本发明属于食品加工领域，涉及酶解蜂王浆的制备方法，还涉及由该方法制得的产品和应用。
背景技术：
我国上糖尿病发病人群逐年增高，糖尿病发病最重要的因素是人们体内的胰岛素分泌不足。虽然西药目前是治疗糖尿病最好的手段，但是也有一些限制性和副作用，如会引发血糖偏低和机体酸中毒的症状，而且糖尿病患者会存在一些长期使用药物治疗而无疗效的并发症，在完全治疗和防治等方面还缺乏特效的手段和药品。目前，糖尿病饮食疗法是当前糖尿病无法根治阶段食疗的研究和应用方向。其中用蜂王浆来进行糖尿病的预防和治疗，取得了一定的效果。新鲜蜂王浆含有蛋白质12％-15％、脂质3％-6％、糖类10％-16％，其他的维生素、氨基酸及矿物质占2％-3％。其中，蛋白质在蜂王浆的干物质中含量最高，约30％-50％，并含有高生物活性的酶及多肽。然而，极差的蛋白质稳定性及酸涩辛辣的不良口感是制约蜂王浆产业进一步发展的关键问题。因此，在新鲜蜂王浆营养保健功能的基础上，通过酶解技术，改善蜂王浆的理化特性及感官指标，对蜂王浆的深度开发及利用具有重要意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种酶解蜂王浆的制备方法，该方法简单，反应条件温和；本发明的目的之二在于提供由上述方法制得的酶解蜂王浆；本发明的目的之三在于提供酶解蜂王浆的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
酶解蜂王浆的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备蜂王浆水溶液：取新鲜蜂王浆，加水溶解，制得蜂王浆水溶液；
(2)酶解：将步骤(1)制备得的蜂王浆水溶液加入氯化钙，然后调节蜂王浆溶液ph＝7.5，再加入蛋白酶k，酶解，反应结束灭酶，得酶解蜂王浆。
本发明步骤(1)中，蜂王浆与水的料液比为1：9。
本发明步骤(2)中，所述氯化钙加入量为加入后氯化钙终浓度为0.1mol/l。
本发明步骤(2)中，调节蜂王浆溶液ph用1mol/l的naoh调节。
本发明步骤(2)中，蛋白酶k加入量按加入后蛋白酶k终浓度为60ug/ml。
本发明步骤(2)中，所述酶解液在55℃温度下搅拌反应4h。
本发明步骤(2)中，所述灭酶为100℃下加热5min。
2.由所述的制备方法制得的酶解蜂王浆。
3.所述酶解蜂王浆在制备降糖的食品或保健品中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了酶解蜂王浆的制备方法及其产品和应用，该方法使用蛋白酶k进行酶解，蛋白酶k属于丝氨酸蛋白酶类，是通过林伯氏白色念球菌(tritirachiumalbumlimber)生产的一类蛋白酶，主要应用于分子生物学及细胞生物学等相关生化试验，在提取组织dna及rna的过程中具有十分重要的作用。相比于传统酶解改性技术使用的酶类，蛋白酶k通过白色念球菌进行生产，具有统一的生产规格、稳定的水解活性及成熟的反应条件及反应体系，而氯化钙作为蛋白酶k的稳定剂也能在蜂王浆产品的开发利用中同时使用，以获得富含钙离子的高附加值产品。本发明方法简单，条件温和，制得的酶解蜂王浆降糖效果优于未经处理的蜂王浆，对蜂王浆制品开发及其医疗保健开发具有重要意义。
具体实施方式
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明实施例使用的试剂如下：四氧嘧啶(华中海威)；血糖检验试纸，尿糖检验试纸(三诺生物)；生理盐水；清洁级小鼠(11-40g)(重庆市畜牧科学院)；蛋白酶k(merck，40u/mg)；氯化钙；蒸馏水；氢氧化钠；盐酸；蜂王浆(重庆佳联生物技术有限公司)；pbs磷酸缓冲液配置：8.150g/lnacl、0.201g/lkcl、1.420g/lna2hpo4、0.239g/lkh2po4；bradford蛋白质定量试剂盒(tiangen)。
实施例1、酶解蜂王浆的制备方法
(1)制备蜂王浆水溶液：称取25g蜂王浆，加入225ml蒸馏水溶解，料液比(质量体积比，单位：g/ml)为1:9，搅拌混匀，制得蜂王浆水溶液；
(2)酶解：将步骤(1)制备好的蜂王浆水溶液加入氯化钙2.775g(终浓度为0.1mol/l)，然后使用1mol/l的naoh调节蜂王浆溶液至ph＝7.5，然后加入蛋白酶k15mg(60μg/ml)，在55℃温度下搅拌反应4h，反应结束后于100℃下加热5min灭酶，得酶解蜂王浆。
将步骤(2)制得的酶解蜂王浆分别按10.00、5.00、2.5g/kg3个浓度梯度配制，备用。
实施例2、糖尿病小鼠造模
随机选取不同体重的健康小鼠150只，于标准小鼠饲养条件下正常饲养3d，第3日起禁食16h，然后测定体重、血糖空腹值和尿糖的阴阳性指标，挑选126只血糖低于9mmol/l，且尿糖阴性的雌雄各半小鼠，分别按照雌性小鼠不同体重(22-26g、18-21.9g、14-17.9g)随机分成高、中、低剂量组9组，雄性小鼠不同体重(22-26g、18-21.9g、14-17.9g)随机分成高、中、低剂量组9组并于标准小鼠饲养条件下正常饲养备用。
四氧嘧啶剂量分组：首先设置出高、中、低四氧嘧啶剂量组，然后再分别对不同性别、体重的小鼠按照200mg/kg、120mg/kg和50mg/kg的剂量组来对小鼠进行不同剂量的四氧嘧啶分组，分组后小鼠禁食不禁水16小时，然后按设定剂量给予腹腔注射四氧嘧啶，72h后又采血，使用血糖检验试纸和血糖仪测定血糖，同时测定尿糖(鼠尿可采取尿湿垫料加水浸泡离心液代替)。以试纸和血糖仪测得血糖浓度大于15mmol/l、且尿糖为++以上的小鼠指标为造模成功的指标。
结果显示，造模后3d内，共有37只小鼠死亡。造模后第3天空腹血糖值>15mmol/l的小鼠出现明显的三多一高症状(多饮、多食、多尿、血糖增高)、呆滞、皮毛松散、尿糖阳性、拒食和体重减轻等症状。部分小鼠在实验后不久皮温降低2-3℃，并在不同时期死亡，其结果见表1、表2、表3和表4。
表1、雄性小鼠分组的造模成功率和死亡率
表2、雌性小鼠分组的造模成功率和死亡率
表3、造模雄性小鼠的空腹血糖值和尿糖稳定性(均值，mmol/l)
表4、造模雌性小鼠的空腹血糖值和尿糖稳定性(均值，mmol/l)
注：成功率＝造模成功小鼠数量÷成活小鼠数量×100％；死亡率＝死亡小鼠数量÷注射小鼠数量×100％
表1、表2、表3和表4结果显示，雄性18-21.9g体重高、中剂量组小鼠成模率为100％，低剂量组成模率只有42.86％；最高剂量组的死亡率42.86％，中剂量组的死亡率14.29％，低剂量组的死亡率0％。雌性18-21.9g体重高、中剂量组小鼠成模率为100％，低剂量组成模率只有33.33％；高剂量组死亡率为57.14％，中剂量组死亡率为28.57％，低剂量组死亡率为14.29％。腹腔注射四氧嘧啶途径可以成功造出小鼠糖尿病模型，并且选择体重18-21.9g的雄性小鼠禁食16h，120mg/kg四氧嘧啶腹腔注射，可获得低死亡率、高成模率、持续稳定的小鼠糖尿病模型。
将糖尿病小鼠用标准小鼠的饲养条件进行喂养，第一次在一个星期以后按照上述方法进行血糖和尿糖的测定，并记录变化，第二次则是在两个星期以后同样进行此步骤分析糖尿病模型的稳定性，结果显示在十天内，低剂量组可以保持高水平的尿糖和血糖值，但是在二十天后会逐渐降低，有些直接降低到了最低水平(9mmol/l)而导致最终不能成模。但是，高剂量组和中剂量组在二十天以内的血糖和尿糖值都比较稳定，波动范围比较小，且一直保持在较高的水平上，相比低剂量组，高、中剂量组的模型稳定性较优。
实施例3、酶解蜂王浆降糖试验
在成模小鼠中选择出56只小鼠进行分组，另选8只雄性正常小鼠做阴性对照组，然后按以下方法处理：
a酶解蜂王浆组(高中低组)
造模成功后，分别按10.00、5.00、2.5g/kg灌胃实施例1制得的蜂王浆酶解液，连续15天；
b蜂王浆组(高中低组)
造模成功后，分别按10.00、5.00、2.5g/kg灌胃蜂王浆，连续15天；
c阳性对照组
只注射四氧嘧啶，测血糖，连续15天；
d阴性对照组
不做任何处理，只测血糖，连续15天；
最后一次给药前需对小鼠绝食6个小时，并在灌喂酶解蜂王浆后的1、3、5h后分别测定一次血糖水平。尾静脉采血测定的小鼠血糖值，采用spss19.0软件，对数据进行单因素方差分析，结果如表5所示。
表5、酶解蜂王浆防治四氧嘧啶引起小鼠高血糖效果(均值，mmol/l)
注：表中数据为平均值±标准差，同列不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)。
结果显示，蜂王浆和酶解蜂王浆均有不同程度的降糖效果；蜂王浆和酶解蜂王浆的降糖效果随着剂量的增加而显著提高；酶解蜂王浆的降糖效果优于未经处理的蜂王浆，尤其是高中剂量的酶解蜂王浆。表明酶解蜂王浆对四氧嘧啶引起小鼠高血糖有一定的治疗效果，尤以高剂量组效果较好。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。