本发明属于一种新型蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物及其在抗肿瘤作用的方面。蟾蜍毒素衍生物为一类强心剂，后来发现其具有较好的抗癌作用，但是其强细胞毒性限制了其应用。利用现代发展的adc技术,将其与接头以及靶向肽连接后，能够降低其对正常细胞毒性，选择性的到达癌细胞或组织，达到治疗癌症的目的。
背景技术：
化疗依然是包括手术、放疗、以及靶向疗法在内的最重要的抗癌手段之一。尽管高效细胞毒素很多,但癌细胞和健康细胞之间微小的差别限制了这些抗癌化合物在临床上的应用。抗体药物偶联物把单克隆抗体和高效细胞毒素完美地结合到一起,充分利用了前者靶向、选择性强,后者活性高的特点，同时又消除了前者疗效偏低和后者副作用偏大等缺陷。其中抗体是adc的制导系统，能够靶向性地把效应分子输送到肿瘤细胞，有效地提高了抗体本身对癌细胞的杀伤力。
抗体药物偶联物的概念可以追溯到100年前，adc真正意义上的概念诞生于1958年,但技术上却困难重重。第一个现代版的adc直到1975年才被报道，直到上世纪八十年代,adc的开发随着非免疫性，尤其是人源化单克隆抗体的开发才出现重大突破。kadcyla是美国fda批准的治疗固体肿瘤的第一个抗体药物偶联物,也是个体化治疗的一大突破。
bf211是一种高效细胞毒素，现有技术中还未有bf211抗体药物偶联物的相关报道。bf211具有较好的抗肝癌的效果，但是其极大的毒副作用限制了其在抗肿瘤方面的应用。
技术实现要素：
本发明提出了一种式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物及其制备方法，在蟾蜍毒素衍生物bf211上连接一个二肽接头val‐cit，合成化合物mc‐val‐cit‐pabc‐bf211；然后在mc‐val‐cit‐pabc‐bf211上连接一个具有靶向肿瘤细胞的十三肽，得到式(b)所示化合物；所述蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物能够定向输送到肿瘤细胞或肿瘤组织，并释放出药物bf211，达到定向杀死肿瘤细胞的作用。
本发明提出的蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物为c‐a54‐mc‐val‐cit‐pabc‐bf211:c111h170n22o33s，结构如式(b)所示，
本发明还提出了一种蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物的制备方法，包括：(1)在蟾蜍毒素衍生物bf211上连接一个二肽接头val‐cit，合成式(a)化合物mc‐val‐cit‐pabc‐bf211：c59h82n8o13，如反应式(1)所示：
(2)在式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211上连接一个具有靶向肿瘤细胞的十三肽，合成式(b)所示的蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211:c111h170n22o33s，如反应式(2)所示：
具体地，所述蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物的制备方法为：
(1)以四氢呋喃和n-甲基吡咯烷酮做混合溶剂，加入1当量bf211·hcl和1.1-2.0当量mc-val-cit-pabc-pnp，用1.1-2.0当量diea做碱，室温反应8-10小时，制备得到所述式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211；
(2)以n,n-二甲基甲酰胺和水做混合溶剂，加入1当量的mc-val-cit-pabc-bf211和1.2-2.5当量的c-a54，反应后得到式(b)蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物。
所述步骤(1)中，所述bf211·hcl、mc-val-cit-pabc-pnp、diea的摩尔比为1:1.1:1.1-1:2.0:2.0；优选地，为1:1.5:1.5。
所述步骤(1)中，所述反应的温度为20℃-35℃；优选地，为25℃。
其中，所述步骤(1)中，所述反应的时间为8-10小时；优选地，为8小时。
所述步骤(2)中，所述mc-val-cit-pabc-bf211、c-a54的摩尔比为1:1.2-1:2.5当量；优选地，为1:1.5。
所述步骤(2)中，所述反应的温度为35℃-45℃；优选地，为40℃。
所述步骤(2)中，所述反应的时间为8-10小时；优选地，为10小时。
所述步骤(2)中，所述具有靶向肿瘤细胞的十三肽为cagkgtpslettp，其结构如式(c)所示，
所述制备方法中，步骤(1)结束后还包括采用制备分离技术分离纯化式(a)化合物的步骤。
所述制备方法中，步骤(2)结束后还包括采用制备分离技术分离纯化式(b)化合物的步骤。
本发明的制备分离技术是指利用不同极性化合物在制备仪上制备柱中吸附性的不同，利用流动相进行洗脱分离的过程。
更具体地，所述式(b)蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物的制备方法，包括：
(1)首先合成化合物mc‐val‐cit‐pabc‐bf211：c59h82n8o13，结构如式(a)所示：
化合物mc-val-cit-pabc-bf211在蟾蜍毒素衍生物bf211上连接了一个二肽接头val-cit，使其具有与蟾蜍毒素衍生物具有相近的抗肿瘤作用。
(2)合成式(b)所示的蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物，c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211:c111h170n22o33s，
化合物c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211是在化合物式(a)mc-val-cit-pabc-bf211的基础上连接一个具有靶向肿瘤细胞的十三肽，解决了其水溶性差的问题。其抗肿瘤作用相对于式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211有了一定的提高。
具体地，所述蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物的制备方法包括：
(1)式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211的制备:以四氢呋喃和n-甲基吡咯烷酮做混合溶剂，加入1当量bf211·hcl和1.5当量mc-val-cit-pabc-pnp，用1.5当量diea做碱，25℃反应8个小时，制备得到所述式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211，分离纯化后用于下一步反应。
(2)式(b)蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211的制备：以n,n-二甲基甲酰胺和水做混合溶剂，加入1当量的mc-val-cit-pabc-bf211和1.5当量的c-a54，40℃反应10小时，得到所述蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211。
本发明还提出了式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提出了式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物在制备抗肝癌、胃癌、人原髓细胞白血病药物中的应用。
本发明还提出了式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物在制备抗bel-7402肝癌细胞、mgc-803胃癌细胞、hl60人原髓细胞白血病细胞药物中的应用。
其中，所述的蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物的有效剂量为几十纳摩尔级别即可发挥对肝癌、胃癌及白血病细胞的杀伤作用。
本发明还提出了一种药物组合物，其包括式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物和药学上可接受的载体。本发明药物组合物中以式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物作为活性成分。根据本发明可以将治疗有效量的式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物，也可以添加其他与式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物没有拮抗作用的抗肿瘤新生药物。其制剂可以是药学上的任意一种剂型，包括但不限于滴剂、片剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂、丸剂、水剂、口服液、注射液、脂质体、栓剂等。
本发明药物组合物中可含有常规药学上可接受的辅助物质、稳定剂、湿润剂或其它常用的添加剂，例如，乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸镁、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可脂、乙二醇、抗坏血酸、甘露醇等。
式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物可通过口服、肠胃外、吸入式喷雾或通过植入式贮存器给药。“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜腔内、胸骨内、鞘内、病灶内或输入技术。
口服可用固体或液体状的剂量单位，如末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片等剂型进行给药。
末剂是将本发明式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物磨成适当额细度而制成。散剂是将本发明式(b)所示蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物磨成适当的细度，然后与同样细度的药用载体(如载体、甘露糖醇之类可食性碳水化合物等)混合制成。根据需要，也可混入矫味剂、防腐剂、分散剂、着色剂、香料等物质。
胶囊剂是将如上所述制成粉末状的末剂或片剂部分所述的颗粒化的物质填充到明胶胶囊外壳中而制成。也可以将润滑剂和助流剂等混合到粉末状物质中，然后在胶囊中进行填充操作。若添加助溶剂和崩解剂等，如聚乙二醇，碳酸钠，可改善胶囊摄取时的药效。
本发明还提出了一种化合物mc-val-cit-pabc-bf211其结构如式(a)所示；
本发明的有益效果包括：本发明提出的蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物，通过将bf211与接头和靶向肽连接后，能够定向输送到肿瘤细胞或肿瘤组织，并释放出药物bf211，达到定向杀死肿瘤细胞的作用，具有水溶性好、抗肿瘤效果好的特点。
本发明蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物的制备方法具有收率高、反应完成性好、易操作等优点，为类似化合物合成提供有效方法。
本发明中选用的十三肽具有特异性靶向肝癌组织的作用，其属于小分子化合物，对肿瘤组织的粘附性强，对肿瘤细胞膜的通透性好，克服了现有技术中使用的单克隆抗体分子量大、通透性差的缺点；选用的二肽接头val‐cit在正常组织处很稳定，而在肿瘤细胞或组织中易被组织蛋白酶b切断，从而释放出药物分子，达到治疗癌症的目的，克服了普通接头在血液循环中稳定性差、在肿瘤组织中不易被酶剪切的缺点。因此，本发明制备的化合物蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物c‐a54‐mc‐val‐cit‐pabc‐bf211具有较高的意义。
在合成mc‐val‐cit‐pabc‐bf211时，利用mc‐val‐cit‐pabc‐pnp作为原料，其反应活性高，使反应进行快，且反应彻底，和其他合成方法相比收率有了显著提高；在靶向肽连接过程中，后处理选用制备分离技术，克服了产物极性大、难分离的弊端，使得到的产物纯度高。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：mc-val-cit-pabc-bf211的合成
合成反应:在烧瓶内加入260mgmc-val-cit-pabc-pnp和80mgbf211·hcl，用9.6ml四氢呋喃和1.6mln-甲基吡咯烷酮溶解，再加入415.2μldiea,25℃反应8个小时。制备分离提纯，冻干机干燥，得108.6mg白色固体mc-val-cit-pabc-bf211，收率65.1％。
1hnmr(400mhz,dmso)δ9.94(s,2h),7.97(d,j＝68.7hz,3h),7.87–7.71(m,2h),7.64–7.38(m,4h),7.38–6.96(m,5h),6.78(d,j＝128.0hz,3h),6.23(d,j＝9.3hz,2h),5.92(s,2h),5.31(d,j＝39.7hz,3h),4.83(d,j＝27.8hz,3h),4.82(d,j＝38.0hz,5h),5.11–4.35(m,6h),5.11–4.10(m,9h),5.11–3.44(m,14h),5.11–3.41(m,15h),5.11–2.90(m,65h),5.11–2.56(m,70h),5.11–2.97(m,64h),5.11–2.17(m,83h),5.11–1.98(m,87h),5.11–2.12(m,84h),5.11–2.18(m,83h),5.11–1.55(m,101h),5.11–1.45(m,107h),5.11–0.40(m,158h),0.53(s,5h),0.53(s,5h),-0.03(d,j＝27.8hz,3h),-0.11–-0.60(m,2h).
实施例2蟾蜍毒素衍生物的抗体药物偶联物c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211的合成
合成反应:在烧瓶内加入65mgmc-val-cit-pabc-bf211和110.5mgc-a54，用6.5mln,n-二甲基甲酰胺和2.2ml水溶解，油浴控温40℃反应10个小时。制备分离提纯，冻干机干燥，得到40.5mg白色固体c-a54-mc-val-cit-pabc-bf211，收率29.2％。
1hnmr(400mhz,dmso)δ9.94(d,j＝42.9hz,18h),8.43(s,3h),8.33(d,j＝52.4hz,5h),9.01–8.14(m,7h),8.18(dd,j＝109.5,56.9hz,9h),9.01–7.90(m,10h),8.02(ddd,j＝69.9,44.3,35.6hz,12h),9.01–7.68(m,13h),9.01–7.66(m,13h),7.66–7.51(m,2h),7.51–7.21(m,3h),6.29(d,j＝9.7hz,4h),7.66–4.06(m,28h),7.66–3.92(m,30h),7.66–3.76(m,33h),5.37(d,j＝39.0hz,3h),5.37(d,j＝39.0hz,2h),7.66–3.67(m,36h),4.94(s,3h),5.28–4.36(m,8h),4.30–3.45(m,18h),4.24–3.45(m,16h),7.66–1.72(m,88h),2.95(s,1h),2.77(s,1h),2.67(s,1h),2.50(s,12h),2.97–1.72(m,28h),2.73–1.90(m,19h),1.79(dd,j＝38.9,27.7hz,6h),1.59(d,j＝7.4hz,3h),1.50(s,3h),1.40–1.29(m,4h),1.23(s,4h),1.09(s,3h),1.00(d,j＝5.0hz,1h),0.90(ddd,j＝17.9,13.5,6.7hz,13h),0.60(s,5h),0.00(t,j＝25.1hz,5h).
实施例3
实施例1制备的式(a)化合物和实施例2制备的式(b)化合物的抗肿瘤细胞增殖效果：
仪器和试剂：细胞株：mgc-803、hl-60(atcc，美国)、bel-7402(中科院细胞库，中国)，rpmi-1640培养基、imdm培养基(gibco，美国)，胎牛血清(hyclone，南美)，96孔培养板(thermo，美国)，酶标仪(spectramaxm5，moleculardevices)srb(sigma，中国)，tris(上海西巴斯生物技术开发有限公司，中国)
(1)bel-7402肝癌细胞株/mgc-803胃癌细胞株/hl60人原髓细胞白血病细胞制成单细胞悬液，180ul接种于96孔培养板中，co2培养箱(37℃,5％co2，95％空气)过夜培养；
(2)化合物0.03–10um按浓度梯度加入细胞(20ul/孔)，对照组加入1‰dmso，co2培养箱中培养72h
(3)培养72h后倾去培养液，用10％冷tca固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的srb(sigma)4mg/ml溶液100ml/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。
(4)最后加入150ml/孔的tris溶液,酶标仪560nm测各孔od值，数据处理采用graphpadprism5.
结果：如表1所示，式(a)化合物mc-val-cit-pabc-bf211对多种不同类型肿瘤细胞增殖有较好的抑制作用；式(b)化合物对于肝癌、胃癌、白血病等多种肿瘤细胞株都表现出了良好的细胞增殖抑制效果，可在极低浓度发挥杀伤作用。综上可见，式(b)化合物较式(a)化合物活性高，对肝癌、胃癌、白血病细胞杀伤性更好。
表1
实施例3记载了化合物的抗肿瘤细胞增殖效果，式(a)和式(b)化合物都具有一定的抗肿瘤作用，但是式(b)化合物其肝癌细胞株bel-7402ic50＝0.089um，胃癌细胞株mgc-803ic50＝0.015um，白血病细胞hl-60ic50＝0.91um，抗癌效果明显优于式(a)化合物几倍到几十倍。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。