪只无论品种和大小均易感，母猪、断奶猪、育肥猪、架子猪均有感染性，1周龄内哺乳仔猪感染死亡率达90％-100％。该病具有严重的危害性，给世界生猪市场造成了不可估量的损失。比利时病毒学家pensaert于1977年通过试验发现并证实了，虽然该病与猪传染性胃肠炎病毒(tgev)在流行病学、临床症状乃至病理变化上都极其相似，但二者并无血清学交叉反应，而属于新的pedv成员。

2、接种疫苗是预防流行性腹泻病毒病的重要手段，1995年起我国开始采用pedv和tgev的二联灭活苗和弱毒苗。在一段时间内有效控制了该病的发生。但从2006年起该病出现在了免疫猪群。2010年以来，该病以空前的态势开始暴发，先后在中国、美国、加拿大、日本和墨西哥等地发生，我国2010年-2014年猪场腹泻病的罪魁祸首是pedv。ped除了致死率不断升高外，流行季节、持续时间和感染范围也与先前报道有所不同，并且猪群发病更加频繁，给世界养猪业带来严重威胁和巨大挑战。

3、pedv的核酸长28kb左右，正链rna，线性不分段并具有侵染性。主要编码4种结构蛋白：核衣壳n、纤突s、小膜e和膜糖m，3种非结构的蛋白：pol(1a/1b)和orf3，5'-3'顺序为：5'-pol(1a/1b)-s-orf3-e-m-n-3'。专家根据s基因将猪流行性腹泻病毒分为g1和g2两个比较大的基因群，研究发现g1基因群均存在有不同程度的碱基插入或者缺失的现象(主要以基因插入多见)；而g2基因群主要存在有碱基缺失的点突变现象。通过建立s基因进化树，发现g2分支主要是cv777、dr13等活疫苗株和pedv的早起分离株，g1分支均为新的pedv流行株，如韩国和美国流行的毒株。pedv s基因是免疫优势基因，在以s基因为诊断技术研究和候选基因的疫苗中，表现出良好且特异性非常强的免疫原性。有研究表明，抗pedv的s蛋白的抗体，不与tgev s蛋白反应，pedv s蛋白可以很好地作为胶体金检测的靶蛋白。

4、目前的pedv流行毒株基因序列变异大，导致氨基酸的较大变异，致使疫苗临床效果不明显。因此，针对pedv流行毒株的检测便十分重要。

5、目前，针对pedv流行毒株的检测方法包括病原分离鉴定、中和实验。荧光定量pcr、免疫荧光(if)、酶联免疫吸附试验(elisa)等方法。但是上述方法在对pedv流行毒株进行检测时均存在步骤繁琐、耗时长并且需要专用设备的问题。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足以及目前北京地区pedv变异株盛行，本发明提供了一种用于检测pedv变异株抗体的胶体金试纸条及其制备方法。利用本发明的试纸条可以特异性检测北京地区流行的pedv变异株抗体。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供了用于检测pedv变异株抗体的胶体金试纸条，包括pvc板，所述pvc板上设置有硝酸纤维素膜、吸水纸、金标垫、样品垫，所述硝酸纤维素膜上设有c检测线、t检测线；

4、所述金标垫经胶体金标记抗体制备；

5、所述胶体金试纸条的组装步骤如下：

6、将硝酸纤维素膜固定在pvc底板上，将吸水纸压于硝酸纤维膜一端上表面，金标垫压于硝酸纤维膜另一端上表面，样品垫边缘附着在金标垫上表面，密封；

7、所述硝酸纤维膜的c检测线上包被抗体，所述抗体为抗igg抗体；

8、所述硝酸纤维膜的t检测线上包被抗原，所述抗原的氨基酸序列如seq id no.1所示。

9、优选的，编码所述抗原的核苷酸序列如seq id no.2所示。

10、本发明还提供了用于检测pedv变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法，包括样品垫和结合垫的处理、金标垫的制备、c检测线、t检测线的处理和胶体金试纸条的组装。

11、优选的，样品垫和结合垫的处理步骤如下：

12、按照配方分别配制结合垫处理液和样品垫处理液，结合垫处理液涂布在一个玻璃纤维膜上，样品垫处理液涂布在另一个玻璃纤维膜上，干燥，分别得到结合垫和样品垫，备用。

13、优选的，所述结合垫处理液的配方为：1g pvp,5ml 10％triton x-100，加95ml20mm tris，调ph＝9；

14、所述样品垫的处理液的配方为：500μl tween-20，0.2g bsa，加100ml 20mm tris，调ph＝9。

15、优选的，所述金标垫的制备方法包括：制备胶体金标记抗体，用金标复溶液重悬胶体金标记抗体，然后用重悬液浸泡结合垫制备得到金标垫。

16、优选的，胶体金标记抗体按照如下步骤制备：

17、s1、取去离子水加热至沸腾后，加入的氯金酸溶液和柠檬酸三钠混匀，加入氯金酸溶液与柠檬酸三钠与去离子水的体积比为1：98-100：1.4-1.6，继续加热，待颜色由灰色变为黑色，再变为亮红色后且颜色保持不变，停止加热，避光冷却至室温，得到胶体金溶液；

18、s2、取胶体金溶液加入k2co3调节ph至7.5～8，混匀后加入相对于胶体金溶液体积的1.3％的兔抗猪igg后混匀，得到胶体金抗体混合溶液；

19、s3、于胶体金抗体混合溶液中加入200mg/ml的bsa和200mg/ml的peg20000混匀后，得到胶体金标记抗体溶液；

20、s4、将胶体金标记抗体溶液离心，弃去上清液，用金标复溶液重悬沉淀，得到纯化好的胶体金标记抗体，将其于4℃保存备用。

21、优选的，胶体金溶液配制过程中使用的所有试剂均需要使用无菌滤器滤菌。

22、优选的，所述c检测线、t检测线的处理按照如下步骤：

23、t检测线上用0.1m的pb缓冲液稀释包被pedv s1蛋白的浓度为0.5-2mg/ml，吸取于硝酸纤维素膜检测线位置上点膜，干燥；

24、c检测线上包被经0.1m的pb缓冲液稀释的浓度为0.8-1.2mg/ml的羊抗兔igg抗体，吸取于硝酸纤维素膜质控线位置上点膜，干燥。

25、优选的，所述pb缓冲液中包含0.86g na2hpo4·12h2o和0.46gnah2po4·2h2o。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

26、1、本发明提出的用于检测pedv变异株抗体的胶体金试纸条采用了胶体金。胶体金方法具有灵敏度高、重复性好、特异性强等优点，并且适合大批量样本的检测。同时，该试纸条还具有如下优点：

27、(1)操作简便：应用胶体金法检测目前流行的猪流行性腹泻病毒的s蛋白抗体，操作步骤简单，普通实验人员即可掌握操作方法，易于推广。

28、(2)可用来诊断猪只是否感染pedv或者检测猪只免疫疫苗后的针对s蛋白抗体水平，特异性高，检测效果准确。

29、2、本发明提出的用于检测pedv变异株抗体的胶体金试纸条的制备方法步骤简单、耗时短、无需专用设备，制备的试纸条检测pedv变异株抗体时，肉眼可观察结果、简单、可操作性性强，适用于大规模生产。