抗PD‑1和TEM‑8双特异性抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及在研究和治疗应用中使用的对pd-1和tem-8同时具有高亲和力的双特异性抗体、或其变体、或功能性片段，并进一步涉及编码所涉及的抗体、或其变体、或功能性片段的核酸分子，用于表达所述抗体、或其变体、或功能性片段的表达载体和宿主细胞，以及所述抗体、或其变体、或功能性片段的制备方法。本发明还提供了使用本发明的双特异性抗体、或其变体、或功能性片段的方法，包含其的治疗性组合物，以及其用于增强免疫细胞的功能、上调细胞介导的免疫应答和用于治疗免疫细胞功能失调性病症，例如肿瘤免疫，以及用于治疗癌症的用途。
背景技术：
：双特异性抗体是指含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，其能够在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种。双特异性抗体现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。目前，这种抗体的制备主要有三种方法：化学偶联法、杂交-杂交瘤法和基因工程抗体制备法，其中基因工程抗体制备法最常用，也最先进。一般来说，双特异性结合蛋白分子可以分成两大类：一类是含有fc区，另一类是缺乏fc区，后者通常为小于免疫球蛋白且含有fc区的igg双特异性分子。fc区有利于采用已建立的针对igg分子的流程来对双特异性抗体进行纯化，并且能改善其溶解性和稳定性。此外，fc区还对fc-介导的效应功能有影响，这可能是一些治疗应用所需的附加效应，例如抗体依赖的细胞毒性(adcc)、补体结合(cdc)和由于其具有更大的分子量和fc新生儿受体(fcrn)介导的循环过程而导致的长半衰期。这些功能可以通过基因工程的手段进一步被利用，例如，通过消除adcc和/或cdc同时保留长半衰期。相比之下，缺乏fc区的双特异性结合蛋白分子完全依赖其抗原结合能力来发挥治疗效力。程序性细胞死亡因子1(programmeddeath1，pd-1)是一种主要在活化免疫细胞上表达的抑制性受体。在肿瘤患者中，通过pd-1的高表达介导t细胞免疫负性调控信号，参与肿瘤免疫反应的负调节(liuj，etal.,plasmacellsfrommultiplemyelomapatientsexpressb7-h1(pd-l1)andincreaseexpressionafterstimulationwithifn-γandtlrligandsviaamyd88-，traf6-，andmek-dependentpathway[j].blood，2007，110(1)：296-304)。程序性细胞死亡因子配体1(programmeddeath1-ligand，pd-l1)和程序性细胞死亡因子配体2(programmeddeath2-ligand，pd-l2)是pd-1结合配体(keirme，etal.,pd-1anditsligandsintoleranceandimmunity[j].annurevimmunol，2008，26：677-704)。pd-l1与pd-1胞外区结合后，通过pd-1胞质区尾部的免疫受体酪氨酸抑制模体，下调cd3(cd28)诱导的磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶b的活性，抑制t细胞增殖相关基因的转录并促进t细胞凋亡；同时还招募蛋白酪氨酸磷酸酶1，使与其结合的信号分子去磷酸化，从而抑制t细胞的增殖活化和功能(jinht，etal.,roleofpd-1inregulatingtcellimmunity[j].currtopmicrobiolimmunol，2011，350(1)：17-37)。t细胞是免疫系统的主要组成部分(ahmadzadehm，etal.,tumorantigen-specificcd8tcellsinfiltratingthetumorexpresshighlevelsofpd-1andarefunctionallyimpaired[j].blood，2009，114(8)：1537-1544)。pd-1在肿瘤侵润淋巴细胞、肿瘤特异性t细胞及一些损伤相关的t细胞中高表达(quezadasa，etal.,exploitingctla-4，pd-1andpd-l1toreactivatethehostimmuneresponseagainstcancer[j].brjcancer，2013，108(8)：1560-1565)，其配体pd-l1在多种肿瘤细胞(如各类非淋巴系肿瘤，如黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌等)中均有表达，表明pd-1/pd-l信号通路可能参与肿瘤免疫逃逸(simeonee，etal.,immunomodulatingantibodiesinthetreatmentofmetastaticmelanoma：theexperiencewithanti-ctla-4，anti-cd137andanti-pd1[j].jimmunotoxicol，2012，9(3)：241-247)。因此，阻断pd-1/pd-l可通过在肿瘤环境中抑制免疫反应而有效地进行抗癌治疗。近两年来，美国临床肿瘤年会最令人兴奋的临床试验大概就是pd-1抗癌抗体带来的黑色旋风。pd-1抗体带来的临床抗癌效果是前所未有的。它可以控制50％的皮肤癌病人的癌症进展，治愈10％左右的皮肤癌病人。对于顽固的非小细胞肺癌病人，多年来医学上束手无策，但pd-1抗体对24％的病人有临床控制效果。由于其广谱抗癌作用，对肾癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、血癌、头颈癌、肠癌和脑瘤等癌症的临床疗效也正在临床二期或三期试验之中。肿瘤内皮标志物(tumorendotheliamarker，tem1-9)是通过对肿瘤组织血管内皮细胞和临近正常组织血管内皮细胞的基因表达进行基因串连比对分析(serialanalysisgeneexpress，sage)发现的9个在肿瘤内皮细胞特异性表达的基因或蛋白(stcroixb，eta1.,genesexpressedinhumantumorendothelium[j].science(washdc),2000,289(5482):1197-1202)。tem-8是tem家族的一种，与其它tem和vegfr相比，tem-8在肿瘤血管内皮表达更为特异，在肿瘤血管中存在，而正常组织中极少或不存在。更为重要的是，tem-8随后被鉴定为炭疽毒素的一种受体。tem-8本身具有重要的生物学功能，高表达的tem-8能促进细胞的粘附和迁移，但这些作用可以被重组的胞外区蛋白所阻断(hotchkisska,etal.,tem-8expressionstimulatesendothelialcelladhesionandmigrationbyregulatingcell-matrixinteractionsoncollagen.expcellres,2005,305(2):133-144)；同时，肿瘤浸润和血管生长必须的细胞因子之一—il-1β能明显诱导tem-8的表达(rmalika,etal.,upregulationoftumorendothelialmarker-8byinterleukin-1βanditsimpactinil-1βinducedangiogenesis.intjmolmed,2004,14(1):75-80)。此外，针对tem-8的抗肿瘤抗体样蛋白，即人tem-8胞外区与人iggfc片段的融合蛋白tem-8fc具有显著地抑制肿瘤生长活性和抗肿瘤效果，说明tem-8是一个潜在的抗肿瘤靶点(duanhf，etal.,antitumoractivitiesoftem8-fc:anengineeredantibody-likemoleculetargetingtumorendothelialmarker8.jnatlcancerinst,2007,99(2):1551-1555)。虽然pd-1抗体药物由于其靶向免疫检查点而对多种肿瘤具有强大的广谱抗癌活性，但同时也存在多种潜在的副作用，而且单一的靶向性抗体疗法虽然最初存在一定的疗效，在随后的治疗中通常会产生由其它信号传导级联的上调所致的治疗抗性，因此有必要进一步提高pd-1抗体药物抗肿瘤的靶向性，降低治疗副作用的风险，同时提高有效性。而随着计算机科学的迅猛发展，近年来计算机辅助药物设计成为研究与开发新药的崭新技术，明显加快了新药设计的速度和效率。基于蛋白质空间结构的蛋白质药物研究倍受重视，蛋白质结构的不断解析，pdb数据不断增长，使计算机辅助设计蛋白质药物成为可能。技术实现要素：针对现有技术中pd-1抗体药物存在的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种具有显著提高的抗癌活性的新型pd-1抗体药物。经过大量的筛选试验和优化研究，本发明人出人意料地发现了一种具有显著提高的抗肿瘤靶向性，降低的治疗副作用风险，同时具有显著提高的有效性的抗pd-1和tem-8的双特异性抗体。最重要的是，实验结果表明，与其它肿瘤内皮标志物的抗体相比，将抗pd-1抗体与抗tem-8抗体进行组合所形成的双特异性抗体产生了明显的协同效果，即其疗效相比两种单一抗体的疗效具有统计学意义上的显著提高，这是本发明之前的现有技术所无法预料的。本发明用于解决上述技术问题的技术方案如下：一种抗pd-1和tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，其包括：a.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域，其包括抗pd-1特异性抗体的重链可变区(抗pd-1vh)；以及b.特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域，其包括抗tem-8特异性抗体的重链可变区(抗tem-8vh)。优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域由依次连接的抗pd-1特异性抗体的轻链可变区(抗pd-1vl)、重链可变区(抗pd-1vh)、铰链区和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)组成，或由一组抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)和重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成，或由两组抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)和重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成，或由抗pd-1特异性抗体的轻链可变区(抗pd-1vl)和重链可变区(抗pd-1vh)组成。优选地，所述特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域由依次连接的抗tem-8特异性抗体的轻链可变区(抗tem-8vl)、重链可变区(抗tem-8vh)、铰链区和fc片段(抗tem-8ch2-ch3)组成，或由一组抗tem-8特异性抗体的轻链(抗tem-8vl-cl)和重链(抗tem-8vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成，或由两组抗tem-8特异性抗体的轻链(抗tem-8vl-cl)和重链(抗tem-8vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成，或由抗tem-8特异性抗体的轻链可变区(抗tem-8vl)和重链可变区(抗tem-8vh)组成。根据本发明的一个优选的实施方案，所述抗pd-1和tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段包括：a’.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域，其由一组抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)和重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成；以及b’.特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域，其由一组抗tem-8特异性抗体的轻链(抗tem-8vl-cl)和重链(抗tem-8vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成。优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域与所述特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域通过一个或多个二硫键，例如一个或多个位于铰链区的二硫键连接。根据本发明的一个优选的实施方案，所述抗pd-1和tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段包括：a”.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域，其由一组抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)和重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成；以及b”.特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域，其由依次连接的抗tem-8特异性抗体的轻链可变区(抗tem-8vl)、重链可变区(抗tem-8vh)、铰链区和fc片段(抗tem-8ch2-ch3)组成。优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域与所述特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域通过一个或多个二硫键，例如一个或多个位于铰链区的二硫键连接。根据本发明的一个优选的实施方案，所述抗pd-1和tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段包括：a”’.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域，其由依次连接的抗pd-1特异性抗体的轻链可变区(抗pd-1vl)、重链可变区(抗pd-1vh)、铰链区和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)组成；以及b”’.特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域，其由一组抗tem-8特异性抗体的轻链(抗tem-8vl-cl)和重链(抗tem-8vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成。优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域与所述特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域通过一个或多个二硫键，例如一个或多个位于铰链区的二硫键连接。根据本发明的一个优选的实施方案，所述抗pd-1和tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段包括：a””.特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域，其由两组抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)和重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)组成；以及b””.特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域，其由两组抗tem-8特异性抗体的轻链可变区(抗tem-8vl)和重链可变区(抗tem-8vh)组成。优选地，所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域中的每个抗pd-1特异性抗体的重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)的ch3分别与所述特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域中的每个抗tem-8特异性抗体的重链可变区(抗tem-8vh)通过化学键连接。优选地，所述的抗pd-1和/或所述tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。优选地，所述特异性识别和结合pd-1的结构域中的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:1、5、9或25所示；轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:3、7、11或27所示。优选地，所述特异性识别和结合tem-8的结构域中的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:13、17、21或29所示；轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:15、19、23或31所示。优选地，所述抗pd-1特异性抗体的重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)的氨基酸序列为seqidno:33，核苷酸序列为seqidno:34；所述抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)的氨基酸序列为seqidno:35，核苷酸序列为seqidno:36；所述由依次连接的抗pd-1特异性抗体的轻链可变区(抗pd-1vl)、重链可变区(抗pd-1vh)、铰链区和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)组成的所述特异性识别和结合免疫细胞表面抗原pd-1的结构域的氨基酸序列为seqidno:37，核苷酸序列为seqidno:38。优选地，所述抗tem-8特异性抗体的重链(抗tem-8vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)的氨基酸序列为seqidno:39，核苷酸序列为seqidno:40；所述抗tem-8特异性抗体的轻链(抗tem-8vl-cl)的氨基酸序列为seqidno:41，核苷酸序列为seqidno:42；所述由依次连接的抗tem-8特异性抗体的轻链可变区(抗tem-8vl)、重链可变区(抗tem-8vh)、铰链区和fc片段(抗tem-8ch2-ch3)组成的所述特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域的氨基酸序列为seqidno:43，核苷酸序列为seqidno:44；所述由抗tem-8特异性抗体的轻链可变区(抗tem-8vl)和重链可变区(抗tem-8vh)组成的所述特异性识别和结合肿瘤内皮标志物tem-8的结构域的氨基酸序列为seqidno:45，核苷酸序列为seqidno:46。另一方面，本发明还提供了一种编码所述抗pd-1和tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段的核酸分子，或者一种包含所述核酸分子的表达载体，或者一种包含所述表达载体的宿主细胞。优选地，所述特异性识别和结合pd-1的结构域中的重链可变区的核苷酸序列如seqidno:2、6、10或26所示；轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:4、8、12或28所示。优选地，所述特异性识别和结合tem-8的结构域中的重链可变区的核苷酸序列如seqidno:14、18、22或30所示；轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:16、20、24或32所示。再一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包括所述抗pd-1和tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，或者所述核酸分子，或者所述表达载体，或者所述宿主细胞。优选地，所述药物组合物还包括可药用的载体和/或辅料；优选地，所述药物组合物还包括其它活性剂，例如化疗药物，如替加氟、氟尿嘧啶和奥沙利铂等；癌症辅助治疗药物，如胸腺肽α1、胸腺五肽、亚叶酸钙、格拉司琼和托烷司琼等；细胞毒剂，如阿里他汀、卡奇霉素、美登素和倍癌霉素等；免疫细胞，如nk细胞，t细胞和dc-cik细胞等。所述药物组合物的剂型可以为液体注射剂型或固体栓剂剂型。又一方面，本发明还提供了所述抗pd-1和tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段、所述的核酸分子、所述的表达载体或所述的宿主细胞在制备治疗癌症、感染性疾病或炎性疾病的药物中的应用。具体地，其中所述癌症选自胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、食道癌、小肠癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肾上腺癌、肛区癌、阴户癌、尿道癌、阴茎癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、表皮样癌、鳞状细胞癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、内分泌系统的癌症、软组织肉瘤、中枢神经系统的赘生物、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、t细胞淋巴瘤、慢性或急性白血病(其包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤中的一种或多种；所述感染性疾病选自hiv，流行性感冒，疱疹，贾第虫病，疟疾，利什曼病，或以下病毒引起的感染：肝炎病毒(例如甲型、乙型或丙型肝炎病毒)、疱疹病毒(例如vzv、hsv-1、hav-6、hsv-ii、cmv或埃巴二氏病毒)、腺病毒、流感病毒、牛痘病毒、htlv病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、黄病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、jc病毒和虫媒病毒性脑炎病毒，或以下细菌引起的感染：衣原体、立克次氏体、肺炎球菌、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、脑膜炎球菌、conococci、沙雷氏菌、克雷伯氏菌、变形菌、假单胞菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、白喉杆菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、破伤风梭菌、军团菌、鼠疫杆菌、钩端螺旋体病或莱姆氏病细菌，以下真菌引起的感染：曲霉(例如烟曲霉、黑曲霉等)、假丝酵母(例如白色假丝酵母)、克鲁斯假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、新型隐球酵母、皮炎芽酵母、毛霉目的属(例如毛霉属，犁头霉属或根霉属)、申克氏孢子丝菌、巴西副球孢子菌、粗球孢菌或加膜组织胞浆菌，以下寄生虫引起的感染：痢疾内变形虫、结肠肠袋虫、福纳氏虫、棘变形虫、间日疟原虫、田鼠巴贝虫、吸吮贾第虫、隐孢子虫、卡氏肺囊虫、布鲁斯锥虫、克鲁兹锥虫、多氏利什曼虫、鼠弓浆虫或巴西日圆线虫；所述炎性疾病选自急性播散性脑脊髓炎、阿狄森病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、关节炎、贝切特病、恰加斯病、克罗恩病、大疱性类天疱疮、腹部疾病、皮肌炎、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、1型糖尿病、肺出血-肾炎综合征、格-巴二氏综合征、桥本病、超ige综合征、特发性血小板减少性紫癜、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血、多肌炎、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、类风湿关节炎、斯耶格伦综合征、颞动脉炎、血管炎或韦格纳肉芽肿病。本发明还提供了所述抗pd-1和tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段的制备方法，其包括在能够产生所述抗pd-1和tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段的条件下培养本发明所述的宿主细胞，以及回收所产生的抗pd-1和tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段。本发明提供了能够同时特异性结合程序性死亡因子1(pd-1)和肿瘤内皮标志物8(tem-8)的双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段。本发明的双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段具有以下特性的至少一种：a.能够与pd-1以高特异性结合，阻断pd-1和pd-l1的相互作用；b.与其它cd28家族成员(如icos、ctla-4和cd28)不发生结合；c.能够与tem-8以高特异性结合；d.与其他血管内皮生长因子(如vegfr1-3)不发生结合；e.激活免疫细胞(如肿瘤特异性t细胞)，并特异性识别tem-8阳性肿瘤，促进cd8+进入实体瘤组织，使ifnγ等免疫效应物的水平大大增加，从而实现靶向杀伤肿瘤细胞。本发明还提供了人源化pd-1/tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段。所述人源化抗体由免疫小鼠产生的鼠源抗体经由计算机模拟设计并结合噬菌体展示技术而得到，并且根据其与不同物种的pd-1和tem-8蛋白胞外结构域的结合特性，鉴定其相应的结合表位。本发明所述的人源化抗pd-1/tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段具备上述pd-1/tem-8双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段的有利特性。本发明所述的双特异抗体、或其变体、或其功能性片段可以是全长抗体，或仅包含两抗原结合部分，如重链可变区(vh)、单链(scfv)，或全长抗体与抗原结合部分组成的融合蛋白(如图2)，如上所述任何形式组合所形成的双特异结合蛋白分子均在本发明保护的范围内。本发明所述的变体或功能性片段包括通过化学修饰或通过掺入脂质体中能够增加半寿期的任何片段，修饰后的片段保留与其来源抗体相同的结合特异性和亲和力，这样获得的新的具有双特异结合特性的蛋白分子也在本发明保护的范围内。在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。本领域技术人员可以将编码本发明所述pd-1/tem-8双特异性抗体的dna分子克隆到载体中，进而转化宿主细胞。因此，本发明还提供了以图1a-d所示双特异抗体为例的重组dna载体。编码图2所示pd-1/tem-8双特异抗体的变体及功能性片段的载体及宿主细胞也在本发明保护的范围内。本发明所述的宿主细胞可以为原核宿主细胞、真核宿主细胞或噬菌体。所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核宿主细胞可以为如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等的真菌，如草地粘虫等的昆虫细胞，如烟草等的植物细胞，如bhk细胞、cho细胞、cos细胞、骨髓瘤细胞等的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本发明所述的宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选bhk细胞、cho细胞、nso细胞或cos细胞。本文使用的术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选的可药用载体、辅料或治疗性细胞的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物所含的成分(例如根据本发明的抗体、核酸分子、核酸分子的组合和/或缀合物)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、缓冲溶液、等渗盐溶液如pbs(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇、聚亚烷基二醇如聚丙二醇或甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。根据本发明的药物组合物可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。在一个相关方面，本发明提供了所述pd-1/tem-8双特异性抗体与第二治疗剂组合的药物组合物。在一个实施方案中，所述第二治疗剂是有利地与pd-1/tem-8双特异性抗体组合的任意试剂。可有利地与所述pd-1/tem-8双特异性抗体组合的示例性试剂包括但不限于抑制pd-1活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或干扰pd-1上游或下游信号转导的试剂。本发明提供了一种所述pd-1/tem-8双特异性抗体与其他治疗方法联合使用的方法。在一个实施方案中，所述其他疗法是有利地与所述pd-1/tem-8双特异性抗体组合的任意治疗方法。可有利地与所述pd-1/tem-8双特异性抗体组合的示例性治疗方法包括但不限于具有治疗本发明适应症的其他疗法(包括手术、化疗、放疗、细胞免疫治疗等)。本发明提供的pd-1/tem-8双特异性抗体对pd-1和tem-8同时具有高亲和力，一方面可以可与活化t细胞的pd-1特异性结合，有效封闭pd-l1蛋白与t细胞中pd-1受体的结合，进而阻断pd-1/pd-l通路所造成癌细胞的免疫逃逸机制，激活t细胞杀伤肿瘤活性；另一方面可以靶向tem-8阳性表达肿瘤，即与特异性表达于肿瘤血管内皮tem-8特异结合，抑制肿瘤生长活性和抗肿瘤，实现肿瘤细胞的靶向杀伤，使得该双特异性抗体的杀伤肿瘤效果明显优于pd-1和tem-8单克隆抗体所介导的杀伤肿瘤效果。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1为本发明所述抗pd-1/tem-8双特异性抗体的结构示意图。图2为本发明所述抗pd-1/tem-8双特异性抗体的功能性片段或变体的结构示意图。图3为纯化人源化pd-1、tem-8胞外结构域的sds-page检测结果。图4为抗pd-1单克隆抗体与抗tem-8单克隆抗体的elisa检测结果。图5分别显示抗pd-1单克隆3、21、45与77与cd28家族蛋白的结合。图6分别显示抗pd-1单克隆3、21、45与77对pd-l1蛋白与人t细胞的pd-1结合的封闭作用。图7显示抗tem-8单克隆1、5与69分别与tem-8蛋白的特异性结合。图8显示本发明的双特异性抗体的编码基因的琼脂糖凝胶电泳结果。图9显示编码本发明的双特异抗体的重组质粒图谱。图10显示本发明的pd-1/tem-8双特异性抗体对pd-1和tem-8的特异结合。图11显示本发明的pd-1/tem-8双特异性抗体分别对pd-l1蛋白与人t细胞的pd-1结合的封闭作用。图12显示本发明的pd-1/tem-8双特异性抗体对人t细胞的体外激活作用。图13显示本发明的pd-1/tem-8双特异性抗体的体内抗肿瘤效果。图14显示图2所示的本发明所述pd-1/tem-8双特异性抗体的功能性片段或变体的体内抗肿瘤效果。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。实施例1pd-1/tem-8双特异性抗体的结构设计本发明提供了一些可同时特异性结合pd-1与tem-8胞外结构域的双特异性抗体的结构模型，此类抗体4种主要实例的结构如图1所示，图1a-c中3种异源二聚体的形成均基于本领域技术员所熟知的ch3结构域突变技术(knobandholemutation)(vonkreudensteinetal.，mabs.20135(5):646-54)。其中，(a)抗pd-1特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)-重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)对与抗tem-8特异性抗体的轻链(抗pd-1vl-cl)-重链(抗pd-1vh-ch1-铰链区-ch2-ch3)对组成的双特异性结合蛋白；(b)抗pd-1特异性抗体的轻链-重链对与抗tem-8轻链可变区(抗tem-8vl)、重链可变区(抗tem-8vh)、铰链区和fc片段(抗tem-8ch2-ch3)融合蛋白组成的双特异性结合蛋白；(c)抗pd-1轻链可变区、重链可变区、铰链区和fc片段融合蛋白与抗tem-8特异性抗体的轻链-重链对组成的双特异性结合蛋白；(d)抗pd-1特异性抗体的轻链与抗pd-1特异性抗体的重链，以及抗tem-8轻链可变区(抗tem-8vl)和重链可变区(抗tem-8vh)融合蛋白组成的双特异性结合蛋白。pd-1/tem-8双特异性抗体的变体及功能性片段的实施例如图2所示，图2e-h中的双特异抗体变体及功能性片段的形成基于本领域技术员所熟知的融合肽技术(以多肽链或蛋白质将不同结构域连接，进而实现融合表达)，图2i中异源二聚体的形成基于本领域技术员所熟知的ch3结构域突变技术(同图1a-c)(e)抗pd-1的重链可变区(抗pd-1vh)与抗tem-8重链可变区(抗tem-8vh)的融合蛋白；(f)抗pd-1的单链可变片段(scfv)与抗tem-8的scfv组成的融合蛋白；(g)抗pd-1的单链可变片段(scfv)与抗tem-8的scfv组成的非免疫球蛋白融合蛋白；(h)抗pd-1轻链可变区、重链可变区、铰链区、fc片段与抗tem-8轻链可变区、重链可变区组成的四价融合蛋白；(i)抗pd-1轻链可变区、重链可变区、铰链区和fc片段融合蛋白与抗tem-8轻链可变区、重链可变区、铰链区和fc片段融合蛋白组成的双特异性结合蛋白(注：图中特异性识别pd-1与tem-8的功能片段位置可互换)。实施例2抗pd-1/tem-8双特异性抗体抗原(人pd-1和tem-8胞外可溶结构域)的制备在uniprot数据库获得人源pd-1和tem-8胞外结构域的编码基因序列，通过全基因合成的方式获得编码基因pd-1ed-cds和tem-8ed-cds，合成产物在经bamhi、ecori(pd-1ed-cds)和bamhi、xbai(tem-8ed-cds)双酶切后，克隆到pcdna3.1载体，利用293t细胞(atcc)作为宿主细胞进行蛋白质表达，利用亲和层析、离子交换层析等纯化技术对目的蛋白进行纯化。图3为人源pd-1与tem-8胞外结构域蛋白纯化并进行去糖基化处理后的sds-page检测结果图。实施例3抗人pd-1与tem-8抗体的获得1.免疫动物将1mg/ml已纯化的人pd-1或tem-8胞外结构域蛋白100μl分别与等体积弗氏完全佐剂在室温下均匀混合后，腹部皮下多点注射到5只6-8周balb/c小鼠体内。7天后，将1mg/ml蛋白100μl与等体积弗氏不完全佐剂在室温下均匀混合后，腹部皮下多点注射到小鼠体内。七天后，重复上述步骤。七天后，重复上述步骤。第四次注射后三天，断鼠尾尖取血15μl，室温静置2h，以25℃、6000-8000rpm离心10-15min，取上清，通过elisa实验检测效价。若效价检测可用即眼部取全血，室温静置2h，以25℃、6000-8000rpm离心10min，取上清，-80℃保存。若效价不可用，继续免疫一次。2.细胞融合无菌取小鼠脾细胞并制成细胞悬液，将1×108个脾细胞与2-5×107个骨髓瘤(sp2/0-ag14)细胞融合，以50％peg作融合剂，以hat选择培养基培养3-10天后，以ht培养基进行培养，培养条件为5％co2，37℃。3.阳性克隆筛选利用elisa反应筛选单克隆杂交瘤细胞中可分泌结合pd-1或tem-8胞外结构域蛋白抗体的克隆，其中结合pd-1的优选克隆4株(克隆3、21、45、77)，结合tem-8的优选克隆3株(克隆1、5、69)，以上克隆分泌抗体的elisa检测结果如图4a和b所示，筛选出的克隆均可特异性识别相应的抗原蛋白。实施例4抗pd-1抗体与其他cd28家族蛋白结合的鉴定为鉴定筛选出的pd-1抗体的特异性，将cd28家族的成员蛋白pd-1、cd28、ctla-4和icos(r&dsysterm)于酶标板中在37℃温箱中静置包被2h；4℃封闭过夜；洗涤后加入100μl侯选抗体(1μg/ml)，37℃下孵育1h；洗涤5次后加入稀释的hrp标记的山羊抗小鼠抗体(abcam)，室温孵育1h；洗涤5次后加入opd底物溶液100μl/孔，显色5min后加入50μl/孔的2mh2so4终止反应。用酶标仪测定490nm下各孔的吸光值。实验结果如图5，候选克隆分泌的抗体不结合除pd-1外的cd28家族成员蛋白。实施例5抗pd-1抗体对人t细胞的pd-1受体与pd-l1结合的封闭实验1.人外周血t细胞的分离抽取健康志愿者外周血10ml，向管中加入等体积pbs，轻轻吹打成细胞悬液20ml，以吸管将细胞悬液缓慢加于20mllts1077淋巴细胞分层液的顶层，以2000转/分离心20min，吸去最上层的血浆，并吸取血浆层下的单核细胞置入离心管中，以pbs洗涤3次，获得人外周血单核细胞pbmc。分离得到的pbmc以pbs缓冲液制成悬液，加入100μl/mlcd3抗体(invitrogen)，轻吹混匀，室温孵育15min；加入5μl/ml免疫磁珠(invitrogen)，4℃下孵育60min，每10分钟震荡一次；以pbs冲洗并稀释，将细胞悬液注入填有不锈钢毛的特制试管中，放入分离器进行分离纯化，强磁场下t细胞不能通过分离器，得以纯化，图6a为分离出的t细胞纯度的鉴定结果。2.人pd-l1胞外结构域与绿色荧光蛋白融合蛋白的制备在uniprot数据库获得人pd-l1胞外结构域的编码基因序列，通过全基因合成的方式获得编码基因，合成产物在经ecori、xhoi双酶切后，克隆到pegfp-n1载体中，利用293t细胞(atcc)作为宿主细胞进行蛋白质表达，利用亲和层析、离子交换层析等纯化技术对目的蛋白进行纯化，获得绿色荧光蛋白融合表达的人源pd-l1胞外结构域蛋白rh-pd-l1-gfp，图6b为融合蛋白的表达与纯化并进行去糖基化处理后的sds-page结果。3.抗pd-1抗体对人t细胞的pd-1受体与pd-l1结合的封闭实验将优选4株克隆产生的抗体(1μg/ml)与rh-pd-l1-gfp(1μg/ml)在室温下轻柔混合30min，然后将混合蛋白溶液加入分离纯化出的人外周血t细胞，室温孵育15分钟后以pbs清洗3次，以流式细胞仪进行分析。图6c-g显示克隆3、21和77可阻碍pd-l1与人t细胞上的pd-1受体的结合，而克隆45的阻断效果较差。实施例6抗tem-8抗体与efgr、her2和vegfr的结合的鉴定将tem-8、efgr、her2和vegfr(r&dsysterm)于酶标板中在37℃温箱中静置包被2h；4℃封闭过夜；洗涤后加入100μl侯选抗体(1μg/ml)，37℃下孵育1h；洗涤5次后加入稀释的hrp标记山羊抗小鼠抗体(abcam)，室温孵育1h；洗涤5次后加入opd底物溶液100μl/孔，显色5min后加入50μl/孔的2mh2so4终止反应。用酶标仪测定490nm下各孔的吸光值。实验结果如图7所示，候选克隆分泌的抗体不结合efgr、her2和vegfr蛋白。实施例7抗pd-1和tem-8候选抗体的可变区序列的获得分别扩大培养抗pd-1克隆3、21、77和抗tem-8克隆1、5、69，培养至细胞量为109个，离心收集细胞，去除细胞培养液，以预冷的pbs缓冲液(6-8ml)轻轻洗涤细胞两次；以trizol试剂盒(takara)提取总rna，以紫外分光光度计检测rna的纯度与浓度；以总rna为模板，逆转录获得cdna，逆转录体系为20μl，其中5×逆转录buffer(4μl)，dntp(1μl)，mgcl2(2.4μl)，pd(n6)随机引物(1.5μl)，rna模板(2μg)，逆转录酶(1μl)，depc水(至20μl)。以cdna为模板，扩增杂交瘤中可变区的dna序列，扩增引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补(orlandir,etal.,cloningimmunoglobulinvariabledomainsforexpressionbypolymerasechainreaction.proc.natl.acad.sci.usa,1989,86：3833)，扩增体系为50μl，其中5×pcrbuffer(10μl)，dntp(4μl)，引物(2μl)，cdna模板(1μl)，pcr酶(0.5μl)，pcr水(至50μl)。扩增产物克隆至pmd19载体中，经蓝白斑筛选后进行重组子测序，获得抗pd-1克隆3、21、77的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别为seqidno:1和3，5和7，9和11；编码相应氨基酸的核苷酸序列分别为seqidno:2和4，6和8，10和12。获得抗tem-8克隆1、5、69的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别为seqidno:13和15，17和19，21和23；编码相应氨基酸的核苷酸序列分别为seqidno:14和16，18和20，22和24。实施例8抗pd-1与tem-8抗体的人源化改造根据获得的抗pd-1与tem-8抗体的可变区氨基酸序列(实施例7获得的序列)利用imgt/v-quest在线服务器分析抗体亚型，综合kabat、chothia及imgt三种抗体的cdr区的numbering方案确定抗体轻链与重链的六个cdr区序列；利用ds软件进行小鼠亲本抗体fab及其嵌合人源化抗体fab的空间结构，获得嵌合抗体的分子模型后，对亲本fab和嵌合抗体fab初始模型采用分子动力学模拟进行全面的优化，提取稳定的平均构象；利用表位扫描检验设计的人源化抗体可能存在的线性表位与构象表位，确定必须保留的框架区氨基酸位点后，设计不同的氨基酸突变位点获得人源化抗体。在此基础上，我们得到了多个人源化抗体，其中评分最高的抗pd-1和抗tem-8抗体序列分别为克隆81和克隆76，克隆81的重链和轻链氨基酸序列分别为seqidno:25和27，编码相应氨基酸的核苷酸序列分别为seqidno:26和28；克隆76的重链和轻链氨基酸序列分别为seqidno:29和31，编码相应氨基酸的核苷酸序列分别为seqidno:30和32。实施例9抗pd-1/tem-8双特异性抗体表达载体的构建本发明的抗pd-1/tem-8双特异性抗体中抗pd-1(克隆81，制备方法见实施例8)的可变区编码核苷酸为pd-1-vh和pd-1-vl，抗tem-8(克隆76，制备方法见实施例8)的可变区编码核苷酸为tem-8-vh和tem-8-vl，igg1重链恒定区ch1、铰链区、fc和fc-knob和fc-hole编码核苷酸，以及轻链恒定区cl的kappa链编码核苷酸，以及链接scfv的多肽(ggggs)3编码基因得自于lifetechnologiesinc.(carlsbad，ca)。图1中所示4种结构的双特异性抗体中的各个不同链，vl和cl、vh和ch1、ch1和fc(fc-knob、fc-hole)、scfv和fc(fc-knob、fc-hole)、fc和scfv通过重叠pcr的方式获得。pcdna3.1和pires作为表达载体以制备双特异性抗体，根据载体多克隆位点及编码基因序列设计引物(见表1)。表1pcr引物序列pd-1-vh、pd-1-vl、tem-8-vh、tem-8-vl、ch1、铰链区(hinge)、fc、fc-knob、fc-hole和cl的扩增体系为50μl，其中5×pcrbuffer(10μl)，dntp(4μl)，引物(2μl)，cdna模板(1μl)，pcr酶(0.5μl)，pcr水(至50μl)。扩增条件为：98℃孵育3分钟，然后25个循环：98℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟；以72℃闭合延伸10分钟。图8a为pcr产物的琼脂糖电泳结果图。使用重叠pcr将pd-1-vl和cl；pd-1-vh、ch1、铰链区(hinge)和fc-knob/fc-hole；tem-8-vl和cl；tem-8-vh、ch1、铰链区和fc-hole/fc-knob；pd-1scfv(pd-1-vl、(ggggs)3、pd-1-vh)、铰链区(hinge)和fc-knob/fc-hole；tem-8scfv(tem-8-vl、(ggggs)3、tem-8-vh)、铰链区和fc-hole/fc-knob；pd-1-vh、ch1、铰链区(hinge)、fc和tem-8scfv链接成图1所示的各抗体链的编码基因，pcr体系50μl，其中5×pcrbuffer(10μl)，dntp(4μl)，引物(2μl)，cdna模板(pcr产物各1μl)，pcr酶(0.5μl)，pcr水(至50μl)扩增条件为：98℃孵育3分钟，然后30个循环：98℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟；以72℃闭合延伸10分钟。图8b为pcr产物的琼脂糖电泳结果图。各个链编码序列为seqidno:34、36、38、40、42、44、46。将目的片段酶切后构建至表达载体pcdna3.1，图1所示的4种双特异抗体的重组质粒图谱见图9a-g，其中图9a重组质粒pcdna3.1-pd-1-lc为编码pd-1-vl和cl(抗pd-1轻链)图谱；图9b重组质粒pcdna3.1-tem-8-lc为编码tem-8-vl和cl(抗tem-8轻链)图谱；图9c重组质粒pcdna3.1-pd-1-hc为编码pd-1-vh、ch1、铰链区(hinge)和fc-knob/fc-hole(抗pd-1重链)图谱；图9d重组质粒pcdna3.1-tem-8-hc为编码tem-8-vh、ch1、铰链区(hinge)和fc-knob/fc-hole(抗tem-8重链)图谱；图9e重组质粒pcdna3.1-pd-1scfv-fc为编码pd-1scfv和fc-knob/fc-hole图谱；图9f重组质粒pcdna3.1-tem-8scfv-fc为编码tem-8scfv和fc-knob/fc-hole图谱；图9g重组质粒pcdna3.1-pd-1-hc-tem-8scfv为编码pd-1-vh、ch1、铰链区(hinge)、fc和tem-8scfv图谱。实施例10pd-1/tem-8双特异性抗体的制备1.利用293f宿主细胞表达双特异性抗体在转染之前24小时，将1×106个的293f细胞接种于烧瓶中的293freestyle培养基中，37℃、8％co2、130rpm条件下培养。将100μl293fectin加至1ml的optimem中，搅拌条件下，室温下孵育5分钟。同时，将重组质粒按表2所示组合，溶解于1mloptimem中，dna总量为30μg。将上述dna与293fectin完全混合，并且总体积为2ml，在室温孵育20分钟。然后将该混合物加入至细胞培养物中。在37℃下培养细胞，且培养箱中有5％co2，以130rpm培养5天。表2转染体系各载体组分抗体编号载体组合图1apd-1-lc：pd-1-hc：tem-8-hc：tem-8-lc＝1:2:2:1图1bpd-1-lc：pd-1-hc：tem-8-scfv-fc＝1:2:3图1cpd-1-scfv-fc：tem-8-vh：tem-8-vl＝3:2:1图1dpd-1-lcd：pd-1-hc-tem-8-scfv＝1:32.抗体纯化将细胞培养基于2000×g离心，收集上清并用0.22μm过滤器过滤。将收集的液体用10倍(以体积算)结合缓冲液(9.5mmnah2po4+40.5mmna2hpo4，ph7.0)稀释，然后通过sepharosefastflowproteina亲和色谱柱(购自ge公司，5ml体积)、fabaffinitykbpagarose亲和填料(购自acrobiosystems公司，5ml体积)，和sp阳离子交换色谱柱(购自ge公司，10ml)进行纯化，依使用手册操作。实施例11pd-1/tem-8双特异性抗体特异性结合的鉴定将pd-1、ctla-4、tem-8和vegfr(r&dsysterm)于酶标板中在37℃温箱中静置包被2h；4℃封闭过夜；洗涤后加入纯化后4种抗体(序列参见实施例8，结构参见图1a-d)(100μg/ml)的梯度稀释液(pbs连续稀释(1：102，1：103，1：104，1：105，1：106，1：107，1：108，1：109)，100μl/孔，37℃下孵育1h；洗涤5次后加入稀释的hrp标记山羊抗小鼠抗体(abcam)，室温孵育1h；洗涤5次后加入opd底物溶液100μl/孔，显色5min后加入50μl/孔的2mh2so4终止反应。用酶标仪测定490nm下各孔的吸光值。实验结果如图10所示，4种双特异性抗体可同时特异性识别pd-1和tem-8。实施例12抗pd-1/tem-8双特异性抗体对人t细胞的pd-1受体与pd-l1结合的封闭实验将4种双特异性抗体(序列参见实施例8，结构参见图1a-d)(1μg/ml)与rh-pd-l1-gfp(1μg/ml)在室温下轻柔混合30min，然后将混合蛋白溶液加入分离纯化出的人外周血t细胞，室温孵育15分钟后以pbs清洗3次，以流式细胞仪进行分析。如图11所示，4种双特异性抗体均可阻碍pd-l1与人t细胞上的pd-1受体的结合。实施例13pd-1/tem-8双特异性抗体体外激活t细胞的实验将新鲜制备人外周血的pbmc铺板至96孔平底板中，孵育过夜后，加入10ug/ml的抗体及100ng/ml的破伤风毒素(tt)，培养3天后收集上清液，用lifetechnology公司的luminex仪与emd公司的cd8+细胞因子检测试剂盒检测双特异抗体及对照组的il2分泌水平(结果见图12)。结果显示，所述人源化抗体均可刺激t细胞的功能，图1所示的4种形式的pd-1/tem-8双特异性抗体(序列参见实施例8)均可有效激活t细胞功能，其中图1d形式的双特异抗体激活效果相对较好，对照组与4种形式的pd-1/tem-8双特异性抗体导致的il-2分泌量的增率分别为115.2％，291.5％，278.2％，322.2％和341.7％。表3激活t细胞功能的试验注：与对照组比较**p<0.01。实施例14抗pd-1/tem-8双特异抗体的体内肿瘤杀伤实验1.异植瘤模型建立将处于对数生长期的ct-26细胞重悬于无血清的rpmi1640培养液，使得细胞浓度为1×107个细胞/ml。将细胞注射于小鼠的左肩背部，每只200μl，记为实验0天。每两天测一次荷瘤的最长直径和最短直径，荷瘤的体积用公式：体积(mm3)＝长×宽2/2。实验第30天，肿瘤的体积达到了500mm3，处死小鼠，分离肿瘤。2.抗pd-1/tem-8双特异性抗体杀伤肿瘤实验将种植瘤小鼠分为4组，每组4只，以纯化的pd-1/tem-8双特异性抗体(序列参见实施例8，由图1d所示的)尾静脉注射至成瘤小鼠体内，用量分别为a组：0mg/kg，b组：5mg/kg，c组：50mg/kg和d组：100mg/kg。每隔一周注射1次，连续注射4次，记录小鼠体内肿瘤大小变化。pd-1/tem-8双特异性抗体不仅抑制小鼠体内肿瘤的生长，同时还具有缩小肿瘤的作用，以50mg/kg和500mg/kg剂量注射6周后，肿瘤体积分别缩小至初始体积的54.7％和41.7％(见图13a)。表4双抗对肿瘤的抑制作用结果组别肿瘤大小肿瘤体积增率对照组1120±54mg1178.9％5mg/kg组389±40mg**413.8％50mg/kg组52±20mg**54.7％500mg/kg组40±22mg**41.7％注：与对照组比较**p<0.01。3.pd-1单克隆抗体、tem-8单克隆抗体与抗pd-1/tem-8双特异性抗体肿瘤杀伤效率比较实验将种植瘤小鼠分为4组，每组4只，以纯化的pd-1单克隆抗体(实施例8制备的克隆81)、tem-8单克隆抗体(实施例8制备的克隆76)与抗pd-1/tem-8双特异性抗体(序列参见实施例8，图1d所示的双抗)尾静脉注射至成瘤小鼠体内，用量分别为a组：pbs，b组：50mg/kgpd-1单抗(克隆81)，c组：50mg/kgtem-8单抗(克隆76)和d组：50mg/kg抗pd-1/tem-8双特异性抗体(图1d所示的双抗)。每隔一周注射1次，连续注射4次，记录小鼠体内肿瘤大小变化。抗pd-1/tem-8双特异性抗体缩小肿瘤的作用明显优于pd-1单抗和tem-8单抗，在pd-1单抗、tem-8单抗和抗pd-1/tem-8双抗的作用下，肿瘤体积分别缩小至初始体积的64.9％，81.8％和51.1％(见图13b，p＜0.01)。表5不同抗体对肿瘤的抑制作用结果组别肿瘤大小肿瘤体积增率对照组1239±49mg1264.3％pd-1单抗组61±22mg**64.9％tem-8单抗组81±25mg**81.8％抗pd-1/tem-8双抗组48±20mg**#&51.1％注：与对照组比较**p<0.01。与pd-1单抗组比较#p<0.05。与tem-8单抗组比较&p<0.05。实施例15抗pd-1/tem-8双特异抗体的变体(图2所示5种变体)体内肿瘤杀伤实验将种植瘤小鼠分为6组，每组4只，以纯化的5种抗pd-1/tem-8双特异抗体的变体(图2e-i所示的双抗变体，序列参见克隆81和克隆76，制备方法见实施例8)尾静脉注射至成瘤小鼠体内，用量分别为a组：pbs，b组：50mg/kg变体1(图2e)，c组：50mg/kg变体2(图2f)，d组：50mg/kg变体3(图2g)，e组：50mg/kg变体4(图2h)，和f组：50mg/kg变体5(图2i)。每隔一周注射1次，连续注射4次，记录小鼠体内肿瘤大小变化。5种抗pd-1/tem-8双特异性抗体的变体同样具备抑制肿瘤生长的功效，在变体1-5的作用下，肿瘤体积分别发展至初始体积的100.5％，71.1％，72.1％，69.6％，64.2％和65.5％(见图14，p＜0.01)。表6不同抗体的变体对肿瘤的抑制作用结果注：与对照组比较**p<0.01。<110>顺昊细胞生物技术（天津）股份有限公司<120>抗pd-1和tem-8双特异性抗体及其应用<130>shunhobimab-pd-1xtem-8<160>46<170>patentinversion3.3<210>1<211>120<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆3重链的氨基酸序列<400>1glnglyglnleuvalglnserglyglygluvallyslysproglyala151015serleuargleuaspcyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyglyiletrptyraspglyserlysargtyrtyrasnglulysphe505560lysasnargvalthrilethralaasplysserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargargasptyrphepheasptrptyrpheasptyrtrpglygln100105110glythrthrvalthrvalserser115120<210>2<211>360<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆3重链可变区的核苷酸序列<400>2cagggccagctggtgcagagcggcggcgaggtgaagaagcccggcgccagcctgaggctg60gactgcaaggccagcggctacaccttcaccaactactacatgcactgggtgaggcaggcc120cccggccagggcctggagtggatgggcggcatctggtacgacggcagcaagaggtactac180aacgagaagttcaagaacagggtgaccatcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctac240atggagctgagcagcctgaggagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggagggac300tacttcttcgactggtacttcgactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagc360<210>3<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆3轻链可变区的氨基酸序列<400>3gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalaserilesercysargalaserglnservalserthrser202530glytyrsertyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalapro354045argleuleuiletyraspalasertyrleugluserglyileproala505560argpheserglyserglyserglythraspphethrleulysileser65707580serleugluprogluaspvalglyvaltyrtyrcysglnhisserser859095asntrpproleuthrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105110<210>4<211>333<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆3轻链可变区的核苷酸序列<400>4gagatcgtgctgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagagggccagc60atcagctgcagggccagccagagcgtgagcaccagcggctacagctacctggcctggtac120cagcagaagcccggccaggcccccaggctgctgatctacgacgccagctacctggagagc180ggcatccccgccaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagc240agcctggagcccgaggacgtgggcgtgtactactgccagcacagcagcaactggcccctg300accttcggccagggcaccaagctggagatcaag333<210>5<211>114<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆21重链可变区的氨基酸序列<400>5glnvalglnleuvalgluserglyalagluvalvalglnproglyarg151015serleuargleuaspcyslysalaserglytyrilethrpheserasp202530tyrtyrmettyrtrpvalargglnalaproglyhisglyleuglutrp354045ileglytyrileasnproserasnglyglythrasnpheasnglulys505560phelysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleu65707580pheleuglnmetasnserleuglnpheaspaspthralavaltyrtyr859095cysalathrasnaspasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrval100105110serser<210>6<211>342<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆21重链可变区的核苷酸序列<400>6caggtgcagctggtggagagcggcgccgaggtggtgcagcccggcaggagcctgaggctg60gactgcaaggccagcggctacatcaccttcagcgactactacatgtactgggtgaggcag120gcccccggccacggcctggagtggatcggctacatcaaccccagcaacggcggcaccaac180ttcaacgagaagttcaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaagaacaccctg240ttcctgcagatgaacagcctgcagttcgacgacaccgccgtgtactactgcgccaccaac300gacgactactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc342<210>7<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆21轻链可变区的氨基酸序列<400>7aspilevalmetthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalaserilesercysargalaserlysglyvalsersertyr202530leuhistrptyrglnglnlysproglyglnserproargleuleuile354045tyrleualasertyrleugluserglyvalproaspargphesergly505560serglyserglythraspphethrleulysileserargvalgluala65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnserargaspleuprotyr859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>8<211>321<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆21轻链可变区的核苷酸序列<400>8gacatcgtgatgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagagggccagc60atcagctgcagggccagcaagggcgtgagcagctacctgcactggtaccagcagaagccc120ggccagagccccaggctgctgatctacctggccagctacctggagagcggcgtgcccgac180aggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagcagggtggaggcc240gaggacttcgccgtgtactactgccagcagagcagggacctgccctacaccttcggccag300ggcaccaagctggagatcaag321<210>9<211>115<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆77重链可变区的氨基酸序列<400>9glnglyglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015thrcysthrvalthrglytyrserilethrserasptyrsertrpasn202530trpileargglnalaproilehisglyleuglutrpileglytyrile354045asntyralaglyserthrsertyrasnproserleuglualavalthr505560ilethralaasplysserthrserthralatyrmetgluleuserser65707580leuargsergluaspthralavaltyrtyrcysalaargtrpphegly859095serthralatrptyrileaspvaltrpglyglnglythrthrvalthr100105110valserser115<210>10<211>345<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆77重链可变区的核苷酸序列<400>10cagggccagctggtgcagagcggcgccgaggtga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