基于病理染色测定肺内外结核病的试剂盒及测定方法与流程

本发明属于微生物培养基及制备工艺，具体涉及一种基于病理染色测定肺内外结核病的试剂盒及测定方法。

背景技术：

1、结核病是由于感染结核分枝杆菌引起的具有高致病性的慢性传染性疾病，结核病主要是经呼吸道通过吸入活动性结核患者(active tuberculosis-atb)咳嗽而产生的气溶胶传播；也能经食用生的、受污染的牛乳感染。感染后明显的临床症状表现为肺部和肺外两个方面，以肺结核常见。肺结核临床上出现的咳嗽出血，体重严重减轻，盗汗，低热，呼吸困难和胸痛等症状。而肺外感染临床表现包括脑膜炎，胸膜炎，心包炎，颈淋巴结炎和皮肤感染，以及关节，骨骼和内脏等多器官病变；结核病严重危害着人类健康和公共卫生安全。

2、结核杆菌造成肺部感染为肺结核，发生在肺部以外的部位的结核菌感染称为肺外结核；确诊感染结核病之后积极的进行抗结核杆菌治疗，绝大多数患者通过抗结核杆菌治疗都可以得到康复，而结核病的治疗首先需要准确诊断是否感染结核病。

3、现有技术中在中国食品药品检定研究院中注册登记的结核病诊断相关技术为：40个核酸pcr和耐药分子诊断试剂盒，5个菌种诊断试剂盒，29个检测结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应诊断试剂盒，36个结核特异性抗体检测试剂盒，4个结核特异性抗原检测试剂盒，41个药敏和菌培养相关试剂盒。其中who推荐的金标准是菌培养，但是耗时长(2-4周)；分子学诊断有灵敏度高的优点，但是无法区分死菌和活菌；基于抗原抗体的检测简便快捷，但是容易出现假阳性或者假阴性；基于结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应诊断试剂盒试是目前被推荐作为结核潜伏性感染的检测方法，敏感性在80％，有待进一步提高。

4、因此现有技术中的结核病感染诊断通常需要结合细菌学、临床表现、分子生物技术等多方面因素综合判断，存在培养周期长，成本耗费高，灵敏度不理想，普适性有待提高等缺陷。

5、现有技术中缺乏一种基于结核性肉芽肿特殊病理特诊的免疫荧光的染色试剂盒，以便对现有技术中的结核病诊断方法的进行补充，以弥补现有技术中面对疑似结核相关的病理切片更多的依靠病理科医生的经验进行判断的缺陷；因此需要开发一款结核性肉芽肿的病理诊断方法是非常有必要且有临床需求的。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种基于病理染色测定肺内外结核病的试剂盒及其测定方法，能够基于结核病病理染色直接进行测定判断，操作方便，检测周期短，灵敏度高，普适性好。

2、本发明所采用的技术方案为：

3、一种基于病理染色测定肺内外结核病的试剂盒,

4、包括有cd20抗体试剂、cd68抗体试剂、山羊抗小鼠igg(h&l)二抗试剂和dapi核酸染色试剂。

5、本发明还涉及一种基于病理染色测定肺内外结核病的方法,包括以下操作步骤：

6、s01，将疑似肺结核或者疑似肺外结核的组织切片固定于载玻片上；

7、s02，烤片；

8、s03，脱蜡；

9、s04，修复抗原：

10、配置1×修复液

11、16ml 50×抗原修复液；

12、800ml ddh2o；

13、s05，蒸馏水清洗组织切片，洗去抗原修复液；并在组织切片周围设置隔水圈；

14、s06，封闭：在隔水圈内滴入过氧化物酶封闭液，覆盖封闭组织切片样本；置入染色孵育盒中室温孵育10min；

15、s07，配置含0.1％ tween 20的pbs缓冲液；

16、s08，采用含0.1％tween 20的pbs缓冲液冲洗掉过氧化物酶封闭液，静置3min，再次冲洗；重复清洗三次；

17、s09，一抗孵育：在每个载玻片上的隔水圈内分别滴加鼠源一抗工作液，覆盖组织切片样本，室温孵育2.5h；

18、一抗工作液为cd20抗体试剂和cd68抗体试剂；

19、s10，采用含0.1％ tween 20的pbs缓冲液冲洗掉一抗工作液，静置3min，再次冲洗；重复清洗三次；

20、s11，二抗孵育：

21、配置二抗工作液：

22、1μl 山羊抗小鼠igg(h&l)二抗试剂；

23、1ml 含0.1％tween 20的pbs缓冲液；

24、将配制好的二抗工作液滴加到隔水圈内，覆盖样本，室温避光孵育30min；

25、s12，采用0.1％ tween 20的pbs缓冲液冲洗掉二抗工作液，静置3min，再次冲洗；重复清洗三次；

26、s13，dapi孵育

27、配置dapi染色液工作液：

28、1μl dapi核酸染色试剂

29、360μl 含0.1％ tween 20的pbs缓冲液；

30、s14，采用含0.1％ tween 20的pbs缓冲液冲洗掉dapi染色液工作液，静置3min，再次冲洗；重复清洗三次；

31、s15，甩干组织切片上的水分，滴加抗荧光猝灭封片液至组织切片的边缘处，盖上盖玻片，构成荧光染色样本；

32、s16，荧光显微镜观察，若观察到b细胞聚团和多核巨大细胞，则判定为结核性肉芽肿。

33、进一步地，所述步骤s01中还包括以下操作内容：

34、提前20min将石蜡块放到-20℃冰箱冷却增加硬度，使用全自动轮转式切片机修去表层石蜡，充分暴露目标组织，切出3μm薄片，在常温的水上摊开，用粘附载玻片背面捞到55℃带光源摊片机水面上使其充分展开，用粘附载玻片正面捞起晾干固定；组织切片贴在载玻片正中间的位置，同一个样本的组织切片粘附方向保持一致。

35、进一步地，所述步骤s04中还包括以下操作内容：

36、50×抗原修复液与ddh2o的体积比为1：50；用高压锅开到最大火力将1×修复液煮沸，液体沸腾后放入脱蜡后的切片，盖牢盖子，继续煮至高压锅上汽后关小火力，计时2.5min后关火，冷却10min，再通过流动冷水冲洗高压锅至常温。

37、进一步地，所述步骤s05中还包括以下操作内容：

38、若同一张载玻片上有两处及以上组织切片，则将所有组织切片都圈入同一个隔水圈。

39、进一步地，所述步骤s05中还包括以下操作内容：

40、通过蒸馏水检测隔水圈是否形成闭环。

41、进一步地，所述步骤s09中还包括以下操作内容：

42、同一器官同一部位样本进行组织病理染色结果比较时，he染色、免疫组化染色、免疫荧光染色的组织切片选用连续的组织切片，在切片时按顺序进行标记。

43、进一步地，所述步骤s11中还包括以下操作内容：

44、山羊抗小鼠igg(h&l)二抗试剂与ddh2o的体积比为1：1000，滴加二抗工作液前需甩干组织切片上的水分。

45、进一步地，所述步骤s12和步骤s14中还包括以下操作内容：

46、冲洗期间避光操作。

47、最后，所述步骤s015中还包括以下操作内容：

48、荧光染色样本需避光存放于4℃以下温度环境中，存放时间不大于一周。

49、本发明的有益效果为：

50、一种基于病理染色测定肺内外结核病的试剂盒及其测定方法，以cd20抗体试剂、cd68抗体试剂、山羊抗小鼠igg(h&l)二抗试剂和dapi核酸染色试剂检测疑似肺结核或者疑似肺外结核的组织切片中，是否存在b细胞聚团和多核巨大细胞，从而判断是否为结核性肉芽肿；实现基于结核病病理染色直接进行测定判断，操作方便，检测周期短，灵敏度高，普适性好。