本发明属生物药物领域，涉及续随子二萜烷型化合物的转化方法，具体涉及利用已知微生物对续随子二萜醇及其衍生物进行微生物转化，并进一步结合化学酰基化法，制备具有抗癌活性的续随子二萜烷型衍生物。
背景技术：
现有技术公开了续随子二萜烷型化合物属于二萜骨架的天然产物，具有较明显的抗肿瘤活性与抗肿瘤多药耐药性（mdr）。构效关系研究表明，其母核上取代基的差异能明显改变该类化合物的抗肿瘤活性和mdr活性。
有研究从大戟科植物续随子euphorbialathyrisl.中分离得到（tetrahedronletters,1971,18:1325-1328）续随子二萜烷型化合物；随后从其他植物中陆续分离得到多种续随子二萜烷型衍生物，如从大戟科植物euphorbialagascae中分离得到5个具有诱导肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤多药耐药性的续随子二萜醇酯衍生物（plantamedica,2005,72:162-168）；此外对从植物中分离得到的续随子二萜烷型衍生物的化学反应修饰，也得到一些抗肿瘤多药耐药性活性更好的衍生物（bioorganic&medicinalchemistry,2014,22:6392-6400）。为了发现活性更强的续随子二萜衍生物，特别是对其结构中低活性碳位点的结构修饰产物，将对进一步研究该类化合物的构效关系有着重要的意义；该类二萜骨架中c-18和c-19位为低活性位点，难以用化学方法接上羟基，而羟基是此类化合物进一步合成修饰的良好起始基团。
微生物转化是利用微生物生长过程中合成的特异酶完成特定生化反应。据报道，微生物在生长过程中可以合成多种酶，催化不同反应，例如氧化反应、还原反应、水解反应、脱氢反应、缩合反应和开环反应等，这类酶催化反应具有特异性和专属性，相对于化学反应，在底物的非活性碳原子上进行反应更高效环保。
迄今为止尚未见有关续随子二萜类化合物的微生物转化研究的报道。因此，本申请的发明人拟利用微生物对续随子二萜烷型化合物进行转化研究，以期获得一些难以用传统化学合成制备的特异位点（尤其是c-8、c-18和c-19低活性碳位点）的转化产物，并结合化学合成法，对微生物转化产物进一步进行化学修饰。
技术实现要素：
本发明的目的是提供续随子二萜烷型化合物非活性碳上进行结构改造的方法，尤其是制备具有生理活性、难以通过传统化学法羟基化得到的续随子二萜烷型类化合物的微生物转化方法。
本发明使用拉曼被孢霉mortierellaramanniana分别对续随子二萜醇(lathyrol)和7β-羟基续随子二萜醇（7β-hydroxylathyrol）进行了微生物转化或生物转化组合化学酰化，获得以下结构通式的续随子烷型二萜衍生物：
经鉴定，所获得的续随子烷型二萜衍生物化合物为：
化合物118-羟基续随子二萜醇：r1=r3=h,r2=oh
化合物27β,18-二羟基续随子二萜醇：r1=r2=oh,r3=h
化合物319-羟基续随子二萜醇：r1=r2=h,r3=oh
化合物418-烟酰氧基续随子二萜醇：r1=r3=h,r2=
本发明中所述的微生物转化法包括以下步骤：
（1）生产菌株为拉曼被孢霉mortierellaramanniana，该菌株在琼脂培养基上生长良好，将生长在琼脂培养基上的拉曼被孢霉菌丝划线接种于马铃薯固体培养基上，在20-28°c的恒温培养箱中培养3-7天，得到试管种；
其中，所述拉曼被孢霉mortierellaramanniana菌种微生物还包括其功能等同的变异体和突变体；
（2）将试管种中的菌丝接种到250ml的三角瓶中，每瓶含有50ml液体马铃薯培养基，培养温度为25-28°c，转速为130-180rpm，培养时间为24小时，获得种子液；
（3）将种子液按2%~5%体积比接入新鲜马铃薯培养基，28°c，130-180rpm条件下培养24-72小时后，加入转化底物续随子二萜醇或7β-羟基续随子二萜醇,在20-28°c、130-180rpm的条件下转化培养72-240小时。本发明的一个实施例中，优选将拉曼被孢霉mortierellaramanniana种子液按1%-3%体积比接入马铃薯培养基，28℃培养12-48小时，再加入4mg/ml续随子二萜醇或7β-羟基续随子二萜醇的乙醇溶液；
（4）将发酵液用布氏漏斗减压过滤，获得发酵滤液，按照1:1.5体积比用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压蒸干，发酵产物用硅胶柱层析法分离得到发酵产物18-羟基续随子二萜醇衍生物(1和2)和发酵产物19-羟基续随子二萜醇衍生物(3)；
其中，所述的液体培养基包括组分：200g马铃薯去皮，切成1立方厘米小丁，1l水微沸煎煮20分钟，随后用8层纱布趁热过滤，放凉后用水将滤液补齐至1l，加入20g葡萄糖，搅拌溶解；分装并经121°c高压灭菌20分钟后，放凉使用；
其中，所述的固体培养基包含组分：液体培养基加入1%琼脂，加热溶解并分装，121°c高压灭菌20分钟后，放凉使用。
本发明中，对续随子二萜醇经拉曼被孢霉mortierellaramanniana转化所得的转化产物18-羟基续随子二萜醇(1)进一步进行化学烟酰化，得到18-烟酰氧基续随子二萜醇(4)。
本发明中，所述的生物转化组合化学酰化法，包括以下步骤：
制备18-烟酰氧基续随子二萜醇(4)：将10-15mg的18-羟基续随子二萜醇(1)溶于无水四氢呋喃，滴加1-2滴三乙胺，1-2mgdmap，磁力搅拌混合均匀，在冰浴条件下投入1个当量的烟酰氯盐酸盐，逐渐升至室温，最后加热回流反应10-15小时，加入碳酸氢钠饱和溶液终止反应，用乙酸乙酯萃取5-7次，合并萃取液，加入适量的无水nahco3除水溶性成分后过滤，合并有机相。有机溶剂回收后用制备液相分离，流动相比例为60%甲醇-水，保留时间在35分钟为18-烟酰氧基续随子二萜醇(4)，保留时间在20分钟为18-羟基续随子二萜醇(1)。
本发明利用拉曼被孢霉mortierellaramanniana产生的羟化酶对续随子二萜醇型化合物进行生物转化，制备了羟基化续随子二萜烷衍生物，其中c-18羟基衍生物产率高达40%。其中，利用该菌产生的羟基化酶对续随子二萜醇的c-18和c-19位进行羟化反应，制备得到其羟基化产物1和3；利用该菌产生的羟基化酶对7β-羟基续随子二萜醇进行羟化反应，制备得到其羟基化产物2。本发明对制备得到的转化产物进一步进行单酰基化反应，得到c-18烟酰氧基取代产物(4)。本发明在该类二萜的c-18和c-19位引入羟基，增加了续随子二萜醇的化学结构修饰位点，增加水溶性，提高了成药性。更进一步，本发明制得的续随子烷型化合物可制备抗肿瘤多药耐药性的药物或药物组合物，其中含有所述的化合物或其药学上可接受的溶剂及药学上可接受的载体。
具体实施方式
实施例1制备18-羟基续随子二萜醇(1)和19-羟基续随子二萜醇(3)
采用两步活化法活化菌种，获得的种子液以1%体积比接种于装有250ml马铃薯培养基、体积为1l三角瓶中，28°c，180rpm条件下摇瓶培养48h，每瓶活化后的菌液加入5mg/ml续随子二萜醇的乙醇溶液，终浓度为0.1mg/ml。同条件培养72h后，抽滤发酵液，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，得到发酵液提取物；
发酵液提取物用少量乙酸乙酯溶解，以硅胶（100目-200目）拌样，上样于装有40~50g柱层析硅胶（200-300目）的硅胶柱内，用二氯甲烷-甲醇（20:1）洗脱，先后得到含底物续随子二萜醇、19-羟基续随子二萜醇(3)和18-羟基续随子二萜醇(1)的流分，回收溶剂，用丙酮溶解残渣，将样品溶液点于硅胶薄层板上，以二氯甲烷-甲醇（10:1）上行法展开，取出晾干溶剂后，喷以10%的硫酸-乙醇溶液，加热显色，样品点在硅胶薄层板中为砖红色-棕色斑点，其中转化主产物18-羟基续随子二萜醇(1)，rf值为0.4左右，产率40~45%；微量转化产物19-羟基续随子二萜醇(3)的rf值为0.5左右，产率2~5%；底物续随子二萜醇的rf值为0.6左右。化合物1和3的nmr结构鉴定数据如表1所示。
实施例2制备7β,18-二羟基续随子二萜醇(2)
采用两步活化法活化菌种，获得的种子液以1%体积比接种于装有250ml马铃薯培养基、体积为1l三角瓶中，28°c，180rpm条件下摇瓶培养48h，每瓶活化后的菌液加入5mg/ml的7β-羟基续随子二萜醇的乙醇溶液，终浓度为0.1mg/ml，同条件培养72h后，发酵液抽滤，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，得到发酵液提取物；
发酵液提取物用少量乙酸乙酯溶解，以硅胶（100-200目）拌样，上样装有40~50g柱层析硅胶（200-300目）的硅胶柱内，用二氯甲烷-甲醇（20:1）洗脱，得到含7β,18-二羟基续随子二萜醇(2)的流分，回收溶剂，用丙酮溶解残渣，将样品溶液点于硅胶薄层板上，以二氯甲烷-甲醇（10:1）上行法展开，取出晾干溶剂后，喷以10%的硫酸-乙醇溶液，加热显色，7β,18-二羟基续随子二萜醇(2)在硅胶薄层板中显示一个砖红色-棕色斑点，rf值为0.35左右；底物7β-羟基续随子二萜醇rf值为0.6左右。化合物2的nmr结构鉴定数据如表1所示。
表1是转化产物18-羟基续随子二萜醇(1)、7β,18-二羟基续随子二萜醇(2)和19-羟基续随子二萜醇(3)的nmr数据(400mhz,cd3od)。
表1
实施例3制备18-烟酰氧基续随子二萜醇（4）
取10mg干燥无水的18-羟基大戟因子l3(1)于50ml圆底烧瓶内，加入10-15ml无水四氢呋喃，加入8ml三乙胺、微量4-二甲氨基吡啶（dmap），用磁力搅拌器搅拌溶解混合，冰浴条件下加入1个当量的烟酰氯盐酸盐，共同搅拌反应至室温8小时，若反应未完成再回流加热反应1~3小时；
检测反应是否完成：用毛细管吸取少量反应液，点样于硅胶薄层板，平行点样18-羟基续随子二萜醇，采用二氯甲烷-甲醇（20:1）上行法展开，完毕后取出晾干，254nm紫外灯下检视，反应完成的标志是在反应液展开处，与18-羟基续随子二萜醇相同位置（rf=0.3）没有亮斑或仅有微弱亮斑，在rf=0.6左右处产生新的亮斑；
确定反应完成后，加入20ml饱和碳酸氢钠淬灭，反应液用等体积乙酸乙酯萃取6~10次，合并乙酸乙酯层，回收溶剂得到残渣。残渣用少量甲醇溶解，经制备液相（流动相为60%甲醇:水），分离得到18-烟酰氧基续随子二萜醇（4），其保留时间为35分钟。
实施例418-烟酰氧基续随子二萜醇（4）的抗肿瘤多药耐药活性测试
采用人乳腺癌细胞（mcf-7）及耐阿霉素人乳腺癌细胞（mcf-7/adm）外排罗丹明-123能力变化评价待测化合物的体外抗肿瘤多药耐药性（mdr）活性。mcf-7及mcf-7/adm细胞培养基为含有10%小牛血清的rpmi-1640培养基，在37℃、5%co2细胞培养箱培养至细胞密度为70~80%铺满。mcf-7及mcf-7/adm细胞经10%胰蛋白酶消化后，吹散制成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为105/ml，将细胞悬浮液加入1.5ml离心管，每管体积为500ml，再加入含不同药物浓度的培养基500ml，每个浓度设置3个复孔，于37℃、5%co2孵育10min。实验组含药培养基药物浓度分别为80μm、40μm、8μm(终浓度为40、20、和4μm)，阴性对照组加入含有dmso溶液的培养基。孵育10min后，实验组与阴性对照组加入100μl罗丹明-123的pbs溶液（终浓度2.2μm），再置于37℃，含5%co2的细胞孵育箱内孵育20min；空白组加入等体积不含罗丹明-123的空白pbs溶液。孵育结束后，离心弃培养基，并用pbs清洗细胞2次。用200μmpbs缓冲液吹散细胞沉淀，mcf-7及mcf-7/adm细胞悬浮液样品经流式细胞仪测得10000个细胞荧光值的均值greenb，逆转程度far=（greenbmcf-7/adm实验组/greenbmcf-7/adm阴性对照组）/（greenbmcf-7实验组/greenbmcf-7阴性对照组）；
结果显示，18-烟酰氧基续随子二萜醇（4）与18-羟基续随子二萜醇在40mm的far(40μm)分别为2.4和1.0，提高2.4倍，表明c-18烟酰氧基化，能提高续随子二萜醇的抗肿瘤多药耐药活性。