乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品及其制备方法与流程

本发明属于微生物学检测方面的质量控制领域，特别涉及一种乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品及其制备方法。
背景技术：
：乳粉微生物学检验领域非常特殊。目前，国内外尚未有机构制备乳粉微生物学标准样品和大规模生产的先例，仍属空白领域。目前虽有一些机构制备微生物类的标准样品，但标准样品的均匀性和稳定性几乎不能满足要求，运输极为困难；或标准样品为仅含有目标菌的纯菌株，与实际样品差距较大，不能满足日常实验室质量控制等需要。金黄色葡萄球菌为常见的一种革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界，可以引起人和动物的感染。人类感染金黄色葡萄球菌后，即可引起皮肤的局部化脓性感染，也可引起严重的内脏器官感染，甚至败血症、中毒性休克等。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素可沾染食物而致食物中毒。如果制备的金黄色葡萄球菌样品中，目标菌易发生变化(繁殖和死亡等)，就会导致样品的保存期短，样品的均匀性和稳定性差，影响质量控制效果。因此，综合考虑细菌的生化特性，选取性质相对稳定的菌群作为目标菌对保证样品的均匀性和稳定性十分重要。金黄色葡萄球菌样品制备的工艺技术要求比较高，并且样品的均匀性和稳定性与冻干的菌种、冻干的工艺条件、冻干保护剂的使用、再水化的介质等均有密切的关系。乳粉中金黄色葡萄球菌指标，直接反映着乳粉的卫生质量与潜在致病风险。如果金黄色葡萄球菌数超过一定限量，就会导致食源性疾病发生。因此，制备均匀性与稳定性俱佳的金黄色葡萄球菌标准样品，可以避免金黄色葡萄球菌检验的随意性和不确定性，有效地保证检测结果的准确可信。这对提高实验室质量控制水平，保障乳粉安全，甚至于打破国际贸易壁垒、提高我国乳粉国际竞争力都具有特殊重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是克服金黄色葡萄球菌标准样品中目标菌的活菌数目在运输、储存和测试等过程中总菌落数都可发生变化的问题，提供一种乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品，均匀性、稳定性符合标准样品要求，本发明的另一个目的是提供该样品的制备方法，工艺简单，成功率高。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品，其特征是：包括目标菌和背景菌群，所述目标菌为金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，所述背景菌群由弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)、大肠埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)组成。所述样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质，其中海藻糖的体积分数为12％、脱脂奶粉的体积分数为15％。所述样品中目标菌的目标浓度为102～103cfu/ml，背景菌群的目标浓度为103cfu/ml。乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品的制备方法，其特征是：包括样品添加菌株的选择、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验四个步骤，其中样品冻干过程为：菌株复苏传代—增菌—菌悬液配制—冻干和包装—储存，具体过程为：(1)菌株复苏传代将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；(2)增菌目标菌培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，从斜面刮取菌落，加到10ml的冻干保护剂中制成相应单一菌种的菌液；(3)菌悬液配制将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，按目标菌的目标浓度102～103cfu/ml和背景菌群的目标浓度103cfu/ml配制菌悬液，分别配制目标菌的菌悬液和4个背景菌的菌悬液，背景菌按1:1的体积比例混合形成背景菌群悬液，再将目标菌悬液和背景菌群悬液按1：1体积比混合，置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到样品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；(4)冻干和包装将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥50～55h，当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞，关闭机器，样品瓶中样品为真空状态；(5)储存将样品放置在-18℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品发放给参试实验室或进行均匀性和稳定性试验。所述冻干保护剂为含有海藻糖和脱脂奶粉的无菌水，其中体积分数分别为：海藻糖12％、脱脂奶粉15％。所述样品的均匀性和稳定性试验按照gb/t15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》进行。本发明菌种的选择采用金黄色葡萄球菌作为目标菌，以弗氏柠檬酸杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、蜡样芽胞杆菌作为背景菌群，最大程度保证测试样品的稳定性，且不影响金黄色葡萄球菌的检测。本发明的金黄色葡萄球菌标准样品具有以下优势特性：活的微生物、数量不发生变化、生化特征不发生变异，从满足特殊运输的条件着手，通过特殊工艺的研究、稳定性和均匀性的研究等形成一套完善的标准样品的制备技术，适合于乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品的制备。附图说明图1为本发明工艺流程图。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明并不局限于具体实施例。实施例1乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品，包括目标菌和背景菌群，所述目标菌为金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，所述背景菌群由弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)、大肠埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)组成。所述样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质，其中海藻糖的体积分数为12％、脱脂奶粉的体积分数为15％。所述样品中目标菌的目标浓度为102～103cfu/ml，背景菌群的目标浓度为103cfu/ml。实施例2如图1所示，一种实施例1中乳粉中金黄色葡萄球菌标准样品的制备方法，包括样品添加菌株的选择、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验四个步骤，具体步骤如下：1、样品添加菌株的选择按照目标菌：金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，背景菌群：大肠埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、蜡样芽胞杆菌(bacilluscereus)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)选择标准菌株，所有标准菌株均购于政府指定的机构，并附有菌株证书，保证了菌株的溯源性。2、冻干保护剂的配制样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质(体积分数：海藻糖12％，脱脂奶粉15％)配制冻干保护剂。3、样品冻干(1)菌株复苏传代将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；(2)增菌目标菌培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，从斜面上刮取菌落，加入到10ml冻干保护剂中制成相应单一菌种的菌液；(3)菌悬液配制将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，按目标菌的目标浓度102～103cfu/ml和背景菌群的目标浓度103cfu/ml配制菌悬液。为保证得到的最终样品中含有以上目标浓度的菌株，本实施例中按照目标菌103cfu/ml配制目标菌的菌悬液；背景菌按103cfu/ml配制4个背景菌的菌悬液，按1:1的体积比例混合，形成背景菌群悬液，再将目标菌悬液和背景菌群悬液按1：1体积比混合，得到混合菌悬液，采用比浊法检查菌株含量；置于磁力搅拌器上不断搅拌下取1.0ml分装到样品瓶(西林瓶)中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；(4)冻干和包装将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥机参数按如下设置：冷冻速度(coolingrate)0.5℃/min早期冷冻点(incipientfreezingpoint)-1℃15min冷冻温度(coolingtemperature)-40℃共熔点(meltingpointeutectictemperature)-29℃加热温度(heatingtemperature)20℃120min启动冷冻干燥机，机器直接进入程序化的冷冻干燥过程，整个冻干过程55h。当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞；关闭机器。剔除塞子不紧的西林瓶，西林瓶中样品为真空状态；(5)储存将样品放置在-18℃条件下避光保存，并对保存的样品进行适当管理和检测，从全部样品中随机挑选样品发放给实验室或进行均匀性和稳定性试验。4、样品的均匀性和稳定性试验对样品中目标菌的均匀性和稳定性检查是验证样品制备过程有效性的主要方法。检查样品均匀性和稳定性按照gb/t15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》进行。所得样品均匀性和稳定性检测方法及结果如下：分别随机选取12个样品，采用sn/t1895-2007金黄色葡萄球菌测试方法，在重复条件测试2×12份样品的金黄色葡萄球菌。结果数据用方差分析法进行统计处理，统计步骤及结果如下：表1方差分析公式上表中，表2样品均匀性检测结果表3样品均匀性试验方差分析结果结论：在95％置信概率下，与其他因素对测试结果的影响相比，样品的不均匀性是可接受的。采用两种类型的稳定性试验：一种是在贮存温度(4℃)下的稳定性试验，另一种是在高的温度(模拟样品的运输条件)下的稳定性试验，选用三个温度点，分别为20℃、36℃和42℃。定期检测样品，针对不同温度点不同的保存时间测试3个样本，将2×3份样品结果的均值(对数转化后)用方差分析法进行统计处理，f值