一种硒代蛋氨酸的应用的制作方法

本发明属于含硒化合物领域，尤其涉及一种硒代蛋氨酸的应用。

背景技术：

硒是一种生物体必需的微量元素，适当补硒对预防某些重大疾病具有良好的效果。硒的存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒有亚硒酸钠和硒酸钠，有机硒主要是硒蛋白和硒多糖。然而无机硒在蓄积性毒性和致突变作用方面远远超过有机硒，有机硒副作用相对较小，其不仅能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上比无机硒显著。因此从天然产物中分离或人工合成新的硒化合物，研究其抗病效能及相关生物学活性具有非常重要的意义。

在众多硒蛋白类物质中，硒代蛋氨酸具有极强的抗氧化性，是机体摄入硒的主要化合物之一，因此在机体内的生物活性高、利用率高，毒性低。而现有的治疗神经退行性疾病的药物有很多种，但是尚未有硒类化合物对神经干细胞增殖的研究。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种硒代蛋氨酸的应用，为治疗神经退行性疾病、修复受损神经系统提供了又一新的药物来源，同时拓展了硒代蛋氨酸的市场应用前景。

本发明是这样实现的，一种硒代蛋氨酸的应用，所述应用为将所述硒代蛋氨酸用于制备促进神经再生的药物/保健品。

进一步地，将所述硒代蛋氨酸用于制备促进神经干细胞增殖的药物/保健品。

进一步地，将所述硒代蛋氨酸用于制备促进神经干细胞向神经元分化的药物/保健品。

进一步地，将所述硒代蛋氨酸用于制备治疗神经退行性疾病或治疗神经系统受损的药物/保健品。

本发明还提供了一种硒代蛋氨酸的应用，所述应用为将所述硒代蛋氨酸用于制备激活β-Catenin的活性而促进Wnt通路的激活的药物/保健品。

本发明还提供了一种硒代蛋氨酸的应用，所述应用为将所述硒代蛋氨酸用于制备抑制神经干细胞中GSK3β的活性的药物/保健品。

本发明还提供了一种硒代蛋氨酸的应用，所述应用为将所述硒代蛋氨酸用于制备激活神经干细胞中PI3K-Akt信号调控通路的药物/保健品。

本发明还提供了一种硒代蛋氨酸的应用，所述应用为将所述硒代蛋氨酸用于制备降低神经干细胞中GSK3β的活性，促进Wnt通路的激活的药物/保健品。

本发明与现有技术相比，有益效果在于：硒代蛋氨酸是一种抗氧化类的物质，本研究证实其对神经再生具有显著促进作用。本发明实施例提供的硒代蛋氨酸的应用，将所述硒代蛋氨酸用于制备促进神经再生的药物/保健品，对促进动物神经再生具有显著疗效。具体对神经退行性疾病或神经系统受损具有一定的预防和治疗作用，这对于神经系统的修复，改善记忆和认知具有非常重要的意义。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的通过CCK-8检测的硒代蛋氨酸对神经干细胞的活力的影响的结果示意图；

图2是本发明实施例1提供的采用免疫荧光检测的硒代蛋氨酸对神经干细胞增殖的影响的结果示意图；

图3是本发明实施例1提供的采用形态学观察检测的硒代蛋氨酸对神经干细胞增殖的影响的结果示意图，其中图3a为光学显微镜下观察神经球的形态及大小示意图，图3b为统计学t-test分析比对加药组和对照组中神经球的大小示意图；

图4是本发明实施例1提供的采用免疫印迹法检测的硒代蛋氨酸对与神经干细胞再生相关的Wnt信号通路中蛋白水平的结果示意图，其中图4a为免疫印迹结果示意图，图4b为统计学t-test灰度分析比对加药组和对照组中蛋白水平的差异示意图；

图5是本发明实施例1提供的采用免疫印迹法检测的硒代蛋氨酸对与神经干细胞再生相关的GSK3β蛋白水平的结果示意图，其中图5a为免疫印迹结果示意图，图5b为统计学t-test灰度分析比对加药组和对照组中蛋白水平的差异示意图；

图6是本发明实施例1提供的采用免疫印迹法检测的硒代蛋氨酸对与神经干细胞再生相关的PI3K-Akt信号通路中蛋白水平的结果示意图，其中图6a为免疫印迹结果示意图，图6b为统计学t-test灰度分析比对加药组和对照组中蛋白水平的差异示意图；

图7是本发明实施例2提供的通过免疫印迹检测的硒代蛋氨酸对神经干细胞向神经元分化的影响的结果示意图，其中图7a为免疫印迹结果示意图，图7b为统计学t-test灰度分析比对加药组和对照组中蛋白水平的差异示意图；

图8是本发明实施例2提供的通过免疫荧光检测硒代蛋氨酸对神经干细胞向神经元分化的影响的体外研究结果示意图；

图9是本发明实施例3提供的通过免疫荧光检测的硒代蛋氨酸对小鼠脑内海马体中神经再生的影响结果示意图；

图10是是本发明实施例3提供的通过免疫荧光检测的硒代蛋氨酸对小鼠脑内海马体中神经元增殖的影响的检测结果示意图；

图11是本发明实施例3提供的硒代蛋氨酸对小鼠脑内神经再生通路中Wnt信号通路相关激酶的水平的影响的结果示意图，其中图11a为免疫印迹结果示意图，图11b为统计学t-test灰度分析比对加药组和对照组中蛋白水平的差异示意图；

图12是本发明实施例3提供的硒代蛋氨酸对小鼠脑内神经再生通路中GSK3β激酶的水平的影响的结果示意图，其中图12a为免疫印迹结果示意图，图12b为统计学t-test灰度分析比对加药组和对照组中蛋白水平的差异示意图；

图13是本发明实施例3提供的硒代蛋氨酸对小鼠脑内神经再生通路中PI3K-Akt信号通路相关激酶的水平的影响的结果示意图，其中图13a为免疫印迹结果示意图，图13b为统计学t-test灰度分析比对加药组和对照组中蛋白水平的差异示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

神经再生是指神经干细胞增殖、分化、迁移、整合到神经回路中生成功能性神经元的过程。成年哺乳动物的中枢神经系统中均存在神经干细胞，并且能够整合入神经回路与其它神经元形成突触联系进而发挥功能。

本发明实施例提供了一种硒代蛋氨酸的应用，所述应用为将所述硒代蛋氨酸用于制备促进神经再生的药物/保健品。

进一步地，药物/保健品用于治疗神经退行性疾病或治疗神经系统受损。

硒代蛋氨酸是一种抗氧化类的物质，本研究证实其对神经再生具有显著促进作用。本发明实施例提供的硒代蛋氨酸的应用，将所述硒代蛋氨酸用于制备促进神经再生的药物/保健品，对促进动物神经再生具有显著疗效。具体对神经退行性疾病或神经系统受损具有一定的预防和治疗作用，这对于神经系统的修复，改善记忆和认知具有非常重要的意义。

进一步地，所述药物/保健品用于促进神经干细胞增殖。

具体地，所述药物/保健品中硒代蛋氨酸的浓度为1～45μM。硒代蛋氨酸对神经干细胞的活力影响存在与时间相关的剂量效应，作用12h时，随着硒代蛋氨酸浓度升高，细胞活力逐渐增强，但总体作用效果不明显；当作用时间达到24h时，1～45μM的Se-Met对于NSCs的增殖具有非常好的促进效果，而高浓度(50μM以上)的Se-Met导致细胞活力明显下降(p<0.05)，说明高浓度的Se-Met对NSCs的存活具有显著的损伤作用；当Se-Met作用时间达到48h之后，1～45μM的Se-Met都能够显著提高神经干细胞的活力(p<0.05)，对NSCs的增殖具有显著的促进作用，而50μM以上的Se-Met则导致NSCs的细胞活力明显下降，具有一定的细胞毒性。

具体地，所述药物/保健品用于激活神经干细胞中β-Catenin的活性而促进Wnt通路的激活。Wnt通路在神经再生的过程中发挥非常重要的作用，在NSCs增殖的过程中，加入Se-Met的NSCs的β-catenin的含量有上升，但是没有显著性差异，而抑制其活性的磷酸化β-catenin水平显著下降(p<0.05)，磷酸化β-catenin比β-catenin的水平显著下降。由此可知，在NSCs中加入Se-Met之后，β-catenin的活性抑制作用被缓解，其活性获得激活。具体表现在，β-catenin下游的细胞周期蛋白D(Cyclin-D)能够促进细胞的有丝分裂，在细胞增殖的过程中起到重要作用。在NSCs中加入Se-Met之后，Cyclin-D的表达量显著上升，从而加快NSCs的有丝分裂过程，促进其快速增殖。

具体地，所述药物/保健品用于抑制神经干细胞中糖原合成激酶3β(GSK3β)的活性。GSK3β在调节细胞的增殖、分化、存活以及凋亡的过程中均起到一定的作用，在NSCs中加入Se-Met后，GSK3β的蛋白水平显著下降。而磷酸化的GSK3β(P-GSK3β)能够抑制GSK3β的活性，在NSCs中加入Se-Met后，p-GSK3β的水平显著升高，磷酸化GSK3β比GSK3β的比值显著上升。由此可知，在NSCs中加入Se-Met能够显著抑制GSK3β的活性。

具体地，所述药物/保健品用于激活神经干细胞中PI3K-Akt信号调控通路。PI3K-Akt信号通路在细胞的增殖、抑制细胞凋亡、维持干细胞多能性等方面具有重要作用，同时也能够调控海马齿状回颗粒下层区以及其他脑区的神经再生的发生过程。Akt即蛋白激酶B，参与调控很多生物反应过程，包括神经再生、细胞的增殖、生长及凋亡。此外，Akt具有激活蛋白的磷酸化的功能，Akt可以促进GSK3β的磷酸化，从而降低GSK3β的活性。在NSCs中加入Se-Met后，NSCs中Akt的蛋白变化水平没有发生显著性变化，而磷酸化Akt(Thr-308)的水平显著上升，磷酸化Akt比总Akt的比值显著上升。由此可知，在NSCs中加入Se-Met，能够显著激活Akt的活性。

PI3K即磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)，主要起激活Akt的作用。在NSCs中加入Se-Met后，磷酸化PI3K的蛋白水平显著升高，而总PI3K的蛋白含量没有显著变化，磷酸化PI3K(Tyr-458)与总PI3K的比值呈显著上升趋势。由此可知，加入Se-Met之后PI3K的活性显著上升，继而促进Akt的表达。

综合以上，Se-Met能够激活神经干细胞中PI3K/Akt/Wnt通路的相关蛋白，继而促进NSCs的增殖。

进一步地，所述药物/保健品用于促进神经干细胞向神经元分化。在NSCs中加入Se-Met后，Se-Met中的神经元数量增多，且密度也相对更加密集从单个神经元的形态比较，加入Se-Met之后，神经元的树突数量明显增加，并且轴突的长度和宽度都显著增加。此外，加入Se-Met之后，神经元(NeuN)中的蛋白水平呈显著上升的趋势，而星形胶质细胞(GFAP)的蛋白水平呈显著下降的趋势。这些结果表明：Se-Met能够促进体外神经干细胞向神经元分化。

具体地，所述药物/保健品用于激活转基因小鼠脑内PI3K-Akt信号调控通路。在Se-Met治疗之后在小鼠的海马中，PI3K的总蛋白含量有上升趋势，但没有显著性差异，磷酸化PI3K的蛋白水平呈显著上升趋势，磷酸化PI3K与PI3K的比值呈显著上升趋势。这说明加入Se-Met之后，PI3K的活性被显著提升。加入Se-Met之后Akt的蛋白水平呈显著上升趋势，而磷酸化Akt的蛋白水平呈上升趋势，但没有显著性差异，磷酸化Akt与Akt的比值呈上升趋势，加入Se-Met对Akt的活性有提升作用。以此可知，在NSCs中加入Se-Met后，PI3K-Akt信号通路被激活，促进了NSCs的增殖过程。

具体地，所述药物/保健品用于降低转基因小鼠脑内GSK3β的活性，促进Wnt通路的激活。具体表现在，在加入Se-Met后，小鼠的海马中Akt下游的GSK3β的蛋白表达水平没有显著性变化，而磷酸化的GSK3β(ser9)的蛋白水平呈显著上升趋势，磷酸化GSK3β与总GSK3β的比值呈显著上升趋势，这表明加入Se-Met之后GSK3β的活性被显著抑制。同时在Wnt通路中起重要作用的β-Catenin和Cyclin-D在加入Se-Met之后活性都得到提升，其中总β-catenin的蛋白水平在加入Se-Met之后没有显著性变化，而磷酸化的β-catenin的蛋白水平显著性下降，磷酸化β-catenin与β-catenin的比值显著性下降；加入Se-Met之后Cyclin-D的蛋白水平显著升高。这些均表明在加入了Se-Met之后GSK3β的抑制作用被降低，Wnt通路进一步被激活，从而促进了海马体内NSCs的增殖。

以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明，以下实施例中所用的药物名称及实验材料如下：

硒代蛋氨酸(Seleno-DL-methionine)购买自sigma，单一化合物，纯度≥99％，白色粉末状，-18℃保存。细胞来源：从新生转基因小鼠的脑海马区分离原代神经细胞培养之后，通过流式细胞仪分选获取。

实施例中所用的主要试剂及厂家如表1所示，主要仪器如表2所示。

表1

表2

实施例1

将硒代蛋氨酸(Se-Met)以10μM的浓度加入到神经干细胞(neural stem cell，NSCs)的细胞培养基中以观察其对神经干细胞的增殖作用。采用CCK-8法检测不同浓度Se-Met对神经干细胞活力的影响；神经干细胞经Se-Met预处理后，通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和DAPI免疫荧光检测神经干细胞的增殖；通过形态学观察分析检测神经干细胞聚集成神经球的速率来判定Se-Met对神经干细胞增殖的影响；通过免疫印迹法(Westen Blot)检测与神经干细胞增殖相关的蛋白变化，来验证Se-Met对神经干细胞的增殖作用。

(1)CCK-8检测神经干细胞的活力，结果为：参见图1，硒代蛋氨酸对神经干细胞的活力影响存在与时间相关的剂量效应，作用12h时，随着硒代蛋氨酸浓度升高，细胞活力逐渐增强，但总体作用效果不明显；当作用时间达到24h时，10μM的Se-Met对于NSCs的增殖具有非常好的促进效果，而高浓度(50μM以上)的Se-Met导致细胞活力明显下降(p<0.05)，说明高浓度的Se-Met对NSCs增殖具有显著的抑制作用；当Se-Met作用时间达到48h之后我们可以看出，1μM，5μM，10μM的Se-Met都能够显著提高细胞的活力(p<0.05)，对NSCs的增殖具有显著的促进作用，其中10μM组表现出促增殖作用最强，而高浓度的Se-Met则导致NSCs的细胞活力明显下降。这些结果表明，Se-Met在低浓度(大于等于1μM、低于50μM)的情况下能够促进神经干细胞的增殖，而高浓度(50μM以上)的Se-Met则具有一定的细胞毒性。所以，Se-Met对神经干细胞增殖的作用浓度为1～45μM，其中最佳作用浓度为10μM，作用时间为48h。

(2)免疫荧光检测神经干细胞的增殖，结果为：参见图2，采用BrdU特异性标记新生神经干细胞和DAPI来特异性标记细胞，经过免疫荧光检测分析之后发现，使用10μM的Se-Met处理48h后新生神经干细胞的数量相对增加。

(3)使用形态学观测检测神经干细胞增殖的速率，结果为：参见图3，使用10μM的Se-Met处理神经干细胞48小时，NSCs增殖的快慢决定了神经球的大小，使用显微镜观察分析，通过Image J软件分析测定，结果显示加入Se-Met之后NSCs成球的大小以及数量都显著增加(图3b，p<0.001，n＝3)。

(4)Wnt通路在神经再生的过程中发挥非常重要的作用，因此首先通过Western Blot检测了Wnt通路中的中心蛋白——β连环蛋白(β-catenin)以及其磷酸化水平，结果如图4a所示，在NSCs增殖的过程中加入Se-Met组中的NSCs的β-catenin的含量有上升，但是没有显著性差异，而抑制其活性的磷酸化β-catenin水平显著下降(p<0.05)，磷酸化β-catenin比β-catenin的水平显著下降(图4b)。结果表明：在NSCs中加入Se-Met之后，对β-catenin活性的抑制作用被缓解。

β-catenin下游的细胞周期蛋白D(Cyclin-D)能够促进细胞的有丝分裂，在细胞增殖的过程中起到重要作用。我们检测了Cyclin-D的蛋白水平(图4a)，结果表明：NSCs中加入Se-Met之后，Cyclin-D的表达量显著上升(图4b)，从而加快NSCs的有丝分裂过程，促进其快速增殖。

以上结果表明：在转基因模型的NSCs中，Se-Met能够通过激活β-Catenin的活性继而促进Wnt通路的激活，促进NSCs的增殖过程。

糖原合成激酶3β(GSK3β)在调节细胞的增殖、分化、存活以及凋亡的过程中均起到一定的作用，我们研究其在NSCs增殖的过程中的作用，结果显示：参见图5a，加入Se-Met以后，GSK3β的蛋白水平相对于对照组(未添加Se-Met组)显著下降，磷酸化的GSK3β(p-GSK3β)能够抑制GSK3β的活性，因此我们同时检测了p-GSK3β的水平。结果显示：p-GSK3β的水平显著升高，磷酸化GSK3β比GSK3β的比值显著上升(图5b)，说明在NSCs中加入Se-Met能够显著抑制GSK3β的活性。

PI3K-Akt信号通路在细胞的增殖、抑制细胞凋亡、维持干细胞多能性等方面具有重要作用，同时也能够调控海马齿状回颗粒下层区以及其他脑区的神经再生的发生过程。Akt即蛋白激酶B，参与调控很多生物反应过程，包括神经再生，细胞的增殖，生长，凋亡，同时Akt具有激活蛋白的磷酸化的功能，Akt可以促进GSK3β的磷酸化，从而降低GSK3β的活性。检测NSCs中Akt的蛋白变化水平(图6a)，结果显示：总Akt的蛋白水平没有发生显著性变化，而磷酸化Akt(Thr-308)的活性显著上升，磷酸化Akt比总Akt的比值显著上升(图6b)，表明在NSCs中加入Se-Met能够显著激活Akt的活性。PI3K即磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)，主要起激活Akt的作用。在NSCs中我们发现磷酸化PI3K的蛋白水平显著升高，而总PI3K的蛋白含量没有显著变化，磷酸化PI3K(Tyr-458)与总PI3K的比值呈显著上升趋势(图6b)。这表明加入Se-Met之后PI3K的活性显著上升，继而促进Akt的表达。以上结果表明：Se-Met能够激活PI3K/Akt/Wnt通路的相关蛋白，继而促进NSCs的增殖。

实施例2

在一些神经退行性疾病发病过程中神经元的缺失与凋亡是影响认知的重要原因，而且海马体齿状回颗粒下层的神经再生被抑制，继而导致新生的神经干细胞向神经元分化出现障碍，也被认为是造成认知损伤的主要原因，因此本实施例探究Se-Met能否促进NSCs向神经元分化，进而修复受损的神经系统。

在更换神经干细胞的培养基之后，持续加入Se-Met作用14天，贴壁的神经球开始向四周生长出神经纤维丝，其中Se-Met组神经球周围生长出神经纤维丝的数量明显多于对照组，通过免疫荧光染色发现在神经球周围出现微管相关蛋白(MAP2)标记的神经元，并且Se-Met组分化得到的神经元的数量较对照组(未加入Se-Met)多。继续培养到21天，通过免疫荧光检测发现，Se-Met组中的MAP2标记的神经元数量较对照组多，并且密度也相对更加密集；我们从单个神经元的形态比较可以发现，加入Se-Met之后，神经元的树突数量明显增加，并且轴突的长度和宽度都显著增加(图8)。同时通过蛋白定量检测神经元(NeuN)和星形胶质细胞(GFAP)发现(图7a)，加入Se-Met组中的NeuN蛋白水平相对对照组呈显著上升的趋势，而GFAP的蛋白水平相对对照组呈显著下降的趋势(图7b)。这些结果表明：Se-Met能够促进体外神经干细胞向神经元分化(图8)。

实施例3

本实施例通过在动物水平上研究Se-Met对神经干细胞及神经干细胞向神经元分化的影响。

实验转基因小鼠购置于购自于美国Jax实验室，置于SPF级动物饲养中心，光照和黑暗各12小时循环往复，水和食物充足。取24只四月龄小鼠分为2组，每组雌雄各6只。硒代蛋氨酸通过溶解于水的方式，以6ug/mL的浓度持续给药90天。通过免疫荧光检测脑切片的Nestin和NeuN水平，通过Westenblot检测脑组织中相关蛋白激酶的变化水平，进一步探究Se-Met在动物体内对神经干细胞的影响。

(1)脑内神经干细胞数量检测

我们在体外实验证实了Se-Met能够促进神经干细胞的增殖，那么在小鼠中是否有促进海马体内神经干细胞的增殖作用就成了我们的研究重点。巢蛋白(Nestin)能够特异性识别神经干细胞，首先通过免疫荧光实验，发现在小鼠在经过Se-Met治疗之后，在小鼠脑内海马体齿状回区域出现Nestin标记的神经干细胞的数量显著多于对照组(图9)，同时使用神经核蛋白(NeuN)特异性标记神经元和BrdU特异标记新生细胞，结果显示加入Se-Met治疗之后，新生的神经元数量相对对照组增加(图10)。

此外，在Se-Met治疗之后小鼠的海马体中，PI3K的总蛋白含量有上升趋势，但没有显著性差异，磷酸化PI3K的蛋白水平较对照组呈显著上升趋势，磷酸化PI3K与PI3K的比值呈显著上升趋势。这说明加入Se-Met之后，PI3K的活性被显著提升；通过检测PI3K下游Akt蛋白表达水平，结果如图13a所示，加入Se-Met之后Akt的蛋白水平较对照组呈显著上升趋势，而磷酸化Akt的蛋白水平呈上升趋势，但没有显著性差异，磷酸化Akt与Akt的比值呈上升趋势(图13b)，加入Se-Met对Akt的活性有提升作用。以上结果表明，在转基因模型小鼠中加入Se-Met治疗之后，PI3K-Akt信号通路被激活，促进了NSCs的增殖过程。

检测Akt下游的GSK3β的蛋白表达水平(图12a)，结果显示：加入Se-Met组和对照组(未加入Se-Met)中GSK3β的总蛋白水平没有显著性变化，而磷酸化的GSK3β(ser9)的蛋白水平呈显著上升趋势，磷酸化GSK3β与总GSK3β的比值呈显著上升趋势(图12b)，这表明加入Se-Met之后GSK3β的活性被显著抑制。同时在Wnt通路中起重要作用的β-Catenin和Cyclin-D在加入Se-Met之后活性都得到提升，其中总β-catenin的蛋白水平在加药组和对照组中没有显著性变化，而磷酸化的β-catenin的蛋白水平较对照组显著性下降，加药组磷酸化β-catenin与β-catenin的比值显著性下降(图11b)；加入Se-Met之后Cyclin-D的蛋白水平显著升高(图11b)，这些数据表明在加入了Se-Met之后GSK3β的抑制作用被降低，Wnt通路进一步被激活，从而促进了海马体内NSCs的增殖。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。