一种多巴胺及其衍生物快速交联表面活性剂‑酶纳米复合催化剂的制备方法及其应用与流程

本发明属于酶的固定化技术领域，具体涉及一种多巴胺及其衍生物快速交联表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法及其应用。

背景技术：

酶固定化不仅能够显著提高酶的稳定性，而且可以实现酶的回收再利用，大大降低酶的使用成本。在酶固定化过程中，常使用戊二醛作为交联剂，然而，已有研究表明：固定化酶活力与戊二醛用量成反比，过量的戊二醛会引起不必要的酶分子间交联，而过度的交联会扭曲酶的结构，致使酶活力降低,此外，戊二醛的生物毒性，限制了其应用范围。因此，急需寻找一种简单的、无毒的、温和的方法进行酶的高效绿色固定化。

多巴胺是一种生物神经递质，可在碱性有氧溶液中发生自聚合反应，从而形成一层强力粘附在固体材料表面的聚多巴胺层。由于多巴胺具有优良分散性、生物相容性和温和反应条件，已作为一种理想的黏合材料用于酶固定化领域。

申请号201110460474.0的中国专利公开了一种采用戊二醛交联固定化修饰脂肪酶novozyme435的方法，该制备方法是将脂肪酶novozyme435以戊二醛为交联剂，在20-50℃、40-240rpm下进行交联反应15-120min，化学交联后得到的二次修饰后脂肪酶novozy435的稳定性得到了提高，经二次修饰后的novozyme435重复使用5次后所得产率较未交联修饰的脂肪酶novozyme435提高了49.3%。

上述及现有的交联固定化酶催化剂的主要交联剂是戊二醛溶液，所制备得到的二次修饰后的固定化酶，虽然重复利用率得到了提高，但固定化酶在戊二醛的作用下，酶的结构发生扭曲，致使酶活力降低，此外，戊二醛的生物毒性，限制了其应用范围，因此，急需寻找一种简单的、无毒的、温和的方法进行固定化酶的高效绿色二次修饰。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多巴胺及其衍生物快速交联表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法及其应用，该方法以多巴胺或其衍生物为交联剂，在磁力搅拌的作用下提供溶解氧进行氧化自聚-交联，是一种简单的、无毒的、温和的、高效绿色的二次修饰固定化酶。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种多巴胺及其衍生物快速交联表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法，首先在室温水相快速共沉淀制备得表面活性剂-酶纳米复合催化剂，然后以多巴胺或其衍生物为交联剂，搅拌下进行自聚-交联，当表面活性剂-酶纳米复合催化剂外包裹黑色聚多巴胺时，离心冷冻干燥，即得多巴胺交联包埋后的“核壳”状的表面活性剂-酶纳米复合催化剂。

作为改进的是，所述多巴胺或其衍生物为盐酸多巴胺。

上述一种多巴胺及其衍生物快速交联表面活性剂-酶纳米复合催化剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，室温水相快速共沉淀制备得表面活性剂-酶纳米复合催化剂

1）配制0.01-1mmol/ml表面活性剂水溶液，室温下，以100~150rpm的速度边搅拌边滴加游离酶水溶液至澄清，得混合液；

2）将混合液边搅拌边滴加至0.01-1mmol金属离子盐溶液，室温下以100~150rpm的速度搅拌反应30-60min后得表面活性剂-酶的纳米复合催化剂水溶液；

3）将表面活性剂-酶的纳米复合催化剂水溶液离心，并用去离子水冲洗1-3次，洗去未吸附的游离酶，真空冷冻干燥至恒重即可得到表面活性剂-酶纳米复合催化剂；

步骤2，多巴胺自聚-交联

取20-200mg表面活性剂-酶纳米复合催化剂在超声作用下均匀分散在10-100ml摩尔浓度为10-100mmol的tris-hcl缓冲液中，添加10-40mg的多巴胺或其衍生物，室温下磁力搅拌24h后离心，并用去离子水洗涤1-3次，真空冷冻干燥至恒重即得多巴胺交联包埋后的“核壳”状的表面活性剂-酶纳米复合催化剂。

优选的是，步骤1的1）中所述表面活性剂为脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、甘氨脱氧胆酸纳或鹅脱氧胆酸钠中任一种；游离酶为南极假丝酵母脂肪酶a、南极假丝酵母脂肪酶b、褶皱假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、疏棉状嗜热丝抱菌脂肪酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶中一种或多种组合，所述游离酶水溶液中游离酶与水的质量比为0.1~1:50。

优选的是，步骤1的1）中以表面活性剂水溶液为参照物，所述游离酶水溶液的添加量为0.005~1ml/ml。

优选的是，步骤1的2）中所述金属离子为co²⁺、ca²⁺、zn²⁺、mn²⁺、ba²⁺、cu²⁺、ni²⁺、sn²⁺或mg²⁺中任一种。

优选的是，步骤1的3）中离心5~15min，离心时转速为4000~8000rpm，真空冷冻干燥的真空度为1.3~13pa，温度为-85℃~-10℃。

优选的是，步骤2中tris-hcl缓冲液的ph为8，磁力搅拌速度为100~150rpm，搅拌时间为1-36h，离心时转速为4000~8000rpm离心5-15min，真空冷冻干燥的真空度为1.3~13pa，温度为-85℃~-10℃。

上述多巴胺及其衍生物快速交联表面活性剂-酶纳米复合催化剂在纯有机相或水油两相生物催化中的应用。

与现有技术相比，本发明采用多巴胺自聚-交联，附着在表面活性剂-酶纳米复合催化剂的表面，从而将表面活性剂-酶纳米复合催化剂包埋起来，使得到的表面活性剂-酶纳米复合催化剂具有一定的机械强度，增强其结构稳定性、重复利用率及耐受性，大大降低酶的使用成本，尤其适合在纯有机相生物催化中的应用。

附图说明

图1为实施例1的扫描电镜图，其中，（a）为crl-msnc，（b）为pda@crl-msnc；

图2为实施例1的透射电镜图，其中，（a）为crl-msnc，（b）为pda@crl-msnc；

图3为实施例1中crl、crl-msnc和pda@crl-msnc的耐有机溶剂稳定性；

图4为实施例2扫描电镜图，其中，（a）为papain-msnc，（b）为pda@papain-msnc；

图5为实施例1中crl-msnc与pda@crl-msnc在水溶液中的重复利用率；

图6为实施例1中crl、crl-msnc和pda@crl-msnc催化合成维生素e琥珀酸酯的转化率；

图7为实施例1中crl-msnc和pda@crl-msnc在dmso中的重复利用率。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种盐酸多巴胺快速交联改性脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-co²⁺纳米复合催化剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，室温水相快速共沉淀制备表面活性剂-酶纳米复合催化剂

1）表面活性剂改性游离酶

配制0.1mmol/ml脱氧胆酸钠水溶液10ml，室温下，以120rpm速度边搅拌边以1ml/s的滴加速率滴加20mg/ml假丝酵母脂肪酶水溶液（crl）2ml，搅拌至溶液澄清，得混合液；

2）将混合液边搅拌边以1ml/s的滴加速率加至0.2mmol六水合氯化钴水溶液，室温下以120rpm的速度搅拌反应30min后得脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-co²⁺纳米复合催化剂水溶液；

3）将脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-co²⁺纳米复合催化剂水溶液用8000rpm的速度离心，并用去离子水冲洗2次，洗去未吸附的游离酶，真空冷冻干燥至恒重即可得到脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-co²⁺纳米复合催化剂（crl-msnc），其中，真空度为1.3~13pa，温度为-85℃~-10℃。

步骤2，多巴胺自聚-交联改性

取100mgcrl-msnc，超声作用5min使其均匀分散在10ml10mm的tris-hcl（ph8.0）缓冲液中，添加20mg的盐酸多巴胺，在室温下以120rpm的转速磁力搅拌交联24h；

将crl-msnc水溶液用8000rpm的速度离心，并用去离子水洗涤2次，洗去未反应的多巴胺，真空冷冻干燥至恒重即得多巴胺交联改性后“核壳”状脱氧胆酸-假丝酵母脂肪酶-co²⁺纳米复合催化剂（pda@crl-msnc），其中，真空度为1.3~13pa，温度为-85℃~-10℃。

本实施例制备的crl-msnc和pda@crl-msnc在电镜下的扫描图如图1-2所示，从图中可以看出，crl-msnc是一种球状颗粒，其平均粒径在80nm左右。而经过聚多巴胺改性后生成的“核壳”状的pda@crl-msnc也呈现相类似的形状，其粒径范围在100nm左右，表明聚多巴胺已经成功地粘附在其表面，且厚度约为20nm。

如图5所示，本实施例crl-msnc和pda@crl-msnc在水溶液中经过10次重复利用后，crl-msnc的相对酶活低于80%，而pda@crl-msnc的相对酶活仍能维持93%以上。天然crl与pda@crl-msnc的最适ph均为7.0，但是由于纳米载体对crl的保护作用，使得pda@crl-msnc对ph的适应范围更加广泛，其在水溶液中最佳的催化ph范围为6.0-8.0。

如图3所示，经过乙醇、甲醇与二甲基亚砜处理后，crl-msnc与pda@crl-msnc的相对活力分别能保持在68%、88%以上，而在相同的处理条件下，游离crl只能保持较少的活力（<10%）。

实施例2

一种盐酸多巴胺快速交联改性脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺纳米复合催化剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，室温水相快速共沉淀制备表面活性剂-酶纳米复合催化剂

1）表面活性剂改性游离酶

配制0.1mmol/ml脱氧胆酸钠水溶液10ml，室温下，以120rpm速度边搅拌边以1ml/s的滴加速率滴加20mg/ml木瓜蛋白酶水溶液（papain）2ml，搅拌至溶液澄清，得混合液；

2）将混合液边搅拌边以1ml/s的滴加速率加至0.2mmol四水合氯化锰水溶液，室温下以120rpm的速度搅拌反应30min后得脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺纳米复合催化剂水溶液；

3）将脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺纳米复合催化剂水溶液用8000rpm的速度离心，并用去离子水冲洗2次，洗去未吸附的游离酶，真空冷冻干燥至恒重即可得到脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺纳米复合催化剂（papain-msnc），其中，真空度为1.3~13pa，温度为-85℃~-10℃。

步骤2，多巴胺自聚-交联改性

取100mgpapain-msnc，超声作用5min使其均匀分散在10ml10mm的tris-hcl（ph8.0）缓冲液中，添加20mg的盐酸多巴胺，在室温下以120rpm的转速磁力搅拌交联24h；

将papain-msnc水溶液用8000rpm的速度离心，并用去离子水洗涤2次，洗去未反应的多巴胺，真空冷冻干燥至恒重即得多巴胺交联改性后“核壳”状脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺纳米复合催化剂（pda@papain-msnc），其中，真空度为1.3~13pa，温度为-85℃~-10℃。

本实施例制备的papain-msnc和pda@papain-msnc在电镜下的扫描电镜图如图2所示，从图中可以看出，papain-msnc是平均粒径为50nm的球状颗粒，pda@papain-msnc是部分解散的扫把状，在水溶液经过10次重复利用后，papain-msnc的相对酶活低于83%，而pda@papain-msnc的相对酶活仍能维持94%以上，且天然papain与pda@papain-msnc的最适ph均为5.0，pda@papain-msnc在水溶液中最佳的催化ph范围为3.5-8.0。

实施例3

一种盐酸多巴胺快速交联改性甘氨脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺纳米复合催化剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，室温水相快速共沉淀制备表面活性剂-酶纳米复合催化剂

1）表面活性剂改性游离酶

配制0.1mmol/ml甘氨脱氧胆酸钠水溶液10ml，室温下，以120rpm速度边搅拌边以1ml/s的滴加速率滴加20mg/ml木瓜蛋白酶水溶液2ml，搅拌至溶液澄清，得混合液；

2）将混合液边搅拌边以1ml/s的滴加速率加至0.2mmol四水合氯化锰水溶液，室温下以120rpm的速度搅拌反应30min后得甘氨脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺纳米复合催化剂水溶液；

3）将甘氨脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺纳米复合催化剂水溶液用8000rpm的速度离心，并用去离子水冲洗2次，洗去未吸附的游离酶，真空冷冻干燥至恒重即可得到甘氨脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺纳米复合催化剂（papain-甘氨脱氧胆酸-mn²⁺）。

步骤2，多巴胺自聚-交联改性

取100mgpapain-msnc，超声作用5min使其均匀分散在10ml10mm的tris-hcl（ph8.0）缓冲液中，添加20mg的盐酸多巴胺，在室温下以120rpm的转速磁力搅拌交联24h；

将papain-msnc水溶液用8000rpm的速度离心，并用去离子水洗涤2次，洗去未反应的多巴胺，真空冷冻干燥至恒重即可得多巴胺交联改性后“核壳”状甘氨脱氧胆酸-木瓜蛋白酶-mn²⁺纳米复合催化剂（pda@papain-甘氨脱氧胆酸-mn²⁺）。

本实施例制备得到的papain-甘氨脱氧胆酸-mn²⁺和pda@papain-甘氨脱氧胆酸-mn²⁺在电镜下的扫描图显示，papain-甘氨脱氧胆酸-mn²⁺是平均粒径为80nm的球状颗粒，pda@papain-甘氨脱氧胆酸-mn²⁺是部分解散的扫把状，在水溶液经过10次重复利用后，papain-甘氨脱氧胆酸-mn²⁺的相对酶活低于76%，而pda@papain-甘氨脱氧胆酸-mn²⁺的相对酶活仍能维持90%以上，且天然papain与pda@papain-甘氨脱氧胆酸-mn²⁺的最适ph均为5.0，pda@papain-甘氨脱氧胆酸-mn²⁺在水溶液中最佳的催化ph范围为4.0-8.0。

实施例4

用实施例1所得crl-msnc和pda@crl-msnc与天然crl在纯有机相中催化合成维生素e琥珀酸酯的应用，包括以下步骤：

第一步，取10ml的塑料管，依次加入0.2mmol的维生素e、1mmol的丁二酸酐、400μl的天然crl或者含有相等蛋白含量的crl-msnc与pda@crl-msnc、5ml的有机溶剂；

第二步，将步骤1中得到的混合物，密闭处理后于55°c水浴加热，以120rpm的速率搅拌反应；

第三步，反应72h后，利用美国安捷伦高效液相色谱系统测定底物和产物的含量。

通过高效液相色谱系统的测定底物和产物的含量来计算催化合成维生素e琥珀酸酯转化率，当反应温度为55°c，搅拌速率为800rpm时，在相同的反应条件下，crl-msnc与pda@crl-msnc催化合成维生素e琥珀酸酯转化率可以达到55%（图6），是天然crl催化合成的4倍以上，验证了本发明制备的pda@crl-msnc在纯有机相中拥有与crl-msnc同样优越的催化效率。

其中高效液相色谱系统，色谱柱为c-18反相柱（250mm×4.6mm,5μm），流动相为甲醇和乙酸溶液（体积比为50:0.3），流速为1.0ml/min，柱箱温度控制在36°c，检测器为二极管阵列及检测器，检测波长为285nm。

实施例5

用实施例1所得的crl-msnc和pda@crl-msnc，测定含有相等蛋白含量的crl-msnc与pda@crl-msnc在dmso中催化合成维生素e琥珀酸酯的重复利用率，包括以下步骤：

第一步，取10ml的塑料管，依次加入0.2mmol的维生素e、1mmol的丁二酸酐、含有相等蛋白含量的crl-msnc与pda@crl-msnc、5ml的有机溶剂；

第二步，将步骤1中得到的混合物，密闭处理后于55°c水浴加热，以120rpm的速率搅拌反应；

第三步，搅拌反应4h后，将步骤2中反应的混合物在10000rpm下离心10min，使用高效液相色谱系统测定上清液中底物和产物的含量；

第四步，将步骤3中离心得到的沉淀，用去离子水洗涤2次，用于下一批酶反应，反复进行10次催化来计算其的重复利用率。

结果如图7所示，通过高效液相色谱系统的测定底物和产物的含量来计算催化合成维生素e琥珀酸酯转化率，当反应温度为55°c，搅拌速率为800rpm时，在相同的反应条件下，经过10次重复利用后，pda@crl-msnc的酶活只下降了55%，表明在这种反应系统中pda@crl-msnc拥有着良好的重复利用性能。而与之相比，crl-msnc在反应30min后就已经被dmso完全溶解，造成crl-msnc只经过一次反应后其酶活就受到极大的降低。进一步验证了本发明制备的pda@crl-msnc在纯有机相中拥有更优越的催化效率。

通过实施例1-3可以看出，本发明采用多巴胺自聚-交联，附着在表面活性剂-酶纳米复合催化剂的表面，从而将表面活性剂-酶纳米复合催化剂包埋起来，使得到的表面活性剂-酶纳米复合催化剂具有一定的机械强度，增强其结构稳定性、重复利用率及耐受性，大大降低酶的使用成本，尤其适合在纯有机相生物催化中的应用。在水溶液中经过10次重复利用后，pda@crl-msnc的相对酶活能维持在93%以上，pda@papain-msnc的相对酶活能维持在94%以上，pda@papain-甘氨脱氧胆酸-mn²⁺的相对酶活能维持在90%以上；通过实施例4-5可以看出，本发明利用多巴胺交联改性后制备得到的“核壳”状表面活性剂-酶纳米复合催化剂在油水两相生物催化中有更优越的催化效率，尤其是在纯有机相中有着广泛的应用前景。