专利名称：白细胞介素3衍生片段的融合蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及白细胞介素3衍生片段的融合蛋白及其用途。更具体而言，本发明涉及一种包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白，其选自(l)II^mIL3m2S0N3，(2) IL2mIL3m3S0N3 或(3) II^mIL;3mlSON3，其中 IUm 是 IL2 的突变改型的衍生片段，IL3m2 是 IL3 的突变改型的衍生片段2，IL3m3是IL3的突变改型的衍生片段3，IUml是IL3的突变改型的衍生片段1，S0N3是DNA结合蛋白SON的衍生片段且富含碱性氨基酸。特别地，本发明还涉及上述融合蛋白的用途、编码核苷酸序列、包含所述编码核苷酸序列的表达重组体、包含所述重组体的工程细胞或工程菌、生产所述融合蛋白的方法、所述融合蛋白的复合物及所述复合物的用途。
背景技术：
攻克癌症一直是医学界面临的重大挑战。传统的化疗与放疗有两个重大缺陷一个是药物严重的毒副作用，第二个是治疗后容易复发。为了克服这两个缺陷，首先需要靶向杀灭肿瘤细胞。肿瘤靶向治疗是利用特异性的载体，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，把药物的杀伤作用或治疗效应尽量限定在特定的靶细胞、 组织或器官内，而不伤害正常细胞、组织或器官，从而提高疗效、减少毒副作用，具有高特异性、高效性以及低毒副作用的特点。靶向治疗的主要特点是特异性结合，本发明根据一般白血病细胞的表面富集的受体设计特异性结合的配体避免对正常细胞的损伤。IL2R在一般白血病细胞表面高表达并富集，在正常的血液细胞表面低表达，甚至不表达。因此，IL2R的配体IL2可以成为特异性结合白血病细胞的“靶向头”。其次需要靶向杀灭肿瘤干细胞。肿瘤生长是肿瘤组织中极少见的肿瘤干细胞增殖的结果。肿瘤干细胞具有自我增殖和自我分化能力，在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用，对一般的化疗与放疗不敏感，是肿瘤复发的“源泉”。如要减少肿瘤复发，相对彻底地治愈恶性肿瘤，则必须清除肿瘤干细胞。目前，肿瘤干细胞已经在多种肿瘤组织中得到了验证。如白血病、乳腺癌、脑癌、前列腺肿瘤、室管膜瘤、皮肤癌等；以肿瘤干细胞为靶标治疗肿瘤是治愈肿瘤的新希望。急性髓性白血病中的肿瘤干细胞又称之为白血病干细胞。白血病干细胞具有自我更新能力和分化能力，并且基本处于休眠状态。白血病干细胞在细胞生物学方面不同于较成熟的白血病幼稚细胞，它对常规的化疗无反应。这可能是白血病多药耐药、早期复发的主要原因。因此，特异地针对白血病干细胞的治疗策略，将为AML患者提供更有效的治疗。白血病干细胞表面包含有区别于正常造血干细胞的特异性表面标志 ⑶123(IL-3Ra )。以IL_3Ra为靶点为选择性清除白血病干细胞的有前途的治疗策略。IL3R 的配体IL3可以成为特异性结合白血病干细胞的“靶向头”。通过靶向白血病细胞和白血病干细胞，将药物的毒性作用限制于这两种细胞，可以避免对正常细胞的伤害。
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绿脓杆菌毒素PE作为人体异源的毒素蛋白质不应直接应用于导入人体血循环。 这是由于其产生的细胞杀伤作用不具备肿瘤细胞特异性，对人体可造成严重的毒副作用； 同时其作为人体异源蛋白还具有很强的免疫原性，不仅可导致抗体的迅速生成使之被中和失活，并可引起人体发生严重的过敏反应，甚至休克与死亡。因此需要把毒素导入血循环的方式由毒素蛋白质改为相应的毒素的编码基因，从而最大限度地避免毒素蛋白质导入人体血循环时所造成的严重的毒副作用问题与免疫原性问题。因此，存在对特异性靶向白血病细胞核白血病干细胞并特异性杀伤白血病细胞和白血病干细胞的药物需求。
发明内容
因此，本发明的技术目的在于开发一种能特异性靶向杀伤和/或清除白血病细胞与白血病干细胞的药物。因此，本发明的第一方面涉及一种包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白，其选自:(l)IL2mIL3m2S0N3, (2) IL2mIL3m3S0N3 ^ (3) IL2mIL3mlS0N3，其中 IUm是 IL2 的突变改型的衍生片段，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示，其中IL3m2是IL3的突变改型的衍生片段2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示，IL3m3是IL3的突变改型的衍生片段3，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示，IUml是IL3的突变改型的衍生片段1，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12，其中S0N3是DNA结合蛋白SON的衍生片段且富含碱性氨基酸，其相应的氨基酸序列如SEQ ID N0. 13所示。本发明的第二方面涉及如上所述的融合蛋白作为非病毒载体的用途，其中所述非病毒载体的用途是指所述融合蛋白利用其自身碱性氨基酸所带的正电荷与携带负电荷的核苷酸序列相互结合并利用融合蛋白中与细胞表面特异性受体结合的成分将所述核苷酸序列转运至特定的靶细胞，从而起到靶向性运输工具的作用。本发明的第三方面涉及如上所述的融合蛋白的编码核苷酸序列，其特征在于编码所述IL2m、IL3m2、S0N3的核苷酸序列在不改变所述融合蛋白氨基酸序列的情况下，根据使用的宿主细胞的密码子偏爱性相应调整所述核苷酸序列的密码子，优选地，IL3m2的DNA编码序列如SEQ ID N0. 2所示，IL3m3的DNA编码序列如SEQ ID N0. 3所示，IL3ml的DNA编码序列如SEQ ID N0. 4所示，IL2m的DNA编码序列如SEQ ID NO. 1所示，S0N3的DNA编码序列如 SEQ ID N0. 5 所示。优选地，如上所述的融合蛋白的特征在于IL2mIL3m2S0N3的氨基酸序列如SEQ ID N0. 14所示，和 / 或 IL2mIL3m3S0N3 的氨基酸序列如 SEQ ID N0. 15 所示，和 / 或 II^mIL;3mlSON3 的氨基酸序列如SEQ ID N0. 16所示，优选地，IL2mIL3m2S0N3的DNA编码序列如SEQ ID N0. 6 所示，和/或IL2mIL3m3S0N3的DNA编码序列如SEQ ID N0. 7所示，和/或IL2mIL3mlS0N3的 DNA编码序列如SEQ ID N0. 8所示。本发明的第四方面涉及包含如上所述的融合蛋白的编码核苷酸序列或如上所述的编码核苷酸序列的原核或真核表达重组体，优选地，所述表达重组体是由原核质粒载体 pCfflll 构建而成的表达型重组体 pCW-II^mIL3m2S0N3(图 8)、pCW_IL2mIL3m3S0N3 (图 15)或 pCff-IL2mIL3mlS0N3 (图 19)。本发明的第五方面涉及包含如上所述的融合蛋白的编码基因或如上所述的编码核苷酸序列或如上所述的表达重组体的工程细胞或工程菌，其中所述细胞为适用于表达重组体表达的植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，所述菌为适用于表达重组体表达的细菌、 放线菌、霉菌或酵母菌，优选地，所述菌为细菌，更优选地，所述菌为大肠杆菌，最优选地，所述菌为大肠杆菌DH5 α。优选地，如上所述的工程细胞或工程菌的特征在于所述工程菌为 pCff-IL2mIL3m2S0N3, pCff-IL2mIL3m3S0N3 或 pCW-II^mIL;3mlSON3 分别转化入大肠杆菌 DH5 α 宿主细胞获得的 DH5 α /pCff-IL2mIL3m2S0N3, DH5 α /pCff-IL2mIL3m3S0N3 或 DH5 α / pCW-II^mIL3mlS0N3。本发明的第六方面涉及制备如上所述的融合蛋白的方法，其特征在于可以以化学合成、半化学合成和/或重组表达的方式制备所述融合蛋白，优选地，以重组表达的方式制备所述融合蛋白，最优选地，通过在恰当的表达条件下培养权利要求6或7所述的工程细胞或工程菌获得所述的融合蛋白。本发明的第七方面涉及所述的融合蛋白和毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut组成的复合物，其中所述毒素基因限制性表达重组体 NFBS-miniCMV-PEIIImut在中国专利申请200610112334. 3中公开，其谱图如图40所示。本发明的第八方面涉及如上所述的复合物在制备杀伤和/或清除白血病细胞与白血病干细胞的药物中的用途。换言之，本发明旨在探索一条新的技术路线以克服传统疗法所带来的药物严重的毒副作用及治疗后容易复发两个缺陷，即一是靶向杀灭肿瘤细胞，二是靶向杀灭肿瘤干细胞。为此，本发明构建与研制融合蛋白作为非病毒载体，并将之与已有的毒素基因限制性表达重组体组装成复合物，用以准确靶向清除一般白血病细胞和白血病干细胞，而不伤及正常细胞。非病毒载体融合蛋白/毒素基因限制性表达重组体复合物，乃经由一个毒素基因的靶向性运输的设计与另一个毒素基因的限制性表达的设计，从而实现毒素基因只能在恶性肿瘤细胞以及肿瘤干细胞内表达、而不能在正常细胞内表达的意图。毒素基因的靶向性运输设计是通过受体与配体特异性结合把毒素基因运输至受体富集的肿瘤细胞及肿瘤干细胞表面。本发明提供的这组非病毒载体与已有的毒素基因限制性表达重组体组装成复合物一旦导入血循环，复合物将通过其包含的配体靶向性结合至 IL2R和/或IL3R富集的白血病细胞与白血病干细胞表面，进而通过内吞作用进入细胞内。 正常细胞表面不表达或少表达这2类受体，复合物与之不结合或者结合较少。通过将复合物限制于白血病细胞与白血病干细胞表面而避免伤及正常细胞，减少复合物的毒副作用。复合物进入细胞内以后，毒素基因是否表达受肿瘤特异性高表达的核因子-KB(NF-KB)调控，即限制性表达，本发明应用毒素基因限制性表达重组体 NFBS-miniCMV-PEIIImut ο其中，NFBS是由3个正向、3个反向克隆的NF_kB转录因子的结合位点及其旁侧的DNA序列组成。miniCMV是削帽缩短的真核启动子CMV。它必须在NF-κ B 的激活下才有启动子的活性。PEIIImut是绿脓杆菌毒素第III功能域编码序列的强毒突变型。白血病细胞与白血病干细胞高表达NF-κ B (NF-κ B+)，复合物通过受体与配体特异性靶向结合并进入白血病细胞与白血病干细胞以后，细胞内高表达的NF-K B与毒素基因表达载体上的NFBS结合，激活了 miniCMV偏动子，被激活的miniCMV驱动了其下游的毒素基因PEIIImut的高表达，进而杀伤该细胞。转录因子NF-K B在正常细胞内无活性(NF-κ B_)， 因此毒素基因即使进入了正常细胞也不会表达，该正常细胞不会被杀伤。通过毒素基因的限制性表达将复合物的毒副作用最小化。也即，本发明通过上述革命性的全新靶向性设计，成功地实现了将包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白特异性靶向白血病细胞及白血病干细胞，在所述融合蛋白通过受体、配体靶向结合到白血病细胞和白血病干细胞并通过内吞作用进入白血病细胞和白血病干细胞后，毒素基因在肿瘤特异性高表达的核因子-κ B(NF-kB)调控下进行表达，从而杀死所述白血病细胞和白血病干细胞，为以毒副作用最小化的方式实现防治复发的白血病治疗提供了一种有效的药物。
图1.表达重组体pCW_IL2mS0N3构建示意图。图 2. PCR 反应得到 NdeI-II^mIL3m2S0N3-BamHI 1.DNA 分子量标准 DL2000，2. PCRC 产物 NdeI-II^mIL3m2S0N3-BamHI，大小为 916bps。图3. Nde I 和 BamHI 双酶切鉴定克隆 pCW-II^mIL3m2S0N3 结果4·DNA分子量标准DL15000，1-3，5-7. pCff-IL2mII3m2S0N3 克隆双酶切产物。图4.表达重组体pCW-II^mIL3m2S0N3构建示意图。图5.表达重组体pCW_IL3m2S0N3构建示意图。图 6. PCR 反应得到 Nde I-IL2mIL3m3S0N3_BamH I 1.DNA 分子量标准 DL2000Plus，2. PCR 产物 Nde I-IL2mIL3m2S0N3_BamHI，大小为 916bps。图7.克隆 pCW-II^mIL3m3S0N3Nde I 和 BamHI 双酶切鉴定结果1.DNA 分子量标准 DL2000，2-6. pCW-IL2mIL3m3S0N3 克隆双酶切产物。图8.表达重组体pCW-II^mIL3m3S0N3构建示意图。图 9. PCR 反应得到 NdeI-II^mIL3mlS0N3-BamH I 1.DNA 分子量标准 DL2000Plus，2. PCR 产物 NdeI-II^mIL3mlS0N3-BamHI，大小为 916bps。图10.克隆 pCW-II^mIL3mlS0N3Nde I 和 BamHI 双酶切鉴定结果1.DNA 分子量标准 DL2000，2-6. pCff-IL2mIL3mlS0N3 阳性克隆双酶切产物。图11.表达重组体pCW-II^mIL;3mlSON3构建示意图。图12.经阳离子层析后所收集样品的SDS-PAGE电泳结果1.蛋白分子量标准(97. 4，66. 2，42. 7，29. 0，20. 1，14. 4kDa)，2.菌体裂解液(未诱导)，3.菌体裂解液(诱导)，4. IL2mIL3m2S0N3 包涵体溶解液，
5.纯化后样品。图13.经阳离子层析后所收集样品的SDS-PAGE电泳结果1.蛋白分子量标准(97. 4，66. 2，42. 7，29. 0，20. 1，14. 4kDa)，2.菌体裂解液(未诱导)，3.菌体裂解液(诱导)，4. IL2mIL3m3S0N3 包涵体溶解液，5.纯化后样品。图14.经阳离子层析后所收集样品的SDS-PAGE电泳结果1.蛋白分子量标准(97. 4，66. 2，42. 7，29. 0，20. 1，14. 4kDa)，2.菌体裂解液(未诱导)，3.菌体裂解液(诱导)，4. IL2mIL3mlS0N3 包涵体溶解液，5.纯化后样品。图15.经阳离子层析后所收集样品的SDS-PAGE电泳结果1.蛋白分子量标准(97. 4，66. 2，42. 7，29. 0，20. 1，14. 4kDa)，2.菌体裂解液(未诱导)，3.菌体裂解液(诱导)，4. IL3m2S0N3包涵体溶解液，5.纯化后样品。图16.经阳离子层析后所收集样品的SDS-PAGE电泳结果1.蛋白分子量标准(97. 4，66. 2，42. 7，29. 0，20. 1，14. 4kDa)，2.菌体(未诱导)，3.菌体(诱导)，4. IL2mS0N3包涵体溶解液，5.纯化后样品。图17.抗IL2抗体分析融合蛋白表达1. IL2mIL3m2S0N3 免疫印迹，2. IL2mIL3m3S0N3 免疫印迹，3. IL2mIL3mlS0N3 免疫印迹，4. IL3m2S0N3 免疫印迹，5. IL2mS0N3 免疫印迹。图18.琼脂糖凝胶迁移延迟试验对融合蛋白II^mIL3m2S0N3结合DNA的能力进行评价1.DNA 分子量标准 DL15000，2. DNA,3-8.不同质量比的蛋白与DNA的孵育产物。图19.琼脂糖凝胶迁移延迟试验对融合蛋白II^mIL3m3S0N3结合DNA的能力进行评价1.DNA 分子量标准 DL15, 000，
2. DNA,3-8.不同质量比的蛋白与DNA的孵育产物。图20.琼脂糖凝胶迁移延迟试验对融合蛋白II^mIL;3mlSON3的结合DNA的能力进行评价1.DNA 分子量标准 DL15000，2. DNA,3-8.不同质量比的蛋白与DNA的孵育产物。图21.琼脂糖凝胶迁移延迟试验对融合蛋白IL3m2S0N3结合DNA的能力进行评价1.DNA 分子量标准 DL15000，2. DNA,3-9.不同质量比的蛋白与DNA的孵育产物。图22.琼脂糖凝胶迁移延迟试验对融合蛋白IL2mS0N3结合DNA的能力进行评价1.DNA 分子量标准 DL15000，2. DNA,3-8.不同质量比的蛋白与DNA的孵育产物。图23.同一蛋白对于不同细胞株的转染效率。图中 23S 代表 II^mIL3m2S0N3 ；23S-G 代表 IL2mIL3m3S0N3 ；23S-GAL 代表 IL2mIL3mlS0N3 ；3S代表IL3m2S0N3 ；2S代表IL2mS0N3 (本发明下文中出现的简称所代表的非病毒载体均与此一致)；DNA代表绿色荧光蛋白EGFP-Nl表达载体。图24. RT-PCR检测PEIIImut的转录情况1.DNA 分子量标准 DL2, 000，2-4. NFBS-miniCMV-PEIIImut 转染 HUT78 后的 RT-PCR 产物(507bps, 426bps, 379bps)，5-7. NFBS-miniCMV-PEIIImut 转染 HL60 后的 RT-PCR 产物(507bps,426bps, 379bps)，8.阳性对照，9.阴性对照。图25. —般白血病细胞株HUT-78 (IL2R+IL3R—NF-κ B+)在各瞬时转染条件下所得到的MTT结果以杀伤率(％ )表示细胞杀伤活性大小图中DNA代表毒素基因限制性表达载体NFBS-miniCMV-PEIIImut(本发明下文图谱中出现的DNA均代表同一毒素基因表达载体)；显示剂量以毒素基因限制性表达重组体 NFBS-miniCMV-PEIIImut所用剂量表示(本发明下文图谱中出现的所用剂量标准均与此一 1)。图26. —般白血病细胞株HL60 (IL2R—IL3R+NF-κ B+)在各瞬时转染条件下所得到的MTT结果以杀伤率(％ )表示细胞杀伤活性大小。图27.肿瘤细胞株HEPG2 (IL2R"IL3R"NF- κ B+)在各瞬时转染条件下所得到的MTT 结果，以杀伤率(％ )表示细胞杀伤活性大小。图28.非病毒载体融合蛋白/NFBS-miniCMV-PEIIImut复合物转染HUT78细胞后
凋亡率。
图29.非病毒载体融合蛋/NFBS-miniCMV-PEIIImut复合物转染HL60细胞后凋亡率。图30.急性髓性白血病病人来源单个核细胞在各瞬时转染条件下所得到的细胞杀伤率。图31.健康志愿者来源单个核细胞在各瞬时转染条件下所得到的细胞杀伤率。图32.流式细胞仪分选⑶34+⑶123+双阳性白血病干细胞。图33.白血病干细胞纯度鉴定。图34. CD;34+CD123+白血病干细胞瑞氏染色。图35.甲基纤维素培养基培养18d后集落生成。图36.与基质细胞共培养5周后可见细胞呈鹅卵石状排列。图37.白血病干细胞在各瞬时转染条件下所得到的细胞杀伤率。图38. IL2mIL3m3S0N3/LIP/DNA对白血病干细胞的细胞杀伤作用。图39. IL2mIL3m3S0N3/Ca++/DNA对白血病干细胞的细胞杀伤作用。图40.毒素基因限制性表达载体NFBS-miniCMV-PEIIImut图谱。图41.总体设计方案示意图。图42.实验流程图。
具体实施例方式总体设计方案示意图见图41、实验流程图见图42。本发明涉及的融合蛋白作为非病毒载体与毒素基因限制性表达重组体DNA组装而成的复合物，乃经由一个毒素基因的靶向性运输的设计与另一个毒素基因的限制性表达的设计，从而实现毒素基因只能在恶性肿瘤细胞内表达、而不能在正常细胞内表达的意图。毒素基因的靶向性运输设计是通过受体与配体特异性结合把毒素基因运输到受体富集的肿瘤细胞表面。在非病毒载体融合蛋白(l)IL2mIL3m2S0N3、(2) II^mIL3m3S0N3或 (3) IL2fflIL3ffllS0N3的设计中，以受体的配体IL3、IL2或其突变衍生物作为“靶向头”，并与编码富含碱性氨基酸的DNA结合蛋白及核定位多肽的序列S0N3连接，且以基因工程的技术方法，克隆与表达并制备其相应的融合蛋白作为非病毒载体。本发明涉及的融合蛋白非病毒载体靶向结合域IL3m2、IL3ml，其受体富集于一般白血病细胞及白血病干细胞表面；其中IL3m3取自IL3第9-1 氨基酸片段，并且将 AsplOl突变为Tyr，Lysl 16突变为Tyr以增强其与IL3Ra的结合能力。IL3m2在IL3m3基础上，把Glu22突变为Wie，以去除IL3与IL_3Ri3亚基的结合能力并增加其与L3Ra的竞争性结合，IUml增强其与IL3Ra的结合能力，同时考察IL3m2、IL3m3突变位点的效果。本发明涉及的融合蛋白非病毒载体靶向结合域IL、，其受体富集于一般白血病细胞表面，取自IL2N端1-100个氨基酸，并将第58位半胱氨酸突变为丝氨酸，以获得无生物学活性但保留其结合受体能力的IL2衍生片段。本发明涉及的DNA结合域S0N3包含核定位序列和DNA结合序列，由58个氨基酸组成，富含碱性氨基酸。该片段丰富的正电荷可与富含负电荷的毒素基因重组体DNA结合成复合物；其核定位序列可介导该复合物进入细胞核。本发明运用DNA重组技术，将IL3mS基因或IL3m2基因或IL3ml基因、IUm基因、S0N3
10基因相联接，构建、表达了融合蛋白II^mIL3m3S0N3与II^mIL3m2S0N3及II^mIL;3mlSON3。毒素基因的限制性表达设计是对毒素基因特异性表达的调控。本发明应用只在恶性肿瘤细胞内具有转录调控活性的转录因子(如NF-kB)作为调控序列以将毒素基因的表达严格限制在肿瘤细胞内，从而杀灭该细胞；因该转录因子在正常细胞内无活性，毒素基因即使进入了正常细胞也不会表达，该正常细胞不会被杀伤。本发明涉及的融合蛋白作为非病毒载体与毒素基因限制性表达重组体组装而成的复合物不但靶向杀伤白血病细胞，还靶向杀伤白血病干细胞，同时不伤及正常细胞。同时，本发明还构建并研制了分别只含有单个配体的IL2mS0N3与IL3m2S0N3融合蛋白作为对照，以全面分析白细胞介素3衍生片段的融合蛋白作为非病毒载体与毒素基因限制性表达重组体组装成复合物的智能化抗癌功能。实施例^MM 1编码融合蛋白非病毒iH本的IL2二某的获得本发明以qmIL2-pG载体(在专利申请号为200610112334. 3的说明书中有详细说明)为模板，设计外引物(引物序列如SEQ ID NO. 17所示)以及上下游引物(引物序列如SEQ ID NO. 18和19所示)在5，端引入Nde I酶切位点序列CATATG及起始密码子AUG，在3’端引入融合蛋白Iinker(G4SG4T)序列GGTGGCGGAGGTTCTGGTGGC GGTGGAACC，通过重叠PCR扩增已突变的IL2基因编码从N-C端1-100个氨基酸的DNA序列获得片段NdeI-(IL2m+linker)-，大小为368bps。重叠PCR反应体系总体积60 μ 1，组成为体系 I :DNA 模板 0. 5-1 μ g, dNTPs (2mM) 4 μ 1，Pfu DNA 聚合酶 QU/μ 1)0. 25 μ 1， 10XPCR Buffer(20mMMg2+)5y 1，上游引物(10 μ Μ) 2 μ 1，下游引物(10 μ Μ) 2 μ 1，加 ddH20 至总体积50μ 1。体系II 上游引物(各10μΜ)2. 4μ 1，下游引物(各10μΜ)2. 4μ 1， dNTPs (2mM) 0. 8 μ 1，PfuDNA 聚合酶(2U/μ 1)0. 05 μ 1, IOXPCRBuffer (20mM Mg2+) 1 μ 1，加 ddH20至总体积10 μ 1 ；反应条件为体系I :95°C X 5分钟，(95°C X 1分钟一50°C X 45秒 -72V Xl分钟)X8循环，72°C X8分钟暂停，加入体系II，(95°C X 1分钟一50°C X45 秒一720C X 1分钟)X 30循环，72°C X 10分钟。本发明后续重叠PCR反应体系及条件均照此进行，各参数可能随情况作适当调整，不再一一列出。扩增完以后，取5μ 1 PCR产物于 1. 0% Agrose电泳检测，结果表明获得了大小符合预期的片段，_20°C保存。实施例2编码融合蛋白非病毒载体的S0N3基因片断的获得本发明以NCBI登录号为NM_032195的SON蛋白编码核苷酸为模板，设计外引物 (引物序列如SEQ ID NO. 20所示)以及上下游引物(引物序列如SEQ ID NO. 21和22所示) 在5，端引入融合蛋白Iinker(G4TC4T)编码序列GGTGGCGGCGGTACCGGTGGTGGCGGAACT以及碱性氨基酸KRKRS编码序列AAACGCAAGCGTAGC，在3’端引入BamH I酶切位点序列GGATCC，通过0VERLAP-PCR获得片段(linker-S0N3)-BamH 1_，大小为237bps，琼脂糖凝胶电泳证实获得的片段大小与预期相符。实施例3原核表达重组体pCW_IL2mS0N3表达重组体的构建本发明以实施例1中获得的IUm和实施例2中获得的S0N3为模板，设计外引物 (引物序列如SEQ ID N0. 23所示)以及上下游引物(引物序列如SEQ ID NO. M和25所示)进行重叠PCR以连接、扩增DNA片段。回收并纯化后用BamH I和Nde I双酶切，同样双酶切pCWlll原核表达载体，按酶连比例连接载体片段，构建pCW-IL2mS0N3表达重组体。重组体构建流程见图1，琼脂糖凝胶电泳证实了获得的片段大小与预期相符。实施例4原核表达重组体pCW-II^mIL3m2S0N3表达重组体的构建本发明以实施例1中获得的IUm和实施例2中获得的S0N3以及通过全基因合成获得的模板，用引物(弓丨物序列如SEQ ID NO. M和25所示)进行重叠PCR以连接、扩增得到DNA片段。回收并纯化后用BamHI和Nde I双酶切，同样双酶切pCWlll原核表达载体，按酶连比例连接载体片段，构建pCW-II^mIL3m2S0N3表达重组体。重组体构建流程见图4，实验结果见图2、图3。 实施例5原核表达重组体pCW_IL3m2S0N3表达重组体的构建本发明以实施例4中获得的pCW-IL2mIL3m2S0N3为模板，利用引物(引物序列如SEQ ID NO. 25和沈所示)扩增得到DNA片段。回收并纯化后用BamHI和Nde I双酶切，同样双酶切pCWlll原核表达载体，按酶连比例连接载体片段，构建pCW-IL3m2S0N3表达重组体。重组体构建流程见图5，琼脂糖凝胶电泳证实了获得的片段大小符合预期大小。实施例6原核表达重组体pCW-II^mIL3m3S0N3表达重组体的构建本发明以实施例4中获得的pCW-IL2mIL3m2S0N3为模板，利用引物(引物序列如SEQ ID NO. 27和28所示)设计突变IL3m2Glu22位点为Phe ；通过PCR扩增得到2个DNA片段。 利用引物SEQ ID NO. 24和25通过重叠PCR将获得的2个DNA片段连接。回收并纯化后用 BamHI和Nde I双酶切，同样双酶切pCWlll原核表达载体，按酶连比例连接载体片段，构建 pCff-IL2mIL3m2S0N3表达重组体。重组体构建流程见图8，实验结果见图6、图7。实施例7原核表达重组体pCW-II^mIL;3mlSON3表达重组体的构建本发明以实施例6中获得的pCW-IL2mIL3m3S0N3为模板，利用引物(引物序列如SEQ ID NO. 29和30所示)设计突变lL3m2Aspl01突变为Tyr, Lysl 16突变为Tyr ；通过PCR扩增得到2个DNA片段。利用引物(引物序列如SEQ ID N0. 24和25所示)通过重叠PCR将获得的2个DNA片段连接，回收并纯化后用BamHI和Nde I双酶切，同样双酶切pCWlll原核表达载体，按酶连比例连接载体片段，构建pCW-IL2mIL3m2S0N3表达重组体。重组体构建流程见图11，实验结果见图9、图10。实施例8 融合蛋白非病毒载体 IL2mIL3m2S0N3、IL2mIL3m3S0N3, IL2mIL3mlS0N3, IL3m2S0N3和IL2mS0N3的大肠杆菌表达分别以鉴定后的阳性表达重组体pCW-IL2mIL3m3S0N3、pCW_IL2mIL3m2S0N3、 pCff-IL2mIL3mlS0N3, pCff-IL3m2S0N3 和 pCW_II^mS0N3 转化 Ecoli 宿主菌 DH5 α，37 °C 培养过夜。同时设置PCWlll空载体及无DNA的转化体系作为阳性和阴性对照。挑取阳性转化单菌落接种含50yg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，32 °C振荡培养过夜。菌液按1 2% (ν/ν)比例转接于150 200mlLB抗性液体培养基，32°C振荡培养至菌液 OD6tltl达0.4 0.6。42 °C振荡培养4小时。菌液于6000rpm离心10分钟，收集菌体沉淀，进行SDS-PAGE，检测目的蛋白的表达。结果显示，与非诱导阴性对照相比，诱导表达质粒pCW-IL2mIL3m2S0N3 (预期蛋白分子量33. 78kD)、pCff-IL2mIL3m3S0N3 (预期蛋白分子量 33. 76kD) ,pCff-IL2mIL3mlS0N3 (预期蛋白分子量 33. 68kD)、pCW_IL3m2S0N3 (预期蛋白分子量 21. 58kD)和pCW-IL2mS0N3(预期蛋白分子量19. 52kD)均于相应条带大小附近出现特异性条带，分子量与预期一致。实施例9 融合蛋白非病毒载体 IL2mIL3m2S0N3、IL2mIL3m3S0N3, IL2mIL3mlS0N3,
12IL3m2S0N3 和 IL2mS0N3 的纯化本发明使用ACTAR蛋白纯化仪通过阳离子层析柱纯化蛋白。9.1层析步骤9. 1. 1阳离子柱的清洗与平衡起始缓冲液(A液)磷酸缓冲液(pH = 7. 4)；洗脱缓冲液(B液)磷酸缓冲液(pH = 7. 4)，2M氯化钠；利用A液清洗机器管路，并在25min内达到A液的柱平衡。再采用梯度上升的方式，在5min内达到B液的柱平衡。随后，重新瞬时恢复至A液的柱平衡。[注]所有用于层析的液体，均必须0.22μ m滤膜过滤。9. 1.2 上样上样前的样品处理将得到的复性后包涵体14，OOOrpm离心IOmin后，取上清经过 0. 22 μ m孔径滤膜，得到包涵体上样液。将A管置入制备好的得到包涵体上样液，设置流速为 lml/min。9. 1.3蛋白的洗脱及目的蛋白的收集流速始终保持在lml/min。在上样结束后实施蛋白的B液梯度洗脱，即设置B液在 20min内在阳离子柱中所占比例由0%经梯度上升至100%。随着B液比例的提高，缓冲液的极性将逐渐增加，相应极性的蛋白组分随之从固定相洗脱下来，随洗脱液出柱，同时在监测器上出现相应的明显的吸收峰。收集吸收峰所对应的洗脱液。9. 2SDS-PAGE电泳检测收集的层析样品收集层析纯化后样品，以及上柱样品、菌体样品，一同进行SDS-PAGE电泳检测，实验结果见图12、图13、图14、图15、图16。并使用ChromSCan3快速凝胶扫描仪于6^nm波长处对凝胶进行扫描，分析目的蛋白分别在上柱样品和层析收集样品中所占比例。9. 3依照上述层析步骤将待上柱样品全部层析，利用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce 公司)进行蛋白定量。将收集的纯化后的样品透析至IXPBS溶液中，定量并冻干，-70°C保存，用于随后细胞实验。实施例10融合蛋白非病毒载体的理化性质检测10. 1选择4个纯化后融合蛋白送N端氨基酸测序。结果表明其序列与理论序列相符。10. 2利用抗IL2抗体、对5种融合蛋白进行免疫印迹，进一步检测目的蛋白的表达。10. 2. 1蛋白转移电泳PVDF膜先用甲醇浸湿，再用电转缓冲液浸湿转膜所用的海绵、滤纸和PVDF膜，其中PVDF膜至少要平衡lOmin。顺序放置电转仪塑料支架、海绵、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵、电转仪塑料支架(凝胶和PVDF膜之间不要有气泡)，然后将塑料支架夹紧。 将上述系统放入电转槽中(注意使PVDF膜在正极方向)。于O°C以电流200mA转膜Ihr。10. 2. 2 杂交电转完毕的PVDF膜先于TBST溶液中洗涤5min，再于封闭液中室温封闭lhr。将膜放入用封闭液稀释的一抗溶液中，室温孵育l_2hr或4°C孵育过夜。用TBST溶液洗膜3 次，每次lOmin。将膜放入用封闭液稀释的二抗中，室温孵育1-air。再用TBST溶液洗膜3次，每次lOmin。吸去膜上多余水分，蛋白面向上放在保鲜膜上。将化学发光液均勻滴加于 PVDF膜表面，避光Imin后，小心将膜包裹。在暗室中用X光片进行显影。实验结果见图17。实施例11融合蛋白作为非病毒载体对毒素基因限制性表达重组体DNA结合能力的检测，即琼脂糖迁移延迟检测首先分别计算各融合蛋白和DNA所带电荷的数量。依据每摩尔质粒DNA所带的负电荷摩尔数，按照每个碱基带一个磷酸根基团即一个负电荷计算，双链DNA乘以2 ；蛋白质所带的负电荷按照天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)各贡献一个负电荷；赖氨酸(K)精氨酸(R)各贡献一个正电荷计算。理论上计算出蛋白质与DNA带相同电荷时的质量比。依据理论上的结果，选择合适的融合蛋白与毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut比例进行孵育并进行琼脂糖凝胶电泳，比较迁移率变化情况。当两者的比例合适并形成蛋白/DNA 复合物，则复合物的电泳迁移较单独质粒电泳明显滞后；选择复合物仅稍有泳出加样孔时所对应的非病毒载体蛋白与DNA的最小质量比(本发明下合物的制各方法以及制各比仿|丨均桉照此方法以及诵i寸此方法获得的质量比)。实验结果见图18、图19、图20、图21、 图22。实施例12融合蛋白作为非病毒载体的转染效率检测分别将复合物加入前Id已经接种好的无抗生素培养基培养的细胞株 HUT78 (IL2R+IL3IT)、HL60 (IL2ITIL3R+)、HEPG2 (IL2R"IL3R0 (每孔重复 3 次)。非病毒载体融合蛋白IL2mIL3mlS0N3, IL2mIL3m2S0N3, IL2mIL3m3S0N3，IL3m2S0N3， IL2mS0N3与绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-Nl (工作浓度为lyg/ml)以分别质量比5 1， 5 1,5 1,4 1,3 1的比例进行孵育，制备非病毒载体融合蛋白/pEGFP-m复合物。脂质体与绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-Nl (工作浓度为1 μ g/ml)按照2μ 1 1 μ g比例进行孵育，制备脂质体/pEGFP-Nl复合物。将复合物加入无抗生素培养基培养的细胞株。观察转染细胞的绿色荧光蛋白的表达情况，实验结果见表1，图23。表1计算各自转染效率并进行分析
权利要求
1.一种包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白，其选自l)IL2mIL3m2S0N3， 2) IL2mIL3m3S0N3或3) IL2mIL;3mlSON3，其中IUm是IL2的突变改型的衍生片段，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示，其中工！^&是〗!^的突变改型的衍生片段2，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 10所示，IL3m3是IL3的突变改型的衍生片段3，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示，仏；^是〗!^的突变改型的衍生片段1，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12，其中S0N3是DNA结合蛋白SON的衍生片段且富含碱性氨基酸，其相应的氨基酸序列如SEQID NO. 13所示。
2.根据权利要求1所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白作为非病毒载体的用途，该用途是指所述融合蛋白利用其自身碱性氨基酸所带的正电荷与携带负电荷的核苷酸序列相互结合并利用融合蛋白中与细胞表面特异性受体结合的成分将所述核苷酸序列转运至特定的靶细胞，从而起到靶向性运输工具的作用。
3.根据权利要求1所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的编码核苷酸序列，其特征在于编码所述IL2m、IL3m2、S0N3的核苷酸序列在不改变所述融合蛋白氨基酸序列的情况下，根据使用的宿主细胞的密码子偏爱性相应调整所述核苷酸序列的密码子，优选地，IL3m2的DNA编码序列如SEQ ID NO. 2所示，IL3m3的DNA编码序列如SEQ ID NO. 3所示，IL3ml的DNA编码序列如SEQID NO. 4所示，IL2m的DNA编码序列如SEQ ID NO. 1 所示，S0N3的DNA编码序列如SEQ ID NO. 5所示。
4.根据权利要求1所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白，其特征在于II^mIL3m2S0N3的氨基酸序列如SEQ ID NO. 14所示，和/或II^mIL3m3S0N3的氨基酸序列如SEQ ID NO. 15所示，和/或IL2mIL3mlS0N3的氨基酸序列如SEQ ID NO. 16所示，优选地，II^mIL3m2S0N3的DNA编码序列如SEQID NO. 6所示，和/或II^mIL3m3S0N3的DNA编码序列如SEQ ID NO. 7所示，和/或IL2mIL3mlS0N3的DNA编码序列如SEQ ID NO. 8所示。
5.将根据权利要求1或4所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的编码核苷酸序列或根据权利要求3所述的编码核苷酸序列重组连接到原核或真核表达载体后获得的表达重组体，优选地，所述表达重组体是由原核质粒载体PCWlll构建而成的表达型重组体 pCW-II^mIL3m2S0N3、pCff-IL2mIL3m3S0N3 或 pCW_II^mIL3mlS0N3。
6.包含根据权利要求1或4所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的编码核苷酸序列或根据权利要求3所述的编码核苷酸序列或根据权利要求5所述的表达重组体的工程细胞或工程菌，其中所述细胞为适用于表达重组体表达的植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，所述菌为适用于表达重组体表达的细菌、放线菌、霉菌或酵母菌，优选地，所述菌为细菌，更优选地，所述菌为大肠杆菌，最优选地，所述菌为大肠杆菌DH5 α。
7.根据权利要求6所述的工程细胞或工程菌，其特征在于所述工程菌为 pCW-IL2mIL3m2S0N3、pCff-IL2mIL3m3S0N3 或 pCW-II^mIL;3mlSON3 分别转化入大肠杆菌 DH5 α 宿主细胞获得的 DH5 α /pCff-IL2mIL3m2S0N3, DH5 α /pCff-IL2mIL3m3S0N3 或 DH5 α / pCW-II^mIL3mlS0N3。
8.制备根据权利要求1或4所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的方法，其特征在于可以以化学合成、半化学合成和/或重组表达的方式制备所述融合蛋白，优选地，以重组表达的方式制备所述融合蛋白，最优选地，通过在本领域已知的表达条件下培养权利要求6或7所述的工程细胞或工程菌获得所述的融合蛋白。
9.根据权利要求1或4所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白和毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut组成的复合物，其中所述毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut在中国专利申请号2006101123 . 3中公开。
10.根据权利要求9所述的复合物在杀伤和/或清除白血病细胞与白血病干细胞中的用途。
全文摘要
本发明涉及白细胞介素3衍生片段的融合蛋白及其用途。更具体而言，本发明涉及一种包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白，其选自(1)IL2mIL3m2SON3，(2)IL2mIL3m3SON3或(3)IL2mIL3m1SON3，其中IL2m是IL2的突变改型的衍生片段，IL3m2是IL3的突变改型的衍生片段2，IL3m3是IL3的突变改型的衍生片段3，IL3m1是IL3的突变改型的衍生片段1，SON3是DNA结合蛋白SON的衍生片段且富含碱性氨基酸。本发明还涉及上述融合蛋白的用途、编码核苷酸序列、包含所述编码核苷酸序列的重组体、包含所述重组体的工程细胞或工程菌、生产所述融合蛋白的方法、所述融合蛋白的复合物及所述复合物的用途。本发明为杀伤和/或清除一般白血病细胞以及白血病干细胞提供了一种全新机理的药物。
文档编号A61K47/42GK102336835SQ201010234598
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者卢丽, 卢圣栋, 李涛, 王欣, 王湛, 肖卫纯, 路金芝, 陈伟京 申请人:中国医学科学院基础医学研究所