一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体及其制备方法。所述表达载体是通过将牛乳铁蛋白肽基因接入pYES2质粒中，并用TPI启动子替代pYES2质粒的GAL1启动子所得。本发明构建的pYES2-TPI–LfcinB重组质粒可以高效稳定地分泌表达牛乳铁蛋白肽；且不需使用诱导剂，降低了生产成本和生产的复杂性。
【专利说明】一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程菌【技术领域】，具体涉及一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体及其制备方法。
【背景技术】
[0002]抗菌肽(也称为宿主防御肽)是一类在诱导条件下产生的，具有抗菌活性的两性小分子多肽，存在于所有生物中的，进化上保守的先天免疫反应的组成部分。抗菌肽是宿主免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽具有广谱抗菌作用，对病毒、寄生虫、癌细胞均有抑制作用。抗菌肽可以用于医药卫生、食品工业等方面。在医药卫生方面，抗菌肽与抗生素最大的不同之处在于抗菌肽的应用可以解决抗药性的问题。随着抗生素的滥用，解决抗药性的问题已经被提上议事日程，而近年来“超级细菌”的出现，更是使这一问题雪上加霜。具有与抗生素完全不同杀菌机理的抗菌肽的应用或许可以为这些问题的解决提供途径。在食品工业上抗菌肽的应用主要是食品添加剂。抗菌肽的杀菌能力很强，并且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有广泛的杀菌作用，因此可以代替传统的食品防腐剂，起到保鲜作用。同时又由于它是一种肽，可以被消化道消化、吸收对人体无害。此外，抗菌肽在、畜牧业、农业等各个方都有十分广泛的应用。研究其大规模生产具有十分积极的意义。本课题旨在找到一种大规模生产抗菌肽的方法，构建工程菌，并对提高其产量等其他方面作出初步探索。
[0003]目前研究和使用的蛋白质的表达系统主要有原核表达系统和真核表达系统。原核表达系统以大肠杆菌为代表，真核表达系统又以酵母表达系统和动、植物表达系统为代表。这其中，尤以大肠杆菌为代表的的原核表达系统和以酵母菌为代表的真核表达系统是研究得最为透彻的。
[0004]原核表达:选用大肠杆菌偏好的密码子，设计合成好抗菌肽基因，将抗菌肽基因克隆到含有蛋白伴体的专门的融合表达载体(如pET、pGEX、pGEM、pMAL等系列)然后转化入相应的大肠杆菌宿主细胞，最后再经诱导、酶切而得到抗菌肽基因表达的蛋白。
[0005]真核分泌表达:抗菌肽的真核表达系统主要有酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统和植物细胞表达系统，酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰和分泌能力，并且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌。近年来应用最为广泛的是毕赤酵母和酿酒酵母。随着DNA重组技术的发展，酿酒酵母已被广泛地应用于外源蛋白表达的宿主，其是真核生物，遗传背景清楚，易操作，与日常生活密切，安全，无毒素，对生物和环境不会构成威胁，可进行蛋白翻译后加工，同样可进行通过插入信号肽获得分泌表达，易于纯化，且工艺简单成本较低。但是传统宿主菌存在的葡萄糖效应问题会影响诱导表达的效率，进而影响产量，时诱导表达所使用的诱导剂大大提高了生产成本。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的在于提供一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体。
[0007]本发明的另一个目的在于提供上述牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体的制备方法。
[0008]本发明的另一个目的是提供一种牛乳铁蛋白肽组成型酿酒酵母表达菌株。
[0009]本发明的另一个目的是提供一种牛乳铁蛋白肽的生产方法。
[0010]本发明所采取的技术方案是:
一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体，其是通过将牛乳铁蛋白肽基因接入PYES2质粒中，并用磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子替代pYES2质粒的GALl启动子所得。
[0011]所述牛乳铁蛋白妝基因的序列如SEQ ID N0.3所不。
[0012]所述牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0013]一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体的制备方法，包括如下步骤:
(1)PCR扩增TPI启动子序列；
(2)PCR扩增不含GALl启动子的pYES2质粒序列；
(3)将上述两个片段进行平末端连接，得到重组表达载体；
(4)将牛乳铁蛋白肽基因序列插入到步骤(3)所得到的重组表达载体中，即得到pYES2-TP1-LfcinB重组质粒。
[0014]步骤(1)的操作为:以含有TPI启动子序列的PYX212质粒为模板，利用引物TPl:5’ -TCTTCAAGAATTGGGGA -3’ 和 TP2: 5’ -CTGTATGTGTTTTTTGTAGTTATAG -3’ 进行 PCR 扩增。
[0015]步骤(2)的操作为:以pYES2质粒为模板，设计引物:Yl:5’ -CCGGATCGGACTACTAGC-3’ 和 Y2::5’ -ACTAGTGGATCATCCCCAC-3’ 进行反向 PCR 以删除PYES2质粒中的GALl启动子。
[0016]步骤(3)的操作为JfTPI启动子PCR产物和缺失启动子pYES2质粒PCR产物按2:1混合，用T4多聚核苷酸激酶进行磷酸化后，再用T4 DNA连接酶连接。
[0017]步骤(4)的操作为:将步骤(3)得到的重组表达载体和牛乳铁蛋白肽基因序列用EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切4h，并做粘性末端连接，即得到pYES2 -TP1- LfcinB
重组质粒。
[0018]一种牛乳铁蛋白肽组成型酿酒酵母表达菌株，其是由上述的牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体转化酿酒酵母INVSCl菌株所得。
[0019]一种牛乳铁蛋白肽的生产方法，包括对上述的牛乳铁蛋白肽组成型酿酒酵母表达菌株进行诱导培养，从而得到牛乳铁蛋白肽。
[0020]本发明的有益效果是:
本发明通过通过替换启动子的方法，获得了一种可以组成型表达目的蛋白的酿酒酵母菌株。对于本发明来说，主要解决了如下问题:
(1)用组成型表达载体解决葡萄糖抑制效应问题，可以高效稳定地分泌表达牛乳铁蛋白妝；
(2)不需使用诱导剂，降低了生产成本和生产的复杂性。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为大肠杆菌DH5 α抑菌活性图，其中I为含pYES2_GALl质粒的酿酒酵母培养12h上清，2为含pYES2-TPI重组质粒的酿酒酵母培养12h上清，3为水对照，4为SC-U酿酒酵母液体培养基，5为氨苄青霉素钠。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
[0023]一、一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体的构建
UTPI启动子基因的扩增:以含有TPI启动子序列的PYX212质粒为模板，扩增引物为: TPl:5’ - TCTTCAAGAATTGGGGA -3’ (SEQ ID N0.5)；
TP2: 5’ -CTGTATGTGTTTTTTGTAGTTATAG -3’ (SEQ ID N0.6)。
[0024]反应条件:94°C预变性5min ；94°C 30s,53°C 30s,72°C 93s，30 个循环；72°C 延伸lOmin。反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收。
[0025]扩增得到的TPI启动子的序列如SEQ ID N0.1所示。
[0026]2、PCR扩增不含GALl启动子的pYES2质粒序列:以pYES2质粒为模板，设计引物:Y1:5，-CCGGATCGGACTACTAGC-3，(SEQ ID N0.7)和 Y2::5，-ACTAGTGGATCATCCCCAC-3，(SEQ ID N0.8)，进行反向PCR以删除pYES2质粒中的GALl启动子(如SEQ ID N0.2所示)。
[0027]反应条件:94°C预变性5min ;94°C 45s，59°C 45s，72°C 572s，15 个循环；72°C 延伸lOmin。反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收。
[0028]3、TPI启动子和缺失GALl启动子的pYES2质粒的平末端连接:将TPI启动子PCR产物和缺失启动子PYES2质粒PCR产物按2: I混合，用T4多聚核苷酸激酶进行磷酸化后用T4DNA连接酶连接。反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收。
[0029]4、向重组质粒中插入牛乳铁蛋白肽基因序列
将步骤(3)得到的重组表达载体和牛乳铁蛋白肽基因序列(SEQ ID N0.3)用EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切4h，并做粘性末端连接，得到牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体pYES2 -TP1- LfcinB，其序列如 SEQ ID N0.4 所示。
[0030]二、克隆转化
(I)将重组质粒PYES2 -TP1-LfcinB转化DH5a感受态细胞，氨苄青霉素钠筛选阳性克隆，少量提取质粒，并测序。
[0031](2)取酿酒酵母INVSCl感受态细胞80 μ 1，加入刚融化的测序正确的质粒1ul，充分混匀；再将菌液加入冰浴中的电击杯，迅速电击转化；最后迅速将转化菌涂布于SC-U固体培养基上，30摄氏度培养。
[0032](3)转化验证:挑取SC-U固体培养基上的酿酒酵母单克隆菌落，接种于SC-U液体培养基中进行扩大培养，并取菌液进行PCR验证，可以扩增出牛乳铁蛋白肽基因和TPI启动子片段即为转化成功的阳性菌落。
[0033]三、培养表达及活性检测
取阳性菌落的培养菌液在SC-U固体培养基中进行划线，30 °C培养，以含有PYES2-GAL1 - LfcinB重组质粒(没有替换启动子)的酿酒酵母作为对照。
[0034]挑取划线的单克隆菌落接种于SC-U液体培养基中，30°C培养12h，做大肠杆菌DH5a抑菌活性试验，试验结果见图1。试验结果表明，pYES2 -TP1- LfcinB重组质粒的抑菌圈的半径显著大于PYES2-GAL1 - LfcinB重组质粒的抑菌圈，由此可见，pYES2 -TP1-LfcinB重组质粒的表达活性得到了显著提高。
[0035]Tricine-SDS-PAGE法鉴定抗菌肽牛乳铁蛋白肽的表达效果，取12h培养上清加10%的TCA浓缩，加20 μ I上样缓冲液做SDS电泳检测，检测结果与预期一致。
[0036]以上实验数据表明，本发明构建的pYES2 -TPI _ LfcinB重组质粒可以高效稳定地分泌表达牛乳铁蛋白肽；且不需使用诱导剂，降低了生产成本和生产的复杂性。
【权利要求】
1.一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体，其是通过将牛乳铁蛋白肽基因接入PYES2质粒中，并用磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子替代PYES2质粒的GALl启动子所得。
2.根据权利要求1所述的牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体，其特征在于，所述牛乳铁蛋白肽基因的序列如SEQ ID N0.3所示。
3.根据权利要求1或2所述的牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体，其特征在于，所述牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
4.一种牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体的制备方法，包括如下步骤: (1)PCR扩增TPI启动子序列； (2)PCR扩增 不含GALl启动子的pYES2质粒序列； (3)将上述两个片段进行平末端连接，得到重组表达载体； (4)将牛乳铁蛋白肽基因序列插入到步骤(3)所得到的重组表达载体中，即得到pYES2-TP1-LfcinB重组质粒。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)的操作为:以含有TPI启动子序列的pYX212质粒为模板，利用引物TPl:5’ -TCTTCAAGAATTGGGGA -3，和TP2:5’ -CTGTATGTGTTTTTTGTAGTTATAG -3’ 进行 PCR 扩增。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)的操作为:以PYES2质粒为模板，设计引物:Y1:5’ -CCGGATCGGACTACTAGC-3’ 和 Y2::5’ -ACTAGTGGATCATCCCCAC-3’ 进行反向PCR以删除pYES2质粒中的GALl启动子。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)的操作为:将TPI启动子PCR产物和缺失启动子PYES2质粒PCR产物按2: I混合，用T4多聚核苷酸激酶进行磷酸化后，再用T4 DNA连接酶连接。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)的操作为:将步骤(3)得到的重组表达载体和牛乳铁蛋白肽基因序列用EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切4h，并做粘性末端连接，即得到PYES2 -TP1-LfcinB重组质粒。
9.一种牛乳铁蛋白肽组成型酿酒酵母表达菌株，其是由权利要求1~8任一项所述的牛乳铁蛋白肽组成型酵母表达载体转化酿酒酵母INVSCl菌株所得。
10.一种牛乳铁蛋白肽的生产方法，包括对权利要求9所述的牛乳铁蛋白肽组成型酿酒酵母表达菌株进行诱导培养，从而得到牛乳铁蛋白肽。
【文档编号】C12R1/865GK104073511SQ201410314917
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】查向东, 车媛媛, 程林春, 赵大伟, 余忠丽 申请人:广东希普生物科技股份有限公司