桂皮醛及衍生物在制备抑制肾脏钠重吸收的药物中的用途的制作方法

本发明涉及医疗领域，特别涉及桂皮醛及衍生物在制备抑制肾脏钠重吸收的药物中的用途。

背景技术：

肾脏在维持水钠平衡中发挥重要作用。90％以上的水钠在肾小管被重吸收。其中，60％以上的钠主要通过近端小管重吸收；约30％的钠在髓袢升支粗段通过钠Na⁺-K⁺-2Cl^-同向转运体(NKCC)重吸收；约7％的钠在远曲小管通过Na⁺-Cl^-协同转运体(NCC)重吸收；剩下的钠在集合管通过上皮钠通道(ENaC)重吸收。进入肾小管上皮细胞的Na⁺随即被细胞基侧膜的Na⁺/K⁺-ATPase(钠泵)泵入细胞组织间隙。其中，近端小管钠重吸收在维持水钠平衡中起着十分重要的作用。

过量盐摄入会引起肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活、氧化应激损伤和肾脏钠水潴留等病理生理改变。肾脏钠盐排泄障碍是高盐饮食导致钠水潴留的重要因素。促进肾脏排钠可防止钠水潴留。如前所述影响尿钠重吸收的多个通道可通过利尿剂进行特异性干预，但长期大量或联合应用利尿剂可导致代谢紊乱等副作用。因此，探索新的干预靶点和安全有效的利尿剂以促进尿钠排泄具有重要意义。

桂皮醛(cinnamaldehyde)又名肉桂醛，天然存在于斯里兰卡肉桂油、桂皮油、藿香油、风信子油和玫瑰油等精油中。桂皮醛有顺式和反式两种异构体，现商用的桂皮醛，无论是天然的或者是合成的桂皮醛，都是反式体。桂皮醛是GB2076-2011规定的允许使用的食品用合成香料，已广泛用于制备肉类、调味品、口腔护理用品、口香糖、糖果用香精。

所述桂皮醛的结构式如下所示：

桂皮醛分子式：C₉H₈O；桂皮醛相对分子质量：132.16。

既往研究发现桂皮醛具有抗菌、抗肿瘤和镇痛等作用。

既往使用的利尿剂存在不良反应发生率高的缺点和不足，耐受性差，因此降低了患者的服药的依从性。因此，本领域需要安全有效、不良反应发生率低的新利尿剂，为临床医生和患者提供更好的药物选择。

技术实现要素：

发明的目的是提供一种桂皮醛及衍生物在制备抑制肾脏钠重吸收的药物中的用途，该药物专门针对高盐饮食人群，可以克服了现有利尿剂的局限性和毒副作用，是一种安全有效的利尿新药物。

本发明的技术方案是：

桂皮醛及衍生物在制备抑制肾脏钠重吸收的药物中的用途。

所述桂皮醛为反式异构体。

所述桂皮醛通过激活TRPA1促进钙内流。

凡能通过激活TRPA1促进钙内流的桂皮醛衍生物，都可用作制备抑制肾脏钠重吸收的药物。

本发明所述药物，桂皮醛及衍生物可以采用药物组合物用于抑制肾脏钠重吸收，其中包括抑制肾脏钠重吸收的有效量和药用载体或赋形剂。

所述桂皮醛及衍生物可单独或以药物组合物形式使用并可通过口服，非肠道或局部途径给予。举例讲，本发明药物组合物的口服剂型可为片剂、胶囊、溶液或悬浮液等。

所述桂皮醛及衍生物的给药剂量取决于多种因素如性别、年龄、体重或给药途径，其药物用药量为每公斤体重每天2-100mg，较好的技术方案是所述药物的用量为每公斤体重每天20-30mg。

动物实验结果表明，

本发明所述吴桂皮醛采用纯天然提取的桂皮醛，作为一种已知化合物可通过本领域已知方法制备或从市场上获得。

发明人在小鼠动物上采用口服给药途径，在高盐喂养的WT小鼠模型中观察证实桂皮醛可显著促进所述小鼠的尿钠排泄具有治疗作用，实验验证了桂皮醛药物通过激活TRPA1能促进钙内流，可促进尿钠排泄缓解高盐导致的肾脏功能损害。因此，本发明所述药物，能有效促进肾脏排钠，发挥利尿剂的作用，保护高盐饮食导致的肾脏损害，且无明显不良反应。

本发明具有以下有益效果：能有效降抑制尿钠重吸收，促进尿钠排泄，并改善高盐导致的肾脏功能损伤，无明显不良反应发。其有效成分桂皮醛为植物来源的天然化合物，非人工合成，是一种安全有效的、不良反应少的促进尿钠排泄的药物，无明显毒副作用。

下面的试验实施例是对本发明的进一步详细说明但不意味着对本发明的限制。

附图说明

图1为桂皮醛促进尿钠排泄并缓解高盐导致的肾脏损伤，其中图1A为在野生型(WT)小鼠，膳食补充桂皮醛(HS+CA)可以增加高盐(HS)喂养小鼠的尿钠排泄；图1B为在TRPA1基因敲除(TRPA1^-/-)小鼠，膳食补充桂皮醛(HS+CA)不能显著改变高盐(HS)喂养小鼠的尿钠排泄；图1C为膳食补充桂皮醛(HS+CA)激活TRPA1可以降低高盐(HS)喂养小鼠的血肌酐水平；图1D为膳食补充桂皮醛(HS+CA)激活TRPA1可以降低尿白蛋白/肌酐比值，改善高盐导致的肾脏功能损伤；

图2为TRPA1在近端小管上皮细胞有表达及功能，其中图2A为TRPA1基因在野生型(WT)小鼠近端小管和猪近端小管细胞系(LLC-PK1)有表达，在TRPA1基因敲除(TRPA1^-/-)小鼠没有表达；图2B为TRPA1和UCP2在猪近端小管细胞系(LLC-PK1)共表达；图2C-2D为桂皮醛(CA)干预可以增加猪近端小管细胞系(LLC-PK1)钙内流，用HC-030031抑制TRPA1后可阻断桂皮醛介导的细胞钙内流；

图3为桂皮醛激活TRPA1对近端小管蛋白表达的影响，其中图3A-3B为膳食补充桂皮醛可改善高盐导致的TRPA1表达降低；图3C-3E为高盐饮食(HS)可增加近端小管钠氢交换子3(NHE3)和钠钾泵(Na⁺/K⁺-ATPase)的表达，在野生型(WT)小鼠膳食补充桂皮醛(HS+CA)可抑制高盐(HS)喂养导致的钠氢交换子3(NHE3)和钠钾泵(Na⁺/K⁺-ATPase)表达上调，桂皮醛的效应在TRPA1基因敲除(TRPA1^-/-)小鼠缺失。

具体实施方式

本实施例所用桂皮醛购自美国Sigma-Aldrich公司，型号W228613。

本实施例其它试剂为市售的分析纯试剂；

野生型(WT)小鼠(C57BL/BJ)和TRPA1基因敲除小鼠(TRPA1^-/-)购自美国杰克逊实验室。

实施例1桂皮醛与激活TRPA1促进尿钠排泄的影响

野生型(WT)小鼠(C57BL/BJ)和TRPA1基因敲除小鼠(TRPA1^-/-)购自美国杰克逊实验室。小鼠随机分为普食组、高盐组和高盐加桂皮醛组，连续干预6个月。期间每个月测定鼠尾血压，鼠尾动脉血压测定方法：采用鼠尾血压测定仪(Powerlab，澳大利亚)按照仪器的要求进行测量。测量前先让小鼠在35℃的温箱温热5min。测量过程中小鼠保持清醒状态，活动受到限制。每只动物测3次，取平均数。在测血压的同时，可监测心率的变化。每周测量小鼠的尿量和尿钠排泄量。

将小鼠称重后置于代谢笼(泰尼百斯，意大利)中，自由进食水，收集24h的小便；收集完成后计量小便体积，并使用电解质分析测定仪(扬州越化)测定尿电解质水平。使用小鼠肌酐和尿白蛋白ELISA试剂盒测定(南京建成)，具体方法参照试剂盒使用说明进行。实验结果使用Prism软件进行统计分析及作图。研究结果发现桂皮醛可显著促进高盐喂养的WT小鼠尿钠排泄，桂皮醛的利钠效应在TRPA1^-/-小鼠不明显(图1A,图1B)。此外，补充膳食桂皮醛可降低高盐喂养WT小鼠血肌酐和尿蛋白水平，改善高盐饮食导致的肾脏功能损害，该效应在TRPA1^-/-小鼠缺失(图1C,图1D)。提示膳食桂皮醛可促进尿钠排泄缓解高盐导致的肾脏功能损害，该效应依赖于TRPA1；桂皮醛的降压效应与激活TRPA1促进尿钠排泄有关。

实施例2TRPA1和UCP2在近端小管上皮细胞的表达

一、用免疫印迹法(Western blot)检测TRPA1在近端小管的表达情况。具体实验过程如下：

(1)分离小鼠肾脏和猪近端小管上皮细胞，加入适量预冷的RIPA裂解液(蛋白质匀浆缓冲液1ml加PMSF 50μg，Leuptin 5μg)，匀浆机匀浆，收集匀浆液于1.5ml的离心管中；如为细胞样品，则将适量裂解液直接加入到培养瓶或六孔板中，用细胞刮刀收集细胞。(2)-20℃放置20min以沉淀蛋白。

(3)4℃条件下12000rpm离心20min，收集上清液即组织蛋白，用于蛋白定量及免疫印迹实验，或者于-70℃冻存备用。

(4)Bradford法进行蛋白定量。

(5)取500μg样品于干净EP管中，用蛋白加样缓冲液定容至200ul，混匀，置于沸水中变性6分钟。4℃保存，Western blot上样备用。

Western blot操作步骤

(1)灌制聚丙烯凝胶：先灌下层的分离胶(检测不同分子量的蛋白，分离胶浓度不同)，再灌上层的4％浓缩胶，然后上样，每孔上样量为50μg，每个样本至少上二块平行胶；

(2)蛋白电泳：电泳电压浓缩胶为90V，分离胶为140V，电泳液为甘氨酸缓冲液；

(3)转膜：电泳结束后，将凝胶与大小相同的PVDF膜(事先用95％乙醇固定)置于上下各三层滤纸中间，置入转移槽，加满转移液，4℃95mA电泳转膜14h左右；

(4)封闭：取出PVDF膜，自然晾干后，置于95％乙醇中固定；0.01mol/L PBST洗15min×3次；5％脱脂奶粉中封闭非特异性蛋白，37℃摇床中封闭约4h；

(5)抗原抗体反应：分别加一抗和内参照GAPDH抗体(用PBST稀释成1：1000的浓度)，37℃摇床中结合3～4h或置于4℃过夜，PBST洗15min×3次；加IgG二抗(用PBST稀释成1：1000)，37℃摇床中结合1～2h，PBST洗15min×3次；

(6)显影：将PVDF膜置于化学发光试剂中反应1～3min；在暗室中使X光片曝光，常规方法显影定影；

(7)定量：凝胶成像系统扫描分析条带光密度值(OD值)。计算每个蛋白条带光密度值与内参照GAPDH光密度值的比值，代表各样品的蛋白表达水平。

免疫印迹检测证实TRPA1在WT小鼠肾脏近端小管和猪近端小管细胞系有表达(图2A)。

二、用免疫荧光法检测TRPA1和UCP2在近端小管上皮细胞表达情况。具体方法如下：

(1)细胞准备。将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次。

(2)固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。PBS洗涤3×5min。

(3)通透。使用交联剂(多聚甲醛)固定通透5-15min。通透后用PBS洗涤3×5min。

(4)封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间30min。

(5)一抗结合。4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。

(6)二抗结合。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

(7)封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

免疫荧光结果提示TRPA1和UCP2在原代培养的近端小管上皮细胞有表达(图2B)。

三、桂皮醛干预对近端小管钙内流影响

细胞钙测定方法如下：

(1)将细胞消化之后离心，Fura-2(Sigma，美国)钙染料(5μM)37℃避光孵育40min。

(2)PBS清洗3次。

(3)300ul无钙HBSS重悬后，加入96孔板，100ul/孔。

(4)加入桂皮醛(CA，10uM)和/或TRPA1抑制剂HC-030031(3uM)刺激。

(5)Prism软件统计分析结果。

结果提示在LLC-PK1细胞，桂皮醛通过激活TRPA1能促进钙内流,使用TRPA1抑制剂HC-030031能显著抑制桂皮醛导致的钙内流(图2C)。

实施例3桂皮醛对高盐摄入小鼠近端小管TRPA1、NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶表达的影响

用免疫印迹法(Western blot)检测桂皮醛对高盐摄入小鼠近端小管TRPA1、NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶表达的影响(具体参照实施例2中的免疫印迹法)。

结果发现桂皮醛可以防止高盐摄入导致的近端小管TRPA1表达减少(图3A,图3B)，高盐摄入会显著增加近端小管NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶的表达，而桂皮醛可以抑制高盐导致的NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶表达增加；桂皮醛的效应在TRPA1^-/-小鼠缺失(图3C、图3D、图3E)。说明桂皮醛是通过激活近端小管TRPA1，抑制NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶的表达来抑制尿钠重吸收。

结论：膳食补充桂皮醛激活TRPA1可以促进肾脏尿钠排泄，改善高盐饮食导致的肾脏损伤。其机制与抑制肾脏近端小管NHE3和Na⁺/K⁺-ATP酶的表达减少尿钠重吸收有关。