一种基于环糊精及卵磷脂为载体的番荔素纳米粒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种用环糊精以及卵磷脂为载体制备的番荔素纳米粒、其制备方法及应用。

背景技术：

番荔素包括番荔素内酯(简称ACGs)及其单体bullatacin、squamostatin、annosquacin等。番荔素是从番荔枝科植物种子中提取的一系列含有35或37个碳的长链脂肪酸，并含有0到3个四氢呋喃(THF)环类似的结构。番荔枝总内酯和单体大多数展示出来很强的抗肿瘤活性，其中活性最好的单体bullatacin对肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人结肠癌Lovo细胞、肉瘤S180细胞等具有显著疗效。同时，ACGs对多药耐药的肿瘤细胞株也有较好活性。

ACGs水溶性差，小于1ug/mL，难于给药，导致体内研究大大受限。已有的体内研究多采用悬浮灌胃，或者分散在植物油中口服给药，由于生物利用度低导致其疗效难以最大程度发挥。并且ACGs毒副作用大，治疗窗口窄，对大鼠的肝和肾有一定毒性。

纳米粒是将药物通过不同的方法制备成纳米大小的颗粒，包括胶束、聚合物纳米粒、纳米混悬剂等。由于具有较大的表面积，药物溶出速度和程度均较高，纳米粒已成为解决难溶性药物的给药问题的主要方法之一。同时，药物多包封在纳米粒内部，进入体内之后可以在一定时间内与外界环境隔离，从而在一定程度上保护不稳定的药物，延缓代谢。如果纳米粒的粒径较小(如300nm以内)，还可由于EPR(enhanced permeation and retention)效应而被动靶向肿瘤。因此，纳米给药系统是解决难溶性药物，尤其是难溶性抗肿瘤药物的临床应用的有效手段。

技术实现要素：

为实现上述目的，本发明提供一种制备方法简便、稳定性高，能同时实现番荔素静脉注射和口服给药，并增强抗癌疗效的纳米粒。

一种基于环糊精及卵磷脂为载体的番荔素纳米粒，由番荔素、环糊精和磷脂组成，其质量比为1∶0.02～20∶0.02～20。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述番荔素选自番荔素内酯、bullatacin、squamostatin或annosquacin中的一种或者两种及以上的组合。

在本发明的一个优选的实施方案中，番荔素、环糊精和磷脂的质量比为4∶2∶1。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述纳米粒的平均粒径为10-1000nm，优选平均粒径为20-200nm；所述纳米粒包括但不限于纳米混悬剂、纳米晶、纳米粒、纳米聚集体等。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述纳米粒可制成口服制剂或静脉给药制剂。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述环糊精选自α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精中的一种或者两种及以上的组合。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述环糊精选自羟丙基-β-环糊精。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述环糊精选自PEG修饰的α-、β-或γ-环糊精，其中PEG的分子量范围是200-10000，优选分子量范围是400-5000，更优选分子量范围是600-2000。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述卵磷脂选自大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂中的一种或两种的组合，其中优选大豆卵磷脂。

在本发明的另一个优选的实施方案中，为进一步改善载药纳米粒的性质，还可以加入有其他药剂上可以接受的各种辅料作为非必需的辅助稳定剂，这些辅料包括但不限于PCL-PEG、ChoI-PEG、聚乙烯醇等。

另一方面，本发明提供了一种基于环糊精及卵磷脂为载体的番荔素纳米粒的制备方法，所述方法为溶剂沉淀法或反溶剂法，包括搅拌注入或者超声注入或者二者结合来制备。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述方法具体步骤包括：

(1)将卵磷脂溶于能与水互溶的有机溶剂中，搅拌条件下将所述含有卵磷脂的溶液加入到含有环糊精的水溶液中，减压旋蒸法除去有机溶剂；

(2)将番荔素溶于能与水互溶的有机溶剂中，搅拌条件下，将所述含有番荔素的溶液加入到上一步的溶液中，减压旋蒸除去有机溶剂，即得所述的纳米粒。

在本发明的一个更优选的实施方案中，所述能与水互溶的有机溶剂选自DMSO、DMF、甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、异丙醇、PEG400、PEG600中的一种或两种及以上的混合体系；或者以上溶剂与乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等与水不相混溶的有机溶剂的混合体系，只要混合体系能和水混溶同时能很好地溶解药物和辅料即可。

在本发明的另一个更优选的实施方案中，所述方法中番荔素在有机溶剂中的浓度为0.001％～20％(w/v)，载体的浓度为0.001％～50％(w/v)。

在本发明的另一个更优选的实施方案中，步骤(2)中有机溶剂与水相的体积比为1∶2～100(v/v)。

在本发明的另一个更优选的实施方案中，步骤(1)和(2)中的搅拌条件为搅拌温度20-60℃；搅拌速度100～1000rpm；搅拌时间1～60min，优选的搅拌条件为25℃，500rpm，搅拌20min。

在本发明的另一个更优选的实施方案中，还包括步骤(3)还可以通过冷冻干燥进一步固化。所用冻干保护剂可以是海藻糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精中的一种或两种及两种以上的组合中的一种或两种及以上的组合，优选乳糖为冻干保护剂；冻干保护剂的用量为0.1％-5％(g/100mL)，冻干保护剂的用量优选为0.5-2.5％。

另一方面，本发明提供了提供一种番荔素纳米粒在制备用于治疗肝癌的注射剂中的应用。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述的注射剂选自注射液或无菌冻干粉针。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述纳米粒注射剂的水相分散介质可用高浓度的氯化钠或葡萄糖水溶液调成0.9％氯化钠或者5％葡萄糖生理等渗体系，适应临床应用。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述纳米粒无菌冻干粉针可加入适量的无菌药用0.9％氯化钠或者5％葡萄糖水溶液稀释，重建成供静脉给药用的分散体系，适应临床使用。

本发明的纳米粒的优点在于：

(1)处方简单，所用的载体对人体无毒副作用，并且经济易得；

(2)载药量可高达50％以上，平均粒径小，具有较高的药物传输效率，同时易实现对肿瘤的被动靶向；

(3)体外释放没有突释；

(4)在人工胃肠液和血浆当中均稳定，既可以口服给药，也可以静脉注射。

本发明的纳米粒经体外细胞毒实验表明，与番荔素DMSO溶液相比，表现出更显著的肿瘤细胞抑制率。

本发明的纳米粒经荷瘤小鼠药效实验证明，与市售喜树碱注射液(阳性药)相比，具体更显著的抗肿瘤药效，在肿瘤治疗方面，是一种非常有前景的药物递送系统。

本发明的纳米粒工艺简单，辅料经济安全易得，有广阔的产业化前景。

附图说明

图1为实施例1中ACGs纳米粒的平均粒径分布图。

图2为实施例1中透射电镜照片(×19000)。

图3为实施例1中ACGs纳米粒在人工胃肠液中的稳定性考察(n＝3)。

图4为实施例1中ACGs纳米粒在血浆中的稳定性考察(n＝3)。

图5为实施例1中ACGs纳米粒的溶血考察(n＝3)。

图6为实施例1中ACGs纳米粒在PBS中的体外释放曲线(n＝3)。

图7为实施例1中ACGs纳米粒对HepG2、Hela细胞毒考察(n＝6)。

图8为实施例1中荷瘤小鼠体重随时间变化曲线(n＝10)。

图9为实施例1中荷瘤小鼠肿瘤体积随时间变化曲线(n＝10)。

具体实施方式

通过以下实施方式进一步详细说明本发明的技术方案。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1

称取大豆卵磷脂2mg溶于0.2mL甲醇中，25℃，500rpm搅拌条件下缓慢注入到含有4mg羟丙基-β-环糊精的4mL水溶液中，继续搅拌10分钟后，旋蒸除去甲醇。随后将8mgACGs溶于0.4mL甲醇中，常温，500rpm搅拌条件下注入到上述获得的溶液中，随后旋蒸除去甲醇，即得ACGs纳米粒。平均粒径为144.4nm(图1)，多分散性指数(PDI)为0.08，电位值-22.9mV。

实施例2

制备2mg/mL浓度的ACGs混悬剂，吸取6μL滴到300目的铜网上，空气中自然晾干，后用0.1％醋酸铀染色10min，透射电镜下观察粒子的形态(图2)。

实施例3 ACGs纳米粒在人工胃肠液中的稳定性考察

人工胃液的配置：取浓度为1mol/L的稀盐酸16.4mL，加800mL蒸馏水，10g胃蛋白酶，混匀，加水稀释至1000mL。

人工肠液的配置：6.8g磷酸二氢钾，加水500mL，用0.1mol/L氢氧化钠调pH6.8，另取胰蛋白酶10g，加水溶解，两液混合后加水稀释至1000mL。

取0.5mL过膜后的配置好的人工胃肠液，与ACGs纳米粒等体积混合，一定时间点测其粒径的变化。

结果：在人工胃肠液中，ACGs纳米粒在12h之内粒径变化几乎不大(图3)，说明ACGs纳米粒在人工胃肠液中基本稳定，能够口服给药。

实施例4 ACGs纳米粒在血浆中的稳定性考察

ACGs纳米粒与大鼠血浆混合后(1∶4，v/v)，在特定的时间点测其粒径的变化。

结果：ACGs纳米粒与血浆孵育后，6h之内并未发现沉淀或者粒径变化(图4)，说明ACGs纳米粒在血浆中基本稳定。

实施例5 ACGs纳米粒的溶血考察

大鼠眼眶取血后，于5000rpm离心10min，收集沉淀。随后用0.9％的NaCl溶于洗涤几遍，直至上清无明显红色。随后血细胞沉淀用0.9％的NaCl的溶液稀释至4％红细胞悬浮液(v/v)。取此悬浮液0.5mL与0.5mL的已调等渗的纳米粒混合，37℃孵育4h后，5000rpm离心10min，取上清于酶标仪540nm处测吸光值。同时将4％的红细胞悬浮液与0.9％的NaCl混合作为阴性对照，4％的红细胞悬浮液与去离子水混合作为阳性对照。

溶血率(％)＝(OD样品-A阴性对照)/(A阳性对照-A阴性对照)×100

结果：ACGs溶液剂溶血明显(图5)，0.25mg/mL时溶血率20％，2mg/mL时溶血率将近95％。而相比之下，ACGs纳米粒的溶血率大大降低，2mg/mL的ACGs纳米粒溶血率不足10％，体内静脉给药时所需的浓度完全不溶血，满足静脉注射的条件。

实施例6 ACGs纳米粒的体外释放实验

方案：取制备好的ACGs纳米粒4mL(1mg/mL，平行三份)，于即用型透析袋(MWCO＝20000，Spectra/Por，USA)中，分别置于1L释放介质PBS中，37℃下100rpm搅拌，定时从透析袋内吸取50μL释放内液，加950μL甲醇溶解纳米粒和未释放的药物，HPLC测定ACGs的含量，计算累积释放率。

结果：ACGs纳米粒能够缓慢释放72h(图6)，整个过程无明显突释，释放行为接近一级释放。

实施例7 ACGs纳米粒对HepG2、Hela的体外细胞毒考察

方案：用含10％胎牛血清的1640培养液将HepG2、Hela细胞配成单细胞悬液，以每孔5×103个细胞左右接种到96孔板。5％CO₂、37℃细胞培养24h后，吸去培养液，用不含胎牛血清的培养基稀释ACGs纳米粒至不同浓度梯度，加入200uL继续培养(同时以不含胎牛血清的培养基作为空白对照)，每个浓度6个复孔。孵育48h后，吸去样品溶液，每孔加MTT溶液(5mg·mL^-1，PBS配制)20μL；继续孵育4h后，终止孵育，吸去孔内培养上清液，每孔加200μL DMSO，振荡20min，使结晶物充分溶解。选择570nm波长，在酶联免疫荧光仪检测OD值。

细胞抑制率(％)＝(空白对照组OD-实验组OD)/空白对照组OD×100％。

结果：与番荔素DMSO溶液相比，纳米粒混悬剂对HepG2、Hela均具有更强的抑制作用(图7)，尤其是对于Hela细胞(IC₅₀值0.018μg/mL vs.0.241μg/mL，p＜0.01)。孵育48h后，ACGs溶液和纳米粒的IC₅₀值如下表：

(mean±SD，n＝10，^**p＜0.01vs.ACGs溶液剂)

实施例8 ACGs纳米粒在H22荷瘤小鼠的抗肿瘤药效研究

给药方案：将筛选出来的荷瘤小鼠随机分为7组，每组10只，除正常饮食外，尾静脉注射ACGs纳米粒(100，200，400ug/kg)，灌胃给予ACGs纳米粒(400ug/kg)和ACGs油溶液(4mg/kg)，同时设立阳性药对照组(尾静脉注射给予市售HCPT注射液5mg/kg)，生理盐水阴性对照组。隔天给药，实验7天。

考察指标：每日上午9点至10点，用电子秤称量小鼠体重；用游标卡尺测量肿瘤体积。实验结束后，脱颈椎处死小鼠，完整剥离腋下肿瘤组织称重，计算抑瘤率。

抑瘤率(％)＝(1-治疗组平均瘤重/生理盐水组平均瘤重)×100％。

结果：纳米粒组的小鼠体重变化并未明显降低，中剂量和低剂量甚至还有升高趋势(图8)，表明该治疗组对小鼠没有显着毒性。ACGs纳米粒静脉注射时表现出卓越的抗肿瘤治疗，400ug/kg尾静脉给药的肿瘤抑制率较HCPT市售注射剂5mg/kg(70.31％vs.35.28％，p＜0.01)有显着性增强。ACGs纳米粒呈现出剂量依赖性，中剂量(200ug/kg，iv)和低剂量(100ug/kg，iv)抑瘤率相比于高剂量抑瘤率低(分别为56.39％和47.52％)，但都比阳性药的抑瘤率高。口服给药时，ACGs纳米粒仅用ACGs油溶液十分之一的剂量就能达到近乎相同的肿瘤抑制率(47.94％vs.49.74％，p＞0.05)。

表明采用羟丙基-β-环糊精与大豆卵磷脂为载体制备的ACGs纳米粒是一种非常有前景的药物递送系统。ACGs纳米粒，ACGs油溶液及阳性药对H22荷瘤小鼠的抑瘤率如下表：

(mean±SD，n＝10，^#p＜0.05vs.空白对照，^##p＜0.01vs.空白对照，^*p＜0.05vs.HCPT注射液，^&p＜0.05vs.ACGs油溶液).

以上所述仅为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原料的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。