抑制HIF‑1α的抗肿瘤候选药物及制备方法与流程

本发明属于恶性肿瘤技术领域，尤其涉及一种抑制hif-1α的抗肿瘤候选药物及制备方法。

背景技术：

肿瘤是一种常见且发生频繁的疾病，其中恶性肿瘤目前对人类健康具有最严重的危害。血管为肿瘤生长和存活提供足够了的氧气和营养物质，并消除代谢废物。因此，肿瘤血管靶向治疗成为有效的肿瘤治疗策略。肿瘤血管抑制剂的研究进展上世纪70年代初，folkman首次提出，肿瘤新生血管对肿瘤的生长及扩散起重要作用。bergers等进一步的研究也表明:肿瘤细胞在增殖和转移过程中需新生血管及功能性血管的支持；而且，近年来的大量研究已证实:肿瘤的生长与生存均需由血管提供充足的氧气和养分，并排除代谢废物，若无血管及新生血管的支持，肿瘤的生长不会超过2mm，因此，肿瘤血管靶向疗法应运而生，成为一种有效的肿瘤治疗策略。与选择性差、毒性大且易产生耐药性的传统抗肿瘤药物不同，肿瘤血管靶向疗法具有选择性强、毒性小、抗瘤谱广等诸多优势，能直接作用于肿瘤血管内皮细胞，抑制依赖于血管系统的各类肿瘤生长。此外，靶向血管治疗对机体的正常生理功能影响很小，且相对于正常组织血管而言，肿瘤血管结构不完整，内皮细胞处于增殖状态，更易遭受血管靶向药物的攻击。

在临床用药中，单独使用血管阻断剂的效果不好，肿瘤在血管阻断后仍可以存活，认为原因可能是warburg效应。warburg效应是观察到大多数癌细胞在有氧或无氧的情况下主要通过高速率的糖酵解产生能量，而在大多数正常细胞产生能量主要通过在线粒体中进行有氧呼吸。恶性快速生长的肿瘤细胞通常具有高达其正常来源组织的糖酵解速率的200倍的糖酵解速率，即使氧气充足也会发生这种情况。

肿瘤细胞的能量主要来自糖酵解。缺氧是实体肿瘤的一个普遍特征，对于肿瘤的进展起着关键作用。ottowarburg学者发现许多肿瘤细胞即使是在常氧的情况下也产生过多的乳酸，称之为假缺氧。肿瘤的快速增殖需要持续的氧与营养的供应。当组织生长的速度远远超过周围血管供应这些营养成分的能力时，缺氧便应运而生。缺氧与肿瘤的血管新生、侵袭转移、放化疗抵抗和预后不良等密切相关。糖酵解途径产生的丙酮酸可直接进入三羧酸循环途径或者由乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，ldh)转化为乳酸。在葡萄糖经糖酵解途径生成乳酸的过程中，hk、pfk、pk和ldh等关键代谢酶与肿瘤有关，且受到致癌因子信号转导通路中转录因子如乏氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，hif-1α)等的调控。(1)低氧诱导因子抑制剂低氧诱导因子1(hypoxia-induciblefactor1，hif-1)是缺氧效应调控中最为关键的核转录调控因子。.hif-1在实体肿瘤组织内选择性持续高表达，下游关键调控基因与肿瘤的发生发展密切相关，如促进血管生成、细胞存活、抑制肿瘤细胞凋亡、代谢重塑以及ph稳态的调节。缺氧时糖酵解是肿瘤细胞获得能量的一个重要手段。hif-1α通过与靶基因上的dna结合位点结合，诱导糖酵解酶类基因的表达，增加糖酵解，促进无氧代谢，故有利于肿瘤细胞在缺氧下的生存。影响hif-1α的合成及降解的药物黄酮类化合物白杨素通过增加其脯氨酰羟化增加的泛素化和降解hif-1α。此外，白杨素之间的相互干扰hif-1α和热休克蛋白90。白杨素也被发现通过akt信号途径抑制hif-1α的表达。白杨素可通过抑制hif-1α抑制血管内皮生长因子的表达水平。mirzoeva等发现，在人前列腺癌细胞系pc3-m中，芹菜素下调hif-1α的mrna和蛋白表达水平，并降低其蛋白质结构的稳定性，进而阻止hif-1下游靶基因vegf的激活，下调vegf的mrna和蛋白表达水平，抑制前列腺癌新生血管的形成。liu等也发现，金合欢素(acacetin)虽然对hif-1αmrna的表达水平没有明显影响，但通过下调其蛋白表达水平而抑制vegf的激活，从而阻止卵巢癌新生血管形成，并且这种对vegf的抑制作用可以通过过表达hif-1α而消除。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种抑制hif-1α抗肿瘤候选药物其制备方法，旨在解决在临床用药中，单独使用血管阻断剂的效果不好，肿瘤血管阻断后仍可以存活的问题。

本发明是这样实现的，一种抑制hif-1α抗肿瘤候选药物，所述抑制hif-1α抗肿瘤候选药物具有如下通式：

本发明的另一目的在于提供一种所述抑制hif-1α抗肿瘤候选药物的制备方法，所述抑制hif-1α抗肿瘤候选药物的制备方法包括以下步骤：

步骤一，在250ml圆底烧瓶中依次加入白杨素，无水碳酸钾及丙酮，加热搅拌回流，再逐滴加入1，2-二溴乙烷或1，3-二溴丙烷或1，4-二溴丁烷，60℃加热冷凝回流，溶液变澄清再变浑浊；检测反应进程，柱色谱纯化，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50；

步骤二，在250ml三口烧瓶中加入苯并咪唑衍生物，使其溶于100ml丙酮，加入碳酸钾，搅拌10min后，加入步骤一所得纯化的白杨素衍生物，四丁基溴化铵，加热至60℃搅拌反应，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，然后用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干后用硅胶柱分离即得到目标化合物，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

进一步，所述步骤一中：在250ml圆底烧瓶中依次加入白杨素2.54g，0.01(已改)mol，无水碳酸钾5.52g，0.04mol及丙酮100ml；1，2-二溴乙烷或1，3-二溴丙烷或1，4-二溴丁烷0.04mol。

进一步，所述步骤二中：在250ml圆底烧瓶中依次加入苯并咪唑衍生物0.015mol，无水碳酸钾5.52g，0.04mol，步骤一所得纯化的白杨素衍生物0.01mol，四丁基溴化铵0.03g，0.0001mol及丙酮100ml。

本发明提供的抑制hif-1α抗肿瘤候选药物及其制备方法，拟设计合成化合物能抑制肿瘤细胞的糖酵解能力，糖酵解抑制以低氧诱导因子1α为靶点，设计合成以黄酮天然化合物为母核，修饰苯并咪唑衍生物合成系列白杨素衍生物，采用体外抗肿瘤活性、靶点蛋白的抑制水平进行筛选，筛选出作用于抑制低氧诱导因子1α的化合物。挑选出作用于抑制糖酵解的候选药物，为治疗肿瘤提供潜在的新的候选药物。从降低肿瘤细胞糖酵解方面，最重要的为hif-1α，hif-1α抑制剂的种类很多，发现抑制hif-1α合成的抑制剂中发现黄酮类化合物和苯并咪唑类化合物，且最早发现的血管阻断剂为醋酸黄酮，所以拟以黄酮为母核结构，另一侧引入苯并咪唑或苯并咪唑衍生物，合成期望能通过抑制hif-1α而抑制糖酵解。

附图说明

图1是本发明实施例提供的抑制hif-1α抗肿瘤候选药物的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的实验结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的抑制hif-1α抗肿瘤候选药物具有如下通式：

如图1所示，本发明实施例提供的抑制hif-1α抗肿瘤候选药物的制备方法包括以下步骤：

s101：在250ml圆底烧瓶中依次加入白杨素(2.54g，0.01mol)，无水碳酸钾(5.52g，0.04mol)及丙酮(100ml)，加热搅拌回流，再逐滴加入1，2-二溴乙烷或1，3-二溴丙烷或1，4-二溴丁烷(0.04mol)，60℃加热冷凝回流，溶液变澄清再变浑浊。tcl(薄层色谱法)检测反应进程，柱色谱纯化，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

s102：在250ml三口烧瓶中加入苯并咪唑衍生物(0.015mol)，使其溶于100ml丙酮，加入碳酸钾(5.52g，0.04mol)，搅拌10min后，加入步骤一所得纯化的白杨素衍生物(0.01mol)，四丁基溴化铵(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加热至60℃搅拌反应，(tcl检测反应进程)，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，然后用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干后用硅胶柱分离即得到目标化合物，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

本发明实施例提供的抑制hif-1α抗肿瘤候选药物的制备方法反应方程式如下：

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例1：7-(2-溴乙氧基)-5-羟基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮

在250ml圆底烧瓶中依次加入白杨素(2.54g，0.01mol)，无水碳酸钾(5.52g，0.004mol)及丙酮(100ml)，加热搅拌回流，再逐滴加入1，2-二溴乙烷(0.04mol)，60℃加热冷凝回流，溶液变澄清再变浑浊。tcl(薄层色谱法)检测反应进程，柱色谱纯化，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

实施例2：7-(3-溴丙氧基)-5-羟基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮

在250ml圆底烧瓶中依次加入白杨素(2.54g，0.01mol)，无水碳酸钾(5.52g，0.004mol)及丙酮(100ml)，加热搅拌回流，再逐滴加入1，3-二溴丙烷(0.04mol)，60℃加热冷凝回流，溶液变澄清再变浑浊。tcl(薄层色谱法)检测反应进程，柱色谱纯化，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

实施例3：7-(4-溴丁氧基)-5-羟基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮

在250ml圆底烧瓶中依次加入白杨素(2.54g，0.01mol)，无水碳酸钾(5.52g，0.004mol)及丙酮(100ml)，加热搅拌回流，再逐滴加入1，4-二溴丁烷(0.04mol)，60℃加热冷凝回流，溶液变澄清再变浑浊。tcl(薄层色谱法)检测反应进程，柱色谱纯化，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。

实施例4：5-羟基-7-(2-(2-氯-1h-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口烧瓶中加入2-氯苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸钾(0.552g，0.004mol)，搅拌10min后，加入实施例1得到的淡黄色固体7-(2-溴乙氧基)-5-羟基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.36g，0.001mol)，四丁基溴化铵(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加热至60℃搅拌反应，(tcl检测反应进程)，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，然后用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干后用硅胶柱分离即得到目标化合物，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黄色粉末，产率为56％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.71(s，1h)，7.84(dd，j＝8.1，1.6hz，2h)，7.69(d，j＝7.6hz，1h)，7.55–7.47(m，3h)，7.44(d，j＝7.3hz，1h)，7.37–7.26(m，2h)，6.64(s，1h)，6.39(d，j＝2.2hz，1h)，6.28(d，j＝2.3hz，1h)，4.64(t，j＝5.3hz，2h)，4.37(t，j＝5.4hz，2h)。

实施例5:5-羟基-7-(2-(5-硝基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)乙氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口烧瓶中加入6-硝基苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸钾(0.0552g，0.004mol)，搅拌10min后，加入实施例1得到的淡黄色固体7-(2-溴乙氧基)-5-羟基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.36g，0.001mol)，四丁基溴化铵(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加热至60℃搅拌反应，(tcl检测反应进程)，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，然后用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干后用硅胶柱分离即得到目标化合物，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黄色粉末，产率为52％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.75(d，j＝3.9hz，1h)，8.74(s，1h)，8.52(s，1h)，8.33–8.18(m，2h)，7.86(dd，j＝13.7，8.3hz，2h)，7.58(d，j＝9.0hz，1h)，7.52(t，j＝8.1hz，2h)，6.65(s，1h)，6.43(dd，j＝17.4，2.2hz，1h)，6.30(s，1h)，4.74–4.64(m，2h)，4.41(dd，j＝10.4，5.3hz，2h)。

实施例6:5-羟基-7-(2-(5-硝基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口烧瓶中加入6-硝基苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸钾(0.552g，0.004mol)，搅拌10min后，加入实施例2得到的淡黄色固体7-(3-溴丙氧基)-5-羟基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.37g，0.001mol)，四丁基溴化铵(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加热至60℃搅拌反应，(tcl检测反应进程)，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，然后用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干后用硅胶柱分离即得到目标化合物，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黄色粉末，产率为47％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.75(d，j＝3.8hz，1h)，8.73(d，j＝2.1hz，1h)，8.41(d，j＝2.1hz，1h)，8.22(dd，j＝13.0，5.8hz，1h)，8.10(d，j＝18.5hz，1h)，7.89–7.83(m，2h)，7.52(dd，j＝15.8，8.4hz，2h)，6.67(d，j＝1.6hz，1h)，6.47(d，j＝2.2hz，1h)，6.41(d，j＝2.2hz，1h)，6.36–6.32(m，1h)，4.57–4.48(m，2h)，4.00(dd，j＝11.8，6.0hz，2h)，2.42(dd，j＝11.1，5.3hz，2h)。

实施例7:5-羟基-7-(2-(2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)丙氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口烧瓶中加入2-甲基苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸钾(0.552g，0.004mol)，搅拌10min后，加入实施例2得到的淡黄色固体7-(3-溴丙氧基)-5-羟基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.37g，0.001mol)，四丁基溴化铵(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加热至60℃搅拌反应，(tcl检测反应进程)，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，然后用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干后用硅胶柱分离即得到目标化合物，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黄色粉末，产率为49％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.73(s，1h)，7.94–7.81(m，2h)，7.68(d，j＝6.7hz，1h)，7.57–7.45(m，3h)，7.32–7.27(m，1h)，7.22–7.18(m，2h)，6.67(s，1h)，6.43(d，j＝2.2hz，1h)，6.36(d，j＝2.2hz，1h)，4.37(t，j＝6.6hz，2h)，3.96(t，j＝5.5hz，2h)，2.58(s，3h)，2.38–2.28(m，2h)。

实施例8：5-羟基-7-(2-(1h-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口烧瓶中加入苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸钾(0.552g，0.004mol)，搅拌10min后，加入实施例3得到的淡黄色固体7-(4-溴丁氧基)-5-羟基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.39g，0.001mol)，四丁基溴化铵(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加热至60℃搅拌反应，(tcl检测反应进程)，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，然后用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干后用硅胶柱分离即得到目标化合物，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黄色粉末，产率为51％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.71(s，1h)，7.92(s，1h)，7.89–7.83(m，2h)，7.81(d，j＝7.2hz，1h)，7.55–7.47(m，3h)，7.41(d，j＝7.1hz，1h)，7.34–7.25(m，3h)，6.65(s，1h)，6.44(d，j＝2.2hz，1h)，6.33(d，j＝2.2hz，1h)，4.28(t，j＝7.0hz，2h)，4.03(t，j＝6.0hz，2h)，2.11(dt，j＝14.7，7.4hz，2h)，1.85(dd，j＝15.2，5.8hz，2h)。

实施例9：5-羟基-7-(2-(2-甲基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)丁氧基)-2-苯基-4h-色烯-4-酮

在100ml三口烧瓶中加入2-甲基苯并咪唑(0.0015mol)，使其溶于30ml丙酮，加入碳酸钾(0.552g，0.004mol)，搅拌10min后，加入实施例3得到的淡黄色固体7-(4-溴丁氧基)-5-羟基-2-苯基-4h-苯并吡喃酮-4-酮(0.39g，0.001mol)，四丁基溴化铵(tbab)(0.03g，0.0001mol)，加热至60℃搅拌反应，(tcl检测反应进程)，用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和食盐水洗，然后用无水硫酸钠干燥，溶剂减压蒸干后用硅胶柱分离即得到目标化合物，洗脱剂为：甲醇：二氯甲烷＝1:50。淡黄色粉末，产率为48％。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.72(s，1h)，7.89–7.84(m，2h)，7.72–7.65(m，1h)，7.52(t，j＝7.2hz，3h)，7.33–7.27(m，1h)，7.24–7.18(m，2h)，6.65(s，1h)，6.44(d，j＝2.2hz，1h)，6.33(d，j＝2.1hz，1h)，4.21(t，j＝7.1hz，2h)，4.03(t，j＝6.0hz，2h)，2.63(s，3h)，2.02(dd，j＝15.0，7.7hz，2h)，1.88(dd，j＝14.8，5.7hz，2h)。

实施例10：本发明化合物的体外抗肿瘤活性试验

对本发明的化合物进行抗肿瘤细胞增殖活性试验，试验方法采用常规的mtt法。

细胞株选用人胃癌细胞mgc-803、人肝癌细胞hepg2和人乳腺癌细胞mcf-7。培养液为dmem+15％nbs+双抗。

药物溶液的配制方法：用dmso(merck)溶解后，加入pbs(-)配成1mmol/ml的溶液或均匀的混悬液，然后用dmso的pbs(-)稀释，最终浓度分别为384μmol/l、192μmol/l、96μmol/l、48μmol/l、24μmol/l、12μmol/l、6μmol/l、3μmol/l。

将上市的抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶和白杨素以同样的条件配成对照品溶液。

试验步骤

96孔板每孔加入浓度为3×10⁴个/ml的细胞悬液100μl，即3000个细胞/孔，置37℃、5％co2培养箱内。24小时后，分别加入样品液和对照品液，10μl/孔，37℃作用72小时。每孔加入5mg/ml的mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑翁溴化物)溶液20μl，作用4小时后加入溶解液dmso，100μl/孔，置培养箱内，次日用mk-2全自动酶标仪测570nmod值。计算半数抑制浓度ic50。

试验结果详见表1，其中，样品是指新合成的白杨素苯并咪唑衍生物1-21，实施例1-9只是其中一部分化合物的具体合成方法与结果。

表1化合物对肿瘤细胞的半数抑制浓度ic50(单位：μmol/l)

anti-proliferativeactivityofcompoundsagainstthecancercelllines

sd＝standarddeviation,

n.d＝notdetected

以上实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性，白杨素苯并咪唑衍生物对人胃癌细胞mgc-803、人肝癌细胞hepg2、人乳腺癌细胞mcf-7有均显示出一定程度的抑制活性，其中化合物16对人胃癌细胞mgc-803、人肝癌细胞hepg2、人乳腺癌细胞mcf-7效果均比较显著，故将以16号化合物做进一步的体内抗肿瘤活性试验。因新合成化合物对人胃癌细胞mgc-803的效果较其他好，故体内抗肿瘤活性试验中选用鼠源性胃癌细胞mfc建正常小鼠肿瘤模型。实施例11：本发明16号化合物的体内抗肿瘤活性试验

实验动物准备：实验动物38只健康雄性小鼠3～4周龄随机分为5组：给药组(高中低三种剂量各7只)、阳性对照组(五氟尿嘧啶)7只、阴性对照组10只，饲以高压灭菌水和饲料，饲养室相对湿度55％±10％，温度(22±2)℃，光照12h，明暗交替。

细胞培养过程中所需dmem培养基、胎牛血清等均购自美国gibco公司。显微外科实验手术器械购自上海市医疗器械总公司，高压灭菌后使用。

将冻存的鼠源性胃癌细胞mfc细胞复苏后，于含10％胎牛血清的dmem培养基中，在37℃、5％co2培养箱中培养、传代，培养至对数生长期，胰酶消化后用生理盐水重悬成1×10⁷/ml细胞悬液，在小鼠左侧腹侧中部皮下注射细胞悬液，形成一皮丘，内含0.2ml细胞悬液(2×10⁶个)，共接种38只，在肿瘤体积达到约125mm³(定义为第0天)时开始实验。

观察与取材：所有小鼠模型均自由食水，每两天观察小鼠体质量、精神状态、摄食、活动与营养情况。造模后每两天观察小鼠皮下成瘤情况，测量皮下瘤长径(a)和宽径(b)，计算体积(v＝a×b²)，以肿瘤体积和生长时间作为坐标，绘制生长曲线。同时记录成瘤时间，肿瘤形状，肿瘤表面皮肤情况。2周后，处死所有小鼠并切取肿瘤，观察肿瘤大小。

实验结果见图2，实验结果16化合物对小鼠肿瘤的生长有较好的抑制作用，并呈浓度依赖性，可进一步对化合物的作用机制进行研究与探讨。

图2为以肿瘤体积和生长时间为坐标，绘制的生长曲线。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。