雌激素受体和使用方法

专利名称：雌激素受体和使用方法
雌激素受体和使用方法本申请是申请号为200580007467. 8 (PCT/US2005/007857)，申请日为 2005 年 3 月 10日的中国发明专利申请“雌激素受体和使用方法”的分案申请。继续申请数据本申请要求享有2004年3月10日提交的美国临时申请系列号60/552，067和2005 年1月13日提交的60/643，469的利益，其每篇都在这里引作参考。政府资助本文所述的发明是在健康和人类服务部(D^artment of Health and Human Services)资助号CA84328的支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
雌激素是在卵巢、睾丸和可能的肾上腺皮质中形成的类固醇化合物的总称。雌激素和具有雌激素活性的化合物的实例包括二乙基己烯雌酚、己烯雌酚二磷酸酯、己雌酚、聚磷酸雌二醇、溴苯雌酚、氯烯雌醚、己二烯雌酚、二乙基己烯雌酚、丙甲雌酚、双醋羟雌酮、6， 9-去氢马烯雌酮、马烯雌酮、雌二醇、雌三醇、雌酮、乙炔雌二醇、美雌醇、mexestrol、雌三醇环戊醚和炔雌醚。雌激素调节生殖组织和乳房、心血管、骨、肝和脑组织中的多种生理过程。 雌激素也用在口服避孕药中。雌激素的其它用途包括，缓解绝经的不适，抑制泌乳，和治疗骨质疏松症、先兆流产和各种功能性卵巢病症。抗雌激素药被用于治疗转移性乳腺癌和晚期前列腺癌。雌激素的作用由雌激素受体介导。在1986年克隆了首个雌激素受体(ER) (Green 等，Nature, 320 :134(1986)和 Greene 等，Science, 231 1150 (1986))。在 1995 年之前， 认为仅有一个负责天然的和合成的雌激素和抗雌激素药的所有生理和药理作用的雌激素受体。然而，在1995年，克隆了第二个雌激素受体(Kuiper等，PNAS，93 :5925 (1996))。发现的首个雌激素受体现在称作雌激素受体-α (ER- α )，而第二个雌激素受体称作雌激素受体-β (ER- β )。ER-α 和 ER-β 共有共同的结构体系(Zhang 等，FEBS Letters, 546 :17(2003)和 Kong等，Biochem. Soc. Trans. ,31 :56(2003))。二者都由3个独立的但是能相互作用的功能结构域组成N-末端A/B结构域、C或DNA-结合结构域和D/E/F或配体-结合结构域 (

图1)。ER- α的N-末端结构域编码独立于配体的激活功能(AF-I)，即参加与辅激活物的相互作用和靶基因的转录活化的区域。DNA-结合结构域或C结构域含有2个锌指结构，其在受体二聚化和与特定的DNA序列的结合中起重要作用。C-末端D/E/F结构域是一种配体-结合结构域，其能介导配体结合、受体二聚化、核转位和配体-依赖性的反式激活功能 (AF-2)。AF-I和AF-2对转录控制的相对贡献以细胞特异性的和DNA 启动子特异性的方式变化(Berry 等，EMBO J.，9 :2811(1990)和 Tzukerman 等，Mol. Endocrin.，8 :21(1994)) 已经表明，缺少ER-α基因的全长基因产物的前173个氨基酸的46-kDa ER-α同种型(A/B或AF-I结构域)，源自跳过外显子1的ER-α基因的可变剪接(Flouriot等，EMBO J.，19 :4688(2000))。该可变剪接事件会产生mRNA，其在有利于翻译起始的Kozak序列内具有与原始可读框的剩余部分符合读框的AUG。因此，ER-a的该新同种型称作ER-a 46，而原始同种型称作 ER-α 66(Flouriot 等，EMB0J.，19 4688 (2000)) ER-α 46 形成同二聚体，并结合雌激素反应元件(ERE)，且它也可以与ER-α 66形成异二聚体(Flouriot等，EMBO J.， 19 :4688(2000))。与ER-α 66同二聚体相比，ER-α 46同二聚体表现出更高的对ERE的亲和力。而且，ER-α 46/66异二聚体比ER-α 66同二聚体优先形成，且ER-α 46竞争地起作用，以抑制由结合了配体的-ER-α 66的AF-I结构域介导的反式激活，但是不影响AF-2-依赖性的反式激活(Floutiot等，EMBO J.，19 :4688 (2000))。因此，认为ER-α 46是天然产生的ER-α同种型，其调节由ER-a 66的AF-I结构域介导的雌激素信号传导。ER-α能在大约15-30%内腔(luminal)上皮细胞中表达，但是根本不在正常人乳房中的任何其它细胞类型中表达。双标记免疫荧光技术揭示，在正常的人和啮齿动物乳腺中，ER-α -表达细胞能与用增殖标记物标记的细胞分开(Clarke等，Cancer Res. ,57 4987(1997))。在导管增生的最早期，ER-α表达会增加，甚至随着异型的增加而增加更多，从而在低和中等核级的不典型导管增生和原位导管癌中的大部分细胞含有ER-α (Khan 等，Cancer Res.，54 :993 (1994)和 Lawson 等，Lancet，351 1787 (1994))。随着 ER-α 表达的增加，受体表达和细胞增殖之间的反相关变得调节异常(Sioker等，Amer. Jour. Path.， 155 :1811 (1999))。大约70 %的侵入性乳腺癌表达ER- α，且这些肿瘤中的大部分含有 ER-α -阳性的增殖细胞(Clarke 等，Cancer Res. ,57 :4987 (1997))。雌激素受体是能控制许多生理过程的配体-活化的转录因子核受体超家族的成员。该控制经常通过调节基因转录来发生(Katzenellenbogen和Katzenellenbogen， Breast Cancer Res.，2 :335 (2000) ；Hull 等，J. Biol. Chem.，276 :36869 UOOl) ；McDonnell 和Norris，Science, 296 :1642 (2002))。雌激素受体使用多种机理，以激活或抑制它的靶基因的转录。这些机理包括(a)在雌激素反应元件处，配体-占据的受体与DNA的直接相互作用，随后是转录辅调节物(coregulator)或介质复合物的募集，(b)配体-占据的ER 与其它转录因子相互作用，所述其它转录因子例如AP-I (Kushner等，J. Steroid Biochem. Mol. Biol. ,74 :311 (2000))、Spl (Safe, Vitam. Horm. ,62 :231 (2001))或 NF- κ B (McKay 和Cidlowski，Endocr. Rev.，20 :435(1999)),或(c)通过隔离一般的/普通的转录组分， 间接调节基因转录(Harnish 等，Endocrinology, 141 :3403(2000)和 Speir 等，Circ. Res. ,87 :1006(2000))。另外，雌激素受体通过这些不同的机理调节转录的能力，似乎是细胞类型特异性的，可能是由于在每种细胞类型中可得到的转录辅调节因子的补体的差异(Cerillo 等，J. Steroid Biochem. Mol. Biol.，67 :79 (1998) ；Evans 等，Circ. Res.，89 823(2001) ；Maret 等，Endocrinology, 140 :2876 (1999))。同样，转录调节依赖于配体的性质，其中各种天然的和合成的选择性的雌激素受体调节剂，通过这些不同机理中的每一种，起雌激素受体激动剂或拮抗剂的作用(Siang和Brown, Science, 295 =2465(2002)； Katzenellenbogen 禾口 Katzenellenbogen, Science,295 :2380(2002) ；Margeat 等，J. Mol. Biol.，326 77 (2003) ；Dang 等，J. Biol. Chem.，278 :962 (2003))。存在由雌激素介导的另一个信号传导途径，也称作“非经典的”、“非基因组的”或 “膜信号传导”途径，其包含胞质蛋白、生长因子和其它膜-启动的信号传导途径(Segars 等，Trends Endocrin. Met. , 13 :349 Q002))。已经表明，几种细胞内的信号传导途径能与快速的雌激素-启动的作用通讯腺苷酸环化酶途径(Aronica等，PNAS，91 :8517 (1994))、磷脂酶 C 途径(Le Mellay 等，J. Cell. Biochem. ,75 :138 (1999))、G-蛋白-偶联的受体-活化的途径(Razandi等，Mol. Endocrin.，13 :307(1999))和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK) 途径(Watters等，Endocrinology, 138 :4030(1997))。但是，迄今为止描述的所有膜形式， 都与 ER- α 有关，但与 ER- β 无关(Segars 等，Trends Endocrin. Met.，13 :349 (2002))。病理上，雌激素信号传导已经与乳腺癌和子宫内膜癌的高风险相关联(Summer 禾口 Fuqua，Semin. Cancer Biol. , 11 :339(2001) ；Turner 等，Endocr. Rev. , 15 :275(1994)； Farhat 等，FASEB J.，10 :615 (1996) ；Beato 等，Cell，83 :851(1995) ；Dobrzycka 等，Endo. Rel. Cancer, 10 :517(2003)).结果，已经发现雌激素受体是大多数这样的癌症的开始和发展所必需的。雌激素受体-阳性的乳腺癌的当前内分泌疗法主要针对雌激素水平、雌激素受体水平或雌激素和雌激素受体的活性设计。在早期乳腺癌的管理中，部分的抗雌激素药他莫昔芬的使用，已经清楚地证实了无疾病和总存活的增加。另外，近期的研究证实，他莫昔芬可以用作激素-依赖性的乳腺癌的化学预防剂。使用他莫昔芬的长期疗法的主要问题是它的亲子宫作用，这会导致子宫内膜癌的高风险，和对他莫昔芬的获得性临床抗性。这已经导致了对更好的选择性雌激素受体调节剂(SERM)的迫切寻求，所述调节剂在各种雌激素反应靶组织中表现出最佳的激动或拮抗活性。因此，需要可以用于筛选能调节雌激素信号传导的其它方法和材料，以及可以用于调节雌激素信号传导的方法和材料。发明概述本发明提供了分离的抗体，其能特异性地结合SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列， 或其免疫原性片段，优选地，SEQ ID NO :1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。任选地，抗体是人源化的抗体。抗体可以共价地附着化合物，例如，化疗剂或检测标记例如荧光标记。抗体可以存在于组合物中，且组合物可以包含药学上可接受的载体。还提供了试剂盒，其包含本发明的抗体。本发明也提供了制备抗体的方法。抗体可以是多克隆的或单克隆的。该方法包括， 给动物施用具有SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段，优选地，SEQ ID NO 1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列。该方法还包括从动物分离抗体，其中该分离的抗体能特异性地结合氨基酸序列。多肽或其免疫原性亚基可以共价地附着载体多肽。分离可以包括，从动物得到产生该抗体的细胞，和使用该细胞制备能产生单克隆抗体的杂交瘤。 本发明还包括通过该方法生产的多克隆抗体和通过该方法生产的单克隆抗体。本发明也涉及包含外源编码区的细胞，其中该编码区编码包含SEQ ID N0:20的多肽。编码区可以编码具有与SEQ ID NO :20具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有ER-α 36活性。编码区可以可操作地连接到组成型启动子。细胞可以是真核细胞或原核细胞。本发明还提供了表达这样的多肽的细胞。本发明还提供了鉴别结合多肽的试剂的方法。该方法包括，组合包含SEQ ID Ν0 1所述的氨基酸序列的多肽和试剂，检测试剂和多肽之间的复合物形成，检测多肽活性的改变，或其组合。通过直接检测试剂与多肽的结合，使用竞争结合测定检测试剂与多肽的结合，或其组合，可以检测试剂与多肽的结合。任选地，该方法也包括，确定试剂是否结合包含 SEQ ID NO 18 的多肽。本发明还提供了检测多肽的方法。一方面，该方法包括提供细胞，分析细胞中具有 ER- α 36活性和36kDa分子量的多肽，所述分子量如按照在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上电泳测得的，和确定细胞是否表达该多肽。细胞可以是离体的(ex vivo)或体内的。细胞可以是，例如，肿瘤细胞，例如乳腺肿瘤细胞。分析可以包括，使细胞接触能特异性地结合SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗体。分析可以包括，扩增 mRNA多核苷酸，以形成扩增的多核苷酸。扩增包括，使从细胞得到的多核苷酸接触引物对， 后者能扩增mRNA多核苷酸，其包括SEQ ID N0:22或SEQ ID NO :25，或其组合，其中扩增的多核苷酸的存在表明该细胞表达多肽。引物对的一个引物可以选自SEQ ID N0:22的核苷酸，与SEQ ID NO 25的核苷酸互补的核苷酸，或其组合。本发明也提供了抑制细胞的ER-α 36活性的方法。该方法包括，使表达具有SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的多肽的细胞接触能抑制ER-a 36活性的化合物。这样的化合物可以是能特异性地结合具有SEQ ID NO :1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽的抗体。细胞可以是体内的或离体的，且任选地可以是ER-α 66阴性的，ER-α 46阴性的，或其组合。在有些方面，化合物不是抗雌激素药。本发明还提供了分离的多肽，其包含SEQ ID NO=I的氨基酸13-27所述的氨基酸序列，优选地SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列，更优选地，SEQ ID NO :20所述的氨基酸序列。在另一个方面，分离的多肽与SEQ ID NO :20具有至少70%同一性，其中该多肽具有 ER-α 36活性。本发明也包括SEQ ID NO :1的免疫原性片段。当这些术语出现在说明书和权利要求书中时，术语“包含”和其变体不具有限制含义。除非另有限定，可互换地使用“一个(a)”、“一个(an)”、“该(the) ”和“至少一个”，且指一个或多于一个。附图简述图1解释了人雌激素受体-a (ER-α)同种型的结构域结构代表。显示了结构域 (用A-F标记的)、氨基酸序列编号、AF-I和AF-2、DNA结合结构域、配体-结合结构域和二聚化结构域。也指示了磷酸化位点和每个结构域的功能。图2是证实ER-α的膜和基因组信号传导途径之间的可能的通讯的示意图。Cav_l 代表小窝蛋白-1，ER-α，雌激素受体-α ；RTK，受体酪氨酸激酶；Ras，Ras癌基因；Mek， MAP/ERK激酶；MAPK，促分裂原活化蛋白激酶；PI3K，磷酸肌醇-三磷酸激酶；AKT，蛋白激酶 13 ；PDKl，磷酸肌醇-依赖性的蛋白激酶；RSK，p90核糖体S6激酶。图3是显示在有雌二醇(E》存在下，pRET-感染的MCFlOA细胞在软琼脂中生长成大菌落的照片。STl克隆在含有E2的软琼脂中表现出快速生长。分别包括MCF7和MCFlOA 细胞作为阳性和阴性对照。图4是显示pRET-感染的MCFlOA细胞中的小窝蛋白_1 (Cavl)表达的下调的蛋白印迹。通过使用兔抗-Cav-I抗体(N20)的蛋白印迹，分析来自不同细胞系的等量的全细胞提取物。用箭标指示Cav-I的位置，且在每个泳道上面指示在每个泳道中分析的细胞提取物。图5是显示pRET-感染的MCFlOA细胞中的ER-α表达的下调的蛋白印迹。通过使用针对ER-a (H222)和ER-β的抗体的蛋白印迹，分析来自不同细胞系的等量的全细胞提取物。用箭标指示ER-α和ER-β的位置，且在每个泳道上面指示在每个泳道中分析的细胞提取物。图6是显示pRET-感染的MCFlOA细胞中的ERK1/2磷酸化的活化的蛋白印迹。通过使用针对ERK1/2和磷酸化的ERK1/2的抗体的蛋白印迹，分析来自细胞系的等量的全细胞提取物。图7是显示3种ER-α蛋白在Cav-Ι单倍体不足(haploinsuff icient)细胞STl 和ST3和MCF7乳腺癌细胞中的存在的蛋白印迹。通过使用针对ER-α的Η222抗体的蛋白印迹，分析来自细胞系的等量的全细胞提取物。用箭标指示ER- α 66、ER- α 46和ER- α 36 的位置，且在每个泳道上面指示在每个泳道中分析的细胞提取物。图8描绘了人ER-α基因的基因组组织。用箭标指示多个启动子的位置。用AUG 和UGA指示翻译起始和终止位置。用编号的框显示外显子。也用框中的外显子1'显示内含子1。下图显示了 ER-α同种型的mRNA结构。用AAA指示聚腺苷酸化位点。图9是琼脂糖凝胶的图片，它显示了通过PCR分离能编ER- α 36的可读框的cDNA。 用箭标指示cDNA在凝胶中的位置。图10显示了 ER-α 36可读框的预测的氨基酸序列。用氨基酸序列(SEQ ID NO 20)左侧的编号，指示氨基酸位置。ER- α 36独有的最后的27个氨基酸标有下划线(SEQ ID NO :1)。图11显示了 ER-α 66、ER-α 46和ER-α 36的蛋白印迹分析。标记为ER-α 66、 ER-α 46和ER-a 36的泳道代表着用能编码所述的雌激素受体同种型的表达质粒转染、并在转染后2天裂解的HEK 293细胞的分离的培养物。用抗-ER-α抗体0122 ，免疫检测每种转染子的裂解物。来自MCF7细胞的细胞提取物用作阳性对照。用箭标指示ER-α 66、 ER- α 46 禾口 ER- α 36 的位置。图12显示了 (a)能编码ER-α 36且包含ER-α 36启动子的基因的5'侧翼序列的DNA序列(SEQ ID NO 22)，和(b)能编码ER- α 36且包含由外显子9编码的核苷酸的基因的3'侧翼序列的DNA序列(SEQ ID NO :25)。在5'侧翼序列中，推定的转录结合位点标有下划线，且也指示了能结合核酸序列的蛋白。也用箭标指示了 cDNA的起始位点。图13显示了不同的乳腺癌细胞MCF10A、T47D、MCF7和MDA-MB-231中的ER-α 36 的RNA印迹分析。用箭标指示了 ER- α 36和肌动蛋白的位置。图14显示了 ER- α 36对ER- α 66和ER- β的AF-1和AF-2结构域介导的转录转反式激活活性的抑制。(+Ε》，Ε2处理的细胞；(-Ε》，未用Ε2处理的细胞。图15显示，ER-a 36能介导由E2刺激的膜-启动的MAPK激酶途径。(a)蛋白印迹显示了用雌二醇-17 β (E2 β )处理ER 36-293细胞，会诱导Mekl/2和ERK1/2的快速磷酸化。P-Mekl/2和P-ERK1/2,分别是Mekl/2和ERK1/2的磷酸化形式。(b)血清(而不是E2 β )会诱导对照载体-293细胞中的ERK1/2的磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。(c)不同的雌激素和抗雌激素药会诱导ER36-293细胞中的ERK1/2的快速磷酸化。 P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。(d)他莫昔芬处理能组成型地刺激ER36-293细胞中的 ERK1/2磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。图16表明，ER-α 36能介导Ε2 β诱导的MAI3K激酶核信号传导，并刺激细胞生长。 (a) E2 β对MAPK激酶核信号传导的作用。用5XGal4_LUC，即含有5个DNA结合位点的萤光素酶报告质粒，和含有与Gal4DNA结合结构域融合的ELK转录活化结构域的Gal-ELK 表达载体(上图)，瞬时转染了 ER36-293和对照载体-293细胞。转染后，将细胞培养物维持在没有雌激素的培养基中36小时，然后加入E2 β (InM或IOnM) 12小时。具有标准差的萤
9光素酶活性代表着一式两份进行的超过3次实验。(b)E2i3和抗雌激素药能刺激ER36493 细胞的生长。显示了在490nm的吸光度数据。平均了超过5次独立实验的结果；显示了平均值和SEM。还通过成对的t-检验，评价了这些结果的统计学显著性。ER36-293和载体-293 细胞的P-值小于0. 001。图17表明，ER- α 36主要是基于膜的雌激素受体。(a)蛋白印迹分析ER-α 36在不同的确立的乳腺癌细胞系中的表达。剥离相同的印迹，并用抗-肌动蛋白抗体探测，以确保等量装载。(b) ER-α 36在ER-α 36转染的293细胞中的亚细胞定位。用ER-α 36特异性的抗体，免疫印迹不同的亚细胞级分中的ER-α 36。W，全细胞裂解物；ΡΜ，质膜；C，胞质溶胶；N，核。通过免疫印迹质膜、胞质溶胶、核和高尔基体的各种蛋白标记，检查亚细胞级分纯度。5' NT, 5'核苷酸酶；D4-GDI，GDP解离抑制剂；mSin3A，组蛋白重构复合物的组分； COPB，β外被蛋白。图18表明，Ε2 β能促进ER- α 66阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-231在软琼脂中的生长。在不存在Ε2β (0)、存在IOnM Ε2 β (Ε2)、存在IOnM Ε2 β和IOnM他莫昔芬(Ε2+ΤΑΜ) 和存在单独的IOnM他莫昔芬(TAM)的情况下，使MDA-MB-231细胞在软琼脂上生长3周。图19表明，Ε2 β能诱导ER- α 66阴性的乳腺癌细胞MDA_MB_231中的膜启动的雌激素信号传导。用雌二醇-17 β (E2 β )处理MDA-MB-231细胞，会诱导ERK1/2的快速磷酸化。用Ε2β (IOnM)处理细胞不同的时间点，使所述细胞裂解，并使用磷酸化依赖性的和非依赖性的抗体，通过蛋白印迹进行分析。本发明的优选实施方案的详述已经发现，小窝蛋白-1 (Cav-I)系统的下调会组成型激活促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)途径，激活雌激素受体-a (ER-α)的表达，和触发正雌激素信号传导。该发现首次提供了活化的ΜΑΗ(信号传导和乳房肿瘤发生(尤其是由雌激素刺激的乳腺癌发展)之间的清楚的联系。该发现有力地提示，Cav-I通过协调MAPK和雌激素信号传导途径之间的通讯，在维持乳房上皮细胞的正常生长中起重要作用，且它的下调可能有助于这2个重要途径的调节异常，这最终导致乳腺肿瘤发生。图2显示了雌激素信号传导途径和ΜΑΗ(信号传导途径的示意图。还已经鉴别和克隆了雌激素受体-α同种型。从位于原始的66-kDa ER-α (ER-α 66)基因的第一个内含子中的启动子，产生了雌激素受体-α的该36_kDa同种型(ER- α 36)。ER- α 36不同于ER- α 66，因为它缺少2个转录活化结构域(AF_1和AF_2)， 但是保留了 DNA-结合、二聚化和大部分的配体-结合结构域。ER-α 36的结构表明，ER-α 36 是雌激素信号传导的调节剂。ER-a 36也可以介导雌激素信号传导的膜作用，因为它主要在质膜上表达，且也在胞质溶胶和核中表达。已经将ER-β视作ER-a 66介导的雌激素信号传导的组成型调节剂。发现缺少 AF-I结构域的ER- α 46可以二聚化成ER- α 66，并抑制由ER- α 66的AF-1结构域介导的反式激活活性，这表明ER-CI46在由ER-CI66的AF-I结构域介导的功能活性中起调节作用。 ER- α 36缺少AF-I和AF-2结构域。因而，认为ER- α 36会抑制由ER- α 66的AF-I和AF-2 介导的生物功能，以及由ER- α 46的AF-2介导的功能。利用ER- α 36和ER- α 46介导的调节，其二者可能在不同的组织中以不同的水平表达，ER-a 66可以在不同的靶组织中不同地起作用。认为这样的机理能解释不同生物过程中的雌激素信号传导的多效性作用。
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本发明的多肽和肽模仿物(p^tidomimetic)本发明提供了多肽。如本文使用的，术语“多肽”泛指通过肽键连接到一起的2个或更多个氨基酸的聚合物。术语肽、寡肽和蛋白都包含在多肽的定义中，且这些术语可互换地使用。应当理解，这些术语不意味着氨基酸聚合物的特定长度，它们也无意暗示或区分多肽是否由重组技术、化学或酶促合成生成，或是天然产生。本文公开和描述了本发明范围内的多肽的多个实例。在天然产生的多肽或多核苷酸的情况下，优选地，分离这样的多肽或多核苷酸，并任选地纯化。“分离的”多肽或多核苷酸是从它的天然环境分开和分离的多肽或多核苷酸。“纯化的”多肽或多核苷酸是至少60%地不含、优选地75%地不含和最优选地 90%地不含它们天然地伴随的其它组分的多肽或多核苷酸。认为在它们天然发生的生物外面生产(例如，通过化学或重组方法)的多肽和核苷酸，是定义的分离的和纯化的，因为它们从未存在于天然环境中。“外源多肽”指外来多肽，即通常不存在于细胞中的多肽，或通常存在于细胞中、但是已经通过实验方法导入细胞中(例如，通过导入能编码该多肽的多核苷酸)的多肽。本发明的多肽可以是生物活性的。这样的生物活性在本文中称作“ER-a 36活性”。 可以用于确定本发明的多肽是否是生物活性的生物测定的实例包含，使能表达该多肽的细胞接触雌激素或抗-雌激素药，并测定在有雌激素或抗-雌激素药存在的情况下，与不表达本发明的多肽的对照细胞中的MAPK活性相比，MAPK途径的活性是增高还是降低。优选地， MAPK活性是ERK 1/2和Mek 1/2的磷酸化，且优选地，在有抗-雌激素药存在的情况下，本发明的多肽诱导的ERK1/2的磷酸化不减少。优选地，ER-a 36活性是膜启动的。通过暴露能表达具有对不同配体的ER-α 36活性的多肽的细胞，可以测量ER-α 36活性。可以使用的配体的实例，包括但不限于，雌酮(El)、17 α-雌二醇(Ε2α)、17β-雌二醇(Ε2β)、雌三醇(Ε3)、雌四醇(estetrol) (E4)或附着到不可透过膜的分子，例如牛血清清蛋白(BSA)的雌激素。通常，当待测ER- α 36活性限于膜启动的ER- α 36活性时，使用附着到不可透过膜的分子上的雌激素。使用的雌激素的量可以变化，且优选地，在InM至IOnM的范围内。暴露于雌激素的细胞优选地是休眠细胞。该暴露允许发生5-90分钟，然后裂解细胞，并通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离存在于细胞中的多肽。将分离的多肽转移到膜上后，使用针对非磷酸化和磷酸化形式的ERK 1/2和Mek 1/2的抗体，评价MAI3K途径的活化。任选地， 可以包括抗-雌激素药，例如他莫昔芬、40Η-他莫昔芬或ICI-182，780，以确定ERK 1/2的磷酸化是否对抗雌激素药不敏感。本发明提供了具有SEQ ID NO :20所述的氨基酸序列的多肽。该多肽，和本文所述的有关多肽，在本文中也称作ER-α 36、ER_ α 36同种型和ER受体α 36-亚基。如图1所示， 当与ER- α 66同种型相比较时，ER- α 36同种型缺少氨基-末端氨基酸残基1_183，羧基-末端氨基酸残基430-595，且在它的C-末端具有27个氨基酸残基的添加(见表1)。雌激素受体α异构体包括ER-α 36、ER-α 46、ER-α 66。雌激素受体β异构体包括ER-β。本发明也提供了雌激素受体，其包括ER-α 36同种型。无意进行限制，认为ER-α 36同种型能通过与ER- α 66、ER- α 46或ER- β形成二聚体，通过调节雌激素受体功能，来调节细胞对雌激素的反应。而且，认为ER- α 36缺少活化因子1 (AF-I)和活化因子2 (AF-2)活性，并因而缺少内在的转录活性。但是，认为ER- α 36保留了完整的二聚化结构域，其允许ER- α 36与 ER- α 46,ER- α 66或ER- β 二聚化。认为该相互作用允许ER- α 36调节含有雌激素受体的ER- α 46、ER- α 66 禾口 ER- β 的活性 c表 1氨基酸和核苷酸序列
权利要求
1.分离的抗体，其能特异性地结合SEQID NO :1所述的氨基酸序列的免疫原性片段， 所述免疫原性片段含有至少5个连续氨基酸。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体是人源化的抗体。
5.权利要求1的抗体，其中所述抗体是抗体片段。
6.权利要求1的抗体，其中所述抗体共价附着到化合物。
7.权利要求6的抗体，其中所述化合物是化疗剂。
8.权利要求6的抗体，其中所述化合物是检测标记。
9.权利要求8的抗体，其中所述检测标记是荧光标记。
10.组合物，其包含权利要求1的抗体。
11.权利要求10的组合物，还包含药学上可接受的载体。
12.制备抗体的方法，其包括给动物施用包含SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的免疫原性片段的多肽，和从该动物分离抗体，其中所述免疫原性片段含有至少5个连续的氨基酸，所述分离的抗体能特异性地结合该免疫原性片段。
13.权利要求12的方法，其中所述多肽共价附着到载体多肽上。
14.权利要求12的方法，其中所述分离包含从动物得到能产生该抗体的细胞，该方法还包含使用该细胞制备能产生单克隆抗体的杂交瘤。
15.通过权利要求12的方法生产的多克隆抗体。
16.通过权利要求14的方法生产的单克隆抗体。
17.包含外源编码区的细胞，其中所述编码区能编码包含SEQIDNO :20的第一个多肽， 或包含与SEQ ID NO :20具有至少90%同一性的氨基酸序列的第二个多肽，其中所述第二个多肽具有ER-α 36活性。
18.权利要求17的细胞，其中所述编码区可操作地连接到组成型启动子上。
19.权利要求17的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
20.权利要求17的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
21.能表达外源多肽的细胞，其中所述多肽包含SEQID NO :20，或包含与SEQ ID NO: 20具有至少90%同一性且具有ER- α 36活性的氨基酸序列。
22.权利要求21的细胞，其中所述编码区可操作地连接到组成型启动子上。
23.权利要求21的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
24.权利要求21的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
25.鉴别能结合多肽的试剂的方法，该方法包含组合包含SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的多肽和试剂，和检测试剂和多肽之间的复合物形成。
26.权利要求25的方法，其中通过选自下述的方法，检测所述试剂与多肽的结合直接检测试剂与多肽的结合，和使用竞争结合测定检测试剂与多肽的结合。
27.权利要求25的方法，还包含，确定试剂是否能结合包含SEQIDNO 18的多肽。
28.权利要求25的方法，还包含，确定试剂是否能抑制多肽的ER-α36活性。
29.检测多肽的方法，其包括提供离体细胞，确定所述细胞中是否表达具有36kDa分子量且具有如SEQ ID NO :20所示氨基酸序列或与SEQ ID NO :20具有至少90%同一性的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸钠 (SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳测得。
30.检测多肽的方法，其包括提供离体细胞，确定所述细胞中是否表达具有36kDa分子量且含有SEQ ID NO 1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳测得。
31.权利要求四或30的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
32.权利要求31的方法，其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。
33.权利要求四或30的方法，其中所述确定包括，使细胞接触能特异性地结合SEQID NO 1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗体。
34.权利要求33的方法，其中所述抗体共价附着到检测标记上。
35.权利要求34的抗体，其中所述检测标记是荧光标记。
36.权利要求四或30的方法，其中所述确定包括，扩增mRNA多核苷酸，以形成扩增的多核苷酸，其中所述扩增包含，使从细胞得到的多核苷酸接触引物对，后者能扩增mRNA多核苷酸，其包括SEQ IDN0:22或SEQ ID NO :25，或其组合，其中扩增的多核苷酸的存在表明该细胞表达多肽。
37.权利要求36的方法，其中引物对的一个引物选自SEQID NO 22的核苷酸，与SEQ ID NO 25的核苷酸互补的核苷酸，或其组合，且其中每个引物具有至少15个核苷酸。
38.抑制细胞的ER-α36活性的方法，其包括使能表达包含SEQID NO 1的氨基酸 13-27所述的氨基酸序列的多肽的细胞，接触能抑制ER-α 36活性的化合物。
39.权利要求38的方法，其中所述化合物包含权利要求1-9任一所述的抗体。
40.权利要求39的方法，其中所述化合物包含能特异性地结合包含SEQID Ν0:1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽的抗体。
41.权利要求38的方法，其中所述细胞是离体的。
42.权利要求38的方法，其中所述细胞是ER-α66阴性的。
43.权利要求38的方法，其中所述细胞是ER-α46阴性的。
44.权利要求38的方法，其中所述化合物不是抗-雌激素药。
45.在体外抑制细胞中的ERK1/2或ΜΕΚ1/2磷酸化的方法，其包括使细胞接触权利要求1-9任一所述的抗体；其中，所述细胞能表达具有36kDa分子量、能结合雌激素且包含SEQ ID NO :1的氨基酸 13-27所述的氨基酸序列的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳测得，且所述抗体的剂量能够抑制雌激素和SEQ ID N0:20的结合。
46.权利要求45所述的方法，其中所述抗体能特异性地结合包含SEQID N0:1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽。
47.分离的多肽，其由SEQID NO :1的氨基酸1-27所述的氨基酸序列或其修饰的序列组成，所述修饰的序列是通过添加、取代或缺失一个或多个邻接的或不邻接的氨基酸来修饰的SEQ ID NO :1的氨基酸1-27，并且所述修饰的序列能够刺激产生结合SEQ ID N0:1的氨基酸1-27的抗体。
48.分离的多肽，其由SEQID NO :1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列或其修饰的序列组成，所述修饰的序列是通过添加、取代或缺失一个或多个邻接的或不邻接的氨基酸来修饰的SEQ ID NO 1的氨基酸13-27，并且所述修饰的序列能够刺激产生结合SEQ ID NO 1的氨基酸13-27的抗体。
49.分离的多肽，含有共价附着到载体多肽上的权利要求47或48所述的多肽。
50.分离的多核苷酸，其编码权利要求47-49任一所述的多肽。
51.SEQ ID NO 1的免疫原性片段，含有SEQ ID NO=I中的至少5个连续氨基酸。
52.试剂盒，其包含权利要求1-9任一所述的分离的抗体和包装材料。
53.权利要求1-9任一所述的抗体用于制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于区分雌激素阳性和雌激素阴性的癌症。
54.权利要求53的用途，所述区分雌激素阳性和雌激素阴性的癌症是通过检测细胞中是否表达具有36kDa分子量且能够结合雌激素或抗雌激素的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸钠(SDQ -聚丙烯酰胺凝胶上的电泳测得。
55.权利要求1-9任一所述的抗体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗个体中雌激素相关的癌症，其中所述抗体能够抑制雌激素与细胞的SEQ ID N0:20的结合。
全文摘要
本发明提供了分离的多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO20具有至少70％同一性，其中该多肽具有ER-α36活性。本发明还提供了鉴别能能结合这样的多肽的试剂的方法，检测这样的多肽的方法，和改变这样的多肽的活性的方法。还提供了能特异性地结合SEQ ID NO1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗体，和制备和使用这样的抗体的方法。
文档编号C07K16/00GK102504025SQ20111035182
公开日2012年6月20日 申请日期2005年3月10日 优先权日2004年3月10日
发明者王兆一 申请人:克赖顿大学