一种兼具荧光可视、磁靶向和pH敏多功能的复合空心微球药物载体及其制备方法与流程

本发明属于微纳米功能材料技术领域，涉及一种兼具荧光可视、磁靶向和pH敏感功能的无机纳米复合药物载体的制备方法。

背景技术：

肿瘤是目前威胁人类健康的重大疾病之一，近年来，随着人们对肿瘤认识的深化和诊断手段的提高，癌症的治疗已经取得长足的进步。治疗肿瘤的普遍方法，如化学药物疗法，放射线疗法及手术切除等，仍具有一定的不足。比如说，当前口服或注射的抗癌药物都是全身给药，抗癌药物在杀死肿瘤细胞的同时亦可损害患者的免疫系统，而且会导致患者的进一步健康恶化。因此人们期望化疗药物能够定点定量的运送到病变位置，实现病变位置局部治疗的效果。因此，迫切的需要开发一种生物相容性好、体内可降解的化疗药物的运载体应用到生物体内。目前，所制备的一些药物载体，成本较高，实验条件苛刻，制备工艺复杂，载体材料生物相容性较差难以应用到生物体内。

技术实现要素：

针对目前的药物载体成本高、制备工艺复杂且生物相容性较差的技术问题，本发明提供了一种兼具荧光可视、磁靶向功能和pH敏多功能的复合空心微球药物载体，该药物载体的结构为空心球状ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺的微纳米复合空心微球；其中，空心球状ZnO粒径为200～1000nm，Fe₃O₄的粒径为8～15nm，ZnS:Mn²⁺粒径为3～6nm；空心球状ZnO、Fe₃O₄@PEG纳米粒子和ZnS:Mn²⁺量子点的摩尔比为1:1:(3～5)；Fe₃O₄@PEG按照Fe₃O₄的物质的量计算。

其制备方法具体如下：

1)空心球状ZnO制备：配置20mL的0.03～0.04mol/L Zn(AC)₂·2H₂O乙醇溶液，加入0.4～0.8mL 200～1000nm的聚苯乙烯微球，恒温55～65℃下搅拌1.5～2h。随后将20mL的0.035～0.045mol/L NaOH乙醇溶液加入其中，搅拌2～4h，所得产物用乙醇洗涤2～3次，干燥并研磨后，在270～280℃下煅烧20～30min，制得的空心球状ZnO，其粒径为200～1000nm。

2)Fe₃O₄@PEG纳米粒子的制备：将FeCl₃·6H₂O,FeCl₂·4H₂O和PEG-4000溶于水中，三者摩尔比为1:0.6:(0.0026～0.0038)，在室温下搅拌10～20min。把混合的溶液转移到反应容器中，加入浓度为25％的氨水，其中铁离子与氨水中NH₃·H₂O的摩尔比为1.6:(1.3～1.4)。在85～95℃恒温水浴下搅拌反应3～4h，得到黑色均匀的悬浮液。自然冷却反应体系至室温，利用磁性富集收集产物，并依次用去离子水和乙醇进行洗涤、干燥后，制得Fe₃O₄@PEG纳米粒子，其粒径为8～15nm。

3)ZnS:Mn²⁺量子点的制备：将Zn(AC)₂·2H₂O和Mn(AC)₂·4H₂O溶于6.5mL水中，二者摩尔比按照掺杂比计，在室温下搅拌溶解。向上述溶液中分别加入9.75mL油酸、0.004～0.005mol的油酸钠和16.25mL乙醇，在室温下搅拌1～2h得到混合溶液。然后将0.004mol Na₂S·9H₂O溶于6.5mL水中，室温下搅拌10～20min后加入到上述混合溶液中，搅拌2～3h。然后在190～210℃下烧结10～12h。取出产物后，用1:1的乙醇和环己烷的混合溶液进行超声，离心，反复3～5次清洗。最后，在80℃的干燥箱中干燥3～5小时，得到ZnS:Mn²⁺量子点，在室温条件下充分研磨后备用；所制得的ZnS:Mn²⁺粒径为3～6nm。

4)按照摩尔比1:1:3～5称取空心球状ZnO、Fe₃O₄@PEG纳米粒子和ZnS:Mn²⁺量子点。

5)将上述纳米粒子分别分散于乙醇中，三者摩尔浓度分别为：空心球状ZnO0.01mol/L，Fe₃O₄@PEG纳米粒子0.0015～0.003mol/L，ZnS:Mn²⁺量子点0.0045～0.015mol/L。

6)在55～70℃匀速搅拌条件下向空心球状ZnO的乙醇溶液中同时逐滴加入Fe₃O₄@PEG纳米粒子乙醇溶液和ZnS:Mn²⁺量子点乙醇溶液，滴加速度为10～15mL/min，滴加时间控制在20分钟以内，滴加完成后保持温度和搅拌速度2h；所述搅拌的速度为240～300r/min。

7)通过磁性富集，收集产物，经乙醇洗涤并干燥后得到最终产物。

本发明中所使用的空心球状ZnO、Fe₃O₄@PEG纳米粒子和ZnS:Mn²⁺量子点的摩尔比为1:1:(3～5)；ZnS:Mn²⁺量子点掺杂比例优选1％。

步骤5)的分散方式优选超声分散处理。

步骤6)中滴加速度优选每分钟10滴，每滴1mL；搅拌的速度优选240r/min。

本发明的有益效果：

本发明利用自组装的方法制备ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺药物载体，针对Fe₃O₄会导致ZnS:Mn²⁺荧光猝灭而导致发光性能丧失，通过表面修饰，抑制Fe₃O₄纳米颗粒与ZnS:Mn²⁺量子点接触后的荧光猝灭效应，提高载体体系的荧光效率，保障荧光成像功能的实现。并利用ZnO中空结构的比表面积大、负载能力强的优势，提高载药体系的载药率。实现了材料生物相容性好，制备工艺简单，实验条件温和，成本低廉，且兼具荧光可视、磁靶向和pH敏多功能的复合空心微球药物载体。

附图说明

图1本发明实施例1中Fe₃O₄纳米粒子的透射电镜图。

图2本发明实施例1中ZnS:Mn²⁺量子点的透射电镜图。

图3本发明实施例1中ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球药物载体的透射电镜图。

图4本发明实施例1中ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球药物载体的元素面扫描图。

图5本发明实施例1所制备的ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球药物载体和Fe₃O₄纳米粒子的磁滞回归曲线。

图6 ZnS:Mn²⁺量子点和ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球药物载体的荧光光谱图。

图7本发明所制备的空心球状ZnO的MTT图。

图8本发明所制备的Fe₃O₄纳米粒子的MTT图。

图9本发明所制备的ZnS:Mn²⁺量子点的MTT图。

图10本发明所制备的ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球药物载体的MTT图；图7至图10中横坐标为浓度，纵坐标为细胞存活率。

图11本发明所制备的ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球药物载体在不同pH值下的释药曲线图。横坐标为时间，纵坐标为释药率。

具体实施方式

实施例1

1)空心球状ZnO的制备：配置20mL的0.03～0.04mol/L Zn(AC)₂·2H₂O乙醇溶液，加入0.4～0.8mL 200～1000nm聚苯乙烯微球，恒温55～65℃下机械搅拌1.5～2h。随后将20mL的0.035～0.045mol/L NaOH乙醇溶液加入其中，机械搅拌2～4h，所得产物用乙醇洗2～3次，干燥并研磨后，在270～280℃下煅烧20～30min，制得的空心球状ZnO，粒径为200～1000nm。

2)Fe₃O₄@PEG纳米粒子的制备：将FeCl₃·6H₂O,FeCl₂·4H₂O和PEG-4000溶于水中，三者摩尔比为1:0.6:(0.0026～0.0038)，在室温下搅拌10～20min。把混合的溶液转移到500mL的三颈烧瓶中，加入浓度为25％的氨水，其中铁离子与氨水中NH₃·H₂O的摩尔比为1.6:1.3～1.4。在85～95℃恒温水浴下机械搅拌3～4h，得到黑色均匀的悬浮液。让三颈烧瓶自然冷却至室温，通过磁铁来分离收集沉淀物，并用去离子水和乙醇进行洗涤后，在50～60℃干燥10～14h，制得的Fe₃O₄@PEG，其粒径为8～15nm。

3)ZnS:Mn²⁺(1％)量子点的制备：将Zn(AC)₂·2H₂O和Mn(AC)₂·4H₂O溶于6.5mL水中，二者摩尔比为100:1，在室温下搅拌10～20min。向上述溶液中分别加入9.75mL油酸、0.004～0.005mol的油酸钠和16.25mL乙醇，在室温下磁力搅拌1～2h。将0.004molNa₂S·9H₂O溶于6.5mL水中，室温下搅拌10～20min后加入到上述混合溶液中，搅拌2～3h。所得的混合溶液在190～210℃下烧结10～12h。取出产物后，用1:1的乙醇和环己烷的混合溶液进行超声，离心，反复3～5次清洗。最后，在80℃的干燥箱中干燥3～5小时，得到最终产物并在室温条件下充分研磨。所制得的ZnS:Mn²⁺(1％)粒径为3～6nm。

4)按照摩尔比1:1:3～5称取空心球状ZnO、Fe₃O₄@PEG纳米粒子和ZnS:Mn²⁺(1％)量子点。

5)将上述纳米粒子分别分散于乙醇中，三者摩尔浓度分别为：空心球状ZnO 0.01mol/L，Fe₃O₄@PEG纳米粒子0.0015～0.003mol/L，ZnS:Mn²⁺量子点0.0045～0.015mol/L。

6)在55～70℃匀速搅拌条件下向空心球状ZnO的乙醇溶液中同时逐滴加入Fe₃O₄@PEG纳米粒子乙醇溶液和ZnS:Mn²⁺量子点乙醇溶液，滴加速度为10～15mL/min，滴加时间控制在20分钟以内，滴加完成后保持温度和搅拌速度2h；所述搅拌的速度为240～300r/min。

7)通过磁性富集，收集产物，经乙醇洗涤并干燥后得到最终产物。

实施例2

1)空心球状ZnO制备：a.0.1580gZn(AC)₂溶解在20mL乙醇中，0.032gNaOH溶解在20mL乙醇中。b.向Zn(AC)₂乙醇溶液中加入0.8mL聚苯乙烯微球恒温60℃下机械搅拌1.5h。c.将NaOH乙醇溶液加入到b的溶液中机械搅拌3h。D.产物用乙醇洗2-3次，干燥，研磨。e.280℃下煅烧30min。

2)Fe₃O₄@PEG纳米粒子的制备：a.FeCl₃·6H₂O(2.7022g),FeCl₂·4H₂O(1.1929g)和PEG-4000(10g)溶解在150mL去离子水中，在室温下搅拌十分钟。b.把混合的溶液转移到500mL的三颈烧瓶中，向混合溶液中加入100mL的氨水(25％)，让其在恒温水浴90℃下机械搅拌3h，得到黑色均匀的悬浮液。c.当三颈烧瓶自然冷却至室温，通过磁铁来分离收集沉淀物，并用去离子水和乙醇进行洗涤。d.50℃干燥12h。

3)ZnS:Mn²⁺(1％)量子点的制备：称取0.8561g Zn(AC)₂·2H₂O、0.0096g Mn(AC)₂·4H₂O溶于6.5mL去离子水中，室温磁力搅拌10min后，加入9.75mL油酸，1.3g油酸钠，16.25mL乙醇，室温磁力搅拌1h得到混合溶液；称取0.9367g Na₂S·9H₂O溶于6.5mL去离子水中，室温磁力搅拌10min后，将其加入上述混合溶液中，室温磁力搅拌2h。然后转移至190℃的干燥箱中烧结12h。取出产物后，利用乙醇和环己烷的混合液(乙醇和环己烷的比例为1:1)对其进行超声，离心，反复清洗3次后，在80℃干燥箱中干燥3h，得到粉末物质，在室温条件下充分研磨。

4)样品溶解，具体为：0.0244g空心球状ZnO，0.0695g Fe₃O₄@PEG纳米粒子，0.146g ZnS:Mn²⁺(1％)量子点分别分散在30mL、150mL、150mL的乙醇中，并分别进行10s、20s、60s的超声分散。

5)载体复合，具体为：先将空心球状ZnO的乙醇溶液加入三颈烧瓶中60℃恒温机械搅拌，再将Fe₃O₄@PEG纳米粒子的乙醇溶液、ZnS:Mn²⁺(1％)量子点的乙醇溶液同时逐滴加入，每分钟10滴，每滴1毫升，在20分钟内同时逐滴加入到上述三颈烧瓶中，在60℃恒定温度下以240转/分钟的速度机械搅拌2h。

6)产物富集：快速将(3)中的上层混浊液倒入烧杯中，随后将烧杯放置在半径3cm高2cm圆柱形的磁铁上,利用复合材料体系的磁性富集产物3分钟，待上层液体澄清后，将上清液倒出，收集烧杯底部产物。

7)洗样：用乙醇洗2-3次。

效果验证

如图1～图3所示分别为Fe₃O₄纳米粒子、ZnS:Mn²⁺量子点、ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球药物载体的透射电镜图。由图3可见，ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合微球为空心结构的尺寸在820nm左右。

如图4所示为ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合微球的元素面扫描图，可见其中含有Zn、Fe、S、Mn、O元素，且分布均匀，呈空心结构。

如图5所示是Fe₃O₄纳米粒子和ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球药物载体的M-H曲线。图中可见，所制备的Fe₃O₄纳米粒子的饱和磁化强度为35emu/g，而复合空心微球药物载体的饱和磁化强度在15emu/g，虽然磁饱和强度有所减小，但已经达到磁靶向功能的要求。

如图6所示ZnS:Mn²⁺量子点(a)和ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球药物载体(b)的PL图。由图可见，复合空心微球药物载体组装后，更有利于ZnS:Mn²⁺的橙黄光发射，发光效率有所提高。

如图7～图10所示分别为空心球状ZnO、Fe₃O₄纳米粒子、ZnS:Mn²⁺量子点以及ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球对海拉细胞存活率的检测，从图中可以看出细胞存活率在样品浓度为100ug/mL时分别为91.5％，90.2％，87％，89.2％，基本无毒性。

如图11所示是所制备的DOX装载的ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球在不同PH值下的释药曲线图。图中分别为DOX装载的ZnO@Fe₃O₄@ZnS:Mn²⁺复合空心微球在pH＝5.5，6.3，7.2的阿霉素(DOX)释放率分别为44.68％，36.91％，10.82％。