一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型方法

本发明涉及一种基于fq-rca的rna等温实时基因分型方法，属于分子生物学。

背景技术：

1、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,snps)是人类最常见的遗传变异之一，在致病基因鉴定、药物反应预测和个性化治疗中都发挥着至关重要的作用。因此，snp检测在基础研究和临床应用中的重要性日益凸显。

2、snp基因分型技术有很多，绝大多数是以dna为检测靶标，以rna为识检测靶标的方法很少。现有的以dna为检测靶标的snp基因分型技术主要有dna测序、pcr、限制性核酸内切片段长度多态性(rflp)分析和基因芯片这几种。dna测序能够直接读取dna序列，是最直接、可靠的基因分型方法，但它的缺陷也很明显，就是速度慢、成本高，且对仪器和试剂要求高，这导致它无法被推广应用。

3、pcr应用于snp检测主要有扩增阻滞突变系统pcr(arms-pcr)和实时荧光定量pcr(rt-pcr)两大类。其中，arms-pcr建立在等位基因特异性延伸反应的基础上，通过凝胶电泳分辨有无扩增产物，从而确定snp基因型。arms-pcr虽然简便、低成本，但是它特异性不高，容易造成假阳性结果，且需要分管进行，增加了检测量。rt-pcr检测snp位点主要有依赖荧光探针的taqman探针和分子信标探针技术，以及依赖荧光染料和熔解曲线的高分辨率熔解曲线技术(hrm)。rt-pcr大大提高了snp分型的速度和通量，但是对热循环的要求仍是它在这个领域中的一个不足。

4、rflp分析关键在于限制性内切酶特异性识别序列并切割。这种方法虽然操作简单，成本低，但是并非所有的snp位点均能找到合适的限制性核酸内切酶，所以不适用于所有snp位点分型。

5、基因芯片技术实质上是一种大规模集成的固相杂交技术，在固相支持物上固定特定的寡聚核苷酸，再与样品杂交，检测分析。基因芯片实现了snp检测的集成化和高通量化，但是它杂交、洗脱条件严苛，否则特异性难以保证。

6、以rna为检测靶标的snp基因分型技术则主要是先将rna逆转录成cdna再使用以dna为检测靶标的snp基因分型技术进行后续的检测，这样无疑会增加实验的成本和时间。并且，由于逆转录酶没有3’-5’的外切酶活性，没有校正功能，逆转录合成的cdna出错的概率较高，会出现信息偏差，因此，rna水平的序列信息更能体现表观遗传的核酸信息。对于一些非模式生物研究、与蛋白表达水平相关的应用和rna样本更易获取的场景，如rna病毒检测、个体化用药指导和基于游离rna的无创性产前诊断等，检测rna会更加直接和准确。

7、splintr dna连接酶(即pbcv-1dna连接酶)是一种atp依赖的dna连接酶，它能够高效催化与一条互补的rna单链配对的两条相邻dna单链的连接反应。这两条相邻的dna链中，提供3’羟基的被称之为受体dna链(acceptor dna)，提供5’磷酸的被称之为供体dna链(donor dna)；在这个连接过程中需要一条互补的rna链对两条dna单链起“夹板”或“支架”的作用。研究发现，splintr dna连接酶对于以rna为夹板的dna末端连接具有很高的活性，比t4 dna连接酶的连接效率要高很多。因此，出现了直接以rna为连接探针进行rna序列检测的技术。但是，splintr dna连接酶的碱基特异性识别能力较差，这导致直接以rna为靶标的snp检测技术受到限制。因此，开发一种简单、经济且特异性好的直接以rna为检测靶标进行snp基因分型的方法很有意义。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种基于fq-rca的rna等温实时基因分型试剂盒，所述试剂盒的成分包含锁式探针(padlock probe)杂交试剂、锁式探针环化试剂、滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂；所述锁式探针杂交试剂的成分包含第一锁式探针和第二锁式探针；所述第一锁式探针和第二锁式探针能够分别与野生型rna模板和突变型rna模板特异性结合，形成第一杂合体和第二杂合体；所述锁式探针环化试剂的成分包含splintr dna连接酶；所述splintr dna连接酶能够将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分包含滚环扩增引物；所述滚环扩增引物能够分别与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，进而引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增；所述滚环扩增试剂用于将第一环化产物和第二环化产物滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物；所述检测探针杂交试剂的成分包含第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；所述淬灭探针杂交试剂的成分包含淬灭探针；所述淬灭探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第一检测探针产生的信号；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第二检测探针产生的信号。

2、在本发明的一种实施方式中，所述第一锁式探针与野生型rna模板完全匹配；所述第二锁式探针与突变型rna模板完全匹配。

3、在本发明的一种实施方式中，所述滚环扩增引物能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针互补配对，进而与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，最终引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增。

4、在本发明的一种实施方式中，所述滚环扩增试剂的成分包含dntp和dna聚合酶；所述dntp能够在dna聚合酶的作用下进行第一环化产物和第二环化产物的滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物。

5、在本发明的一种实施方式中，所述dna聚合酶为phi29 dna聚合酶。

6、在本发明的一种实施方式中，所述第一检测探针和第二检测探针上分别偶联有第一荧光标记物和第二荧光标记物；所述淬灭探针上偶联有荧光淬灭标记物；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；所述淬灭探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述第一荧光标记物的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述第二荧光标记物的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭。

7、在本发明的一种实施方式中，所述第一荧光标记物包括vic荧光基团、fam荧光基团、hex荧光基团或joe荧光基团；所述第二荧光标记物包括vic荧光基团、fam荧光基团、hex荧光基团或joe荧光基团；所述荧光淬灭标记物包括bhq淬灭基团、mgb淬灭基团或dabcyl淬灭基团。

8、在本发明的一种实施方式中，所述第一锁式探针和第二锁式探针的5’端修饰有磷酸基团。dna序列5’端一般为羟基(-oh)，而连接酶是将5’端的磷酸基团(5’-p)与3’端的羟基基团(3’-oh)进行连接形成磷酸二酯键，因此需要将挂锁探针的5’端进行磷酸化修饰，才能让其连接成环。

9、在本发明的一种实施方式中，所述滚环扩增引物的3’端设置有两个或三个碱基的硫代修饰。两个碱基的硫代修饰能够有效防止滚环扩增引物被phi29dna聚合酶的外切酶活性酶切。三个碱基的硫代修饰能够完全防止滚环扩增引物被phi29 dna聚合酶的外切酶活性酶切。

10、在本发明的一种实施方式中，所述第一检测探针的3’端修饰有vic荧光基团；所述第二检测探针的3’端修饰有fam荧光基团；所述淬灭探针的5’端修饰有bhq淬灭基团，3’端修饰有磷酸基团。

11、在本发明的一种实施方式中，所述锁式探针杂交试剂的成分由第一锁式探针和第二锁式探针组成；所述锁式探针环化试剂的成分由splintr dna连接酶组成；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分由滚环扩增引物组成；所述滚环扩增试剂的成分由dntp和dna聚合酶组成；所述检测探针杂交试剂的成分由第一检测探针和第二检测探针组成；所述淬灭探针杂交试剂的成分由淬灭探针组成。

12、在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的成分还包含splintr dna连接酶缓冲液、exoⅰ、rnase h、exoⅰbuffer、rnase h buffer、牛血清白蛋白、rox参比染料和phi29 dna聚合酶缓冲液。

13、在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒的成分还包含ddh2o。

14、在本发明的一种实施方式中，对cyp2c9基因的rs1057910突变位点进行snp基因分型检测时，所述第一锁式探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述第二锁式探针的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述滚环扩增引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如seq idno.7所示，所述淬灭探针的核苷酸序列如seq id no.8所示。

15、在本发明的一种实施方式中，对cyp2c9基因的rs1057910突变位点进行snp基因分型检测时，所述野生型rna模板的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述突变型rna模板的核苷酸序列如seq id no.2所示。

16、本发明还提供了一种基于fq-rca的rna等温实时基因分型方法，所述方法使用上述试剂盒对待测rna进行snp基因分型检测。

17、在本发明的一种实施方式中，所述方法包括：将待测rna与锁式探针杂交试剂混合后进行孵育，得到孵育液a；将孵育液a与锁式探针环化试剂混合后进行孵育，得到孵育液b；将孵育液b与核酸内切酶和核酸外切酶混合后进行孵育，得到孵育液c；将孵育液c与滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂混合后进行反应，得到检测体系；对检测体系进行荧光定量pcr；根据荧光定量pcr结果判断待测rna的snp基因分型结果。若第一检测探针的荧光信号下降，第二检测探针的荧光信号不变，则待测rna为野生型；若第一检测探针的荧光信号不变，第二检测探针的荧光信号下降，则待测rna为突变型；若第一检测探针和第二检测探针的荧光信号同时下降，则待测rna为野生突变杂合型。

18、在本发明的一种实施方式中，所述方法包括：将待测rna、第一锁式探针、第二锁式探针和ddh2o混合后，先于90～100℃孵育2～10min，再降温至20～30℃，得到孵育液a；将孵育液a、splintr dna连接酶和splintr dna连接酶缓冲液(splintr buffer)混合后，先于20～37℃孵育1～16h，再于60～70℃孵育15～30min使splintr dna连接酶灭活，得到孵育液b；将孵育液b、ddh2o、exoⅰ(核酸外切酶ⅰ)、rnase h(核酸内切酶)、exoⅰbuffer和rnase hbuffer混合后，先于20～40℃孵育30～120min进行消化，再于75～90℃孵育10～20min使exoⅰ和rnase h灭活，得到孵育液c；对孵育液c中的第一环化产物和第二环化产物进行纯化浓缩，得到浓缩产物；将浓缩产物、滚环扩增引物、dntp、phi29 dna聚合酶、第一检测探针、第二检测探针、淬灭探针、牛血清白蛋白(bsa)、rox参比染料、phi29 dna聚合酶缓冲液(phi29 buffer)和ddh2o混合后，于20～40℃反应30～180min，得到检测体系；对检测体系进行荧光定量pcr；根据荧光定量pcr结果判断待测rna的分型结果。所述方法中，ddh2o用于补足各孵育体系和反应体系，若各孵育体系和反应体系其余组分已满足标准，则无需额外添加ddh2o。

19、在本发明的一种实施方式中，对cyp2c9基因的rs1057910突变位点进行snp基因分型检测时，所述第一锁式探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述第二锁式探针的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述滚环扩增引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如seq idno.7所示，所述淬灭探针的核苷酸序列如seq id no.8所示。

20、在本发明的一种实施方式中，对cyp2c9基因的rs1057910突变位点进行snp基因分型检测时，所述野生型rna模板的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述突变型rna模板的核苷酸序列如seq id no.2所示。

21、在本发明的一种实施方式中，所述待测rna、第一锁式探针、第二锁式探针和ddh2o的混合体积比为1～10：1～2：1～2：0～7。

22、在本发明的一种实施方式中，所述孵育液a、splintr dna连接酶和splintr dna连接酶缓冲液的混合体积比为5～11：0.5～1：1.5～2。

23、在本发明的一种实施方式中，所述孵育液b、ddh2o、exoⅰ、rnase h、exoⅰbuffer和rnase h buffer的混合体积比为15～20：0～1：2～10：1～2：2～3：2～3。

24、在本发明的一种实施方式中，所述浓缩产物、滚环扩增引物、dntp、phi29dna聚合酶、第一检测探针、第二检测探针、淬灭探针、牛血清白蛋白、rox参比染料、phi29 dna聚合酶缓冲液和ddh2o的混合体积比为2～7：1～2：1～2：0.5～1：1～2：1～2：2～4：0.5～1：0.5～1：2～2.5：0～5。

25、在本发明的一种实施方式中，所述孵育液b中，第一锁式探针的浓度为0.1～2μm，第二锁式探针的浓度为0.1～2μm，splintr dna连接酶的浓度为0.5～2.5u/μl。

26、在本发明的一种实施方式中，所述孵育液c中，exoⅰ的浓度为0.5～2.5u/μl，rnaseh的浓度为0.4～0.8u/μl。

27、在本发明的一种实施方式中，所述检测体系中，滚环扩增引物的浓度为0.1～1μm，第一检测探针的浓度为50～500nm，第二检测探针的浓度为50～500nm，淬灭探针的浓度为100～1000nm，dntp的浓度为100～500μm，dna聚合酶的浓度为0.1～1u/μl，牛血清白蛋白的浓度为1～2mg/ml。

28、在本发明的一种实施方式中，所述检测体系中，滚环扩增引物的浓度为200nm，淬灭探针的浓度为400nm，第一检测探针的浓度为200nm，第二检测探针的浓度为200nm，dntp的浓度为200μm，dna聚合酶的浓度为0.25u/μl。

29、本发明还提供了上述试剂盒或上述方法在snp基因分型检测中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。

30、在本发明的一种实施方式中，所述snp基因分型以rna为检测靶标。

31、在本发明的一种实施方式中，对cyp2c9基因的rs1057910突变位点进行snp基因分型检测时，所述第一锁式探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述第二锁式探针的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述滚环扩增引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如seq idno.7所示，所述淬灭探针的核苷酸序列如seq id no.8所示。

32、在本发明的一种实施方式中，对cyp2c9基因的rs1057910突变位点进行snp基因分型检测时，所述野生型rna模板的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述突变型rna模板的核苷酸序列如seq id no.2所示。

33、本发明技术方案，具有如下优点：

34、1、本发明提供了一种基于fq-rca的rna等温实时基因分型试剂盒，所述试剂盒的成分包含锁式探针杂交试剂、锁式探针环化试剂、滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂；所述锁式探针杂交试剂的成分包含第一锁式探针和第二锁式探针；所述第一锁式探针和第二锁式探针能够分别与野生型rna模板和突变型rna模板特异性结合，形成第一杂合体和第二杂合体；所述锁式探针环化试剂的成分包含splintr dna连接酶；所述splintr dna连接酶能够将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分包含滚环扩增引物；所述滚环扩增引物能够分别与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，进而引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增；所述滚环扩增试剂用于将第一环化产物和第二环化产物滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物；所述检测探针杂交试剂的成分包含第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；所述淬灭探针杂交试剂的成分包含淬灭探针；所述淬灭探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第一检测探针产生的信号；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第二检测探针产生的信号。使用所述试剂盒进行snp基因分型检测具有如下优势：

35、第一，能够成功区分出三种基因型，检测准确度较高；

36、第二，将fq探针和rca(滚环扩增)技术结合，实现了对rca反应中突变位点的实时检测，并结合了splintr dna连接酶能够以rna为夹板高效连接dna的特性，以及两套锁式探针相互竞争减少非特异性连接的方法，可以直接以rna为靶标进行检测snp，无需逆转录成cdna；

37、第三，使用两条分别与野生型和突变型模板完全匹配的锁式探针，两条探针之间互相形成竞争关系，可以有效抑制非特异性连接；当有野生型和突变型两种锁式探针存在时，由于碱基互补长度和结合自由能，野生型模板更易与野生型锁式探针配对，突变型模板更易与突变型锁式探针配对，从而减少由于splintr dna连接酶碱基特异性识别不佳带来的非特异性连接，进而降低splintr dna连接酶特异性不好的影响；

38、第四，使用fq探针，使得rca反应的信号可以被实时的监测；

39、第五，由于rca反应的产物是单链，且反应温度一般较低，导致能实时检测rca信号的探针很少，如分子信标的茎环结构的开合比较依赖于温度，rca的反应温度(30℃)一般较难打开其茎环，而fq探针不依赖于温度，在低温时也能够与rca产物结合，产生荧光信号的变化，对控温要求不高，反应全程都可以在恒温甚至室温下反应，操作简单，且对仪器热循环性能要求低。

40、进一步地，对cyp2c9基因的rs1057910突变位点进行snp基因分型检测时(野生型rna模板的核苷酸序列如seq id no.1所示，突变型rna模板的核苷酸序列如seq id no.2所示)，第一锁式探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，第二锁式探针的核苷酸序列如seqid no.4所示，滚环扩增引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，第一检测探针的核苷酸序列如seq id no.6所示，第二检测探针的核苷酸序列如seq id no.7所示，淬灭探针的核苷酸序列如seq id no.8所示，此处基于cyp2c9基因的rs1057910突变位点设计的所有引物和探针序列具有较好的特异性，可以用于cyp2c9基因的snp检测。

41、2、本发明提供了一种基于fq-rca的rna等温实时基因分型方法，所述方法使用上述基于fq-rca的rna等温实时基因分型试剂盒对待测rna进行检测，先通过splintr dna连接酶连接分别与野生型rna和突变型rna完全匹配的两条锁式探针，形成dna环状模板，再通过含有两套fq探针的rca反应进行实时荧光信号检测。使用所述方法进行snp基因分型具有如下优势：

42、第一，能够成功区分出三种基因型，检测准确度较高；

43、第二，将fq探针和rca(滚环扩增)技术结合，实现了对rca反应中突变位点的实时检测，并结合了splintr dna连接酶能够以rna为夹板高效连接dna的特性，以及两套锁式探针相互竞争减少非特异性连接的方法，可以直接以rna为靶标进行检测snp，无需逆转录成cdna；

44、第三，使用两条分别与野生型和突变型模板完全匹配的锁式探针，两条探针之间互相形成竞争关系，可以有效抑制非特异性连接；当有野生型和突变型两种锁式探针存在时，由于碱基互补长度和结合自由能，野生型模板更易与野生型锁式探针配对，突变型模板更易与突变型锁式探针配对，从而减少由于splintr dna连接酶碱基特异性识别不佳带来的非特异性连接，进而降低splintr dna连接酶特异性不好的影响；

45、第四，使用fq探针，使得rca反应的信号可以被实时的监测；

46、第五，由于rca反应的产物是单链，且反应温度一般较低，导致能实时检测rca信号的探针很少，如分子信标的茎环结构的开合比较依赖于温度，rca的反应温度(30℃)一般较难打开其茎环，而fq探针不依赖于温度，在低温时也能够与rca产物结合，产生荧光信号的变化，对控温要求不高，反应全程都可以在恒温甚至室温下反应，操作简单，且对仪器热循环性能要求低。

47、进一步地，所述方法包括：将待测rna与锁式探针杂交试剂混合后进行孵育，得到孵育液a；将孵育液a与锁式探针环化试剂混合后进行孵育，得到孵育液b；将孵育液b与核酸内切酶和核酸外切酶混合后进行孵育，得到孵育液c；将孵育液c与滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂混合后进行反应，得到检测体系；对检测体系进行荧光定量pcr；根据荧光定量pcr结果判断待测rna的snp基因分型结果；所述检测体系中，滚环扩增引物的浓度为200nm，淬灭探针的浓度为400nm，第一检测探针的浓度为200nm，第二检测探针的浓度为200nm，dntp的浓度为200μm，dna聚合酶的浓度为0.25u/μl。此处浓度下荧光变化更为明显，有利于snp基因分型检测。

48、进一步地，对cyp2c9基因的rs1057910突变位点进行snp基因分型检测时(野生型rna模板的核苷酸序列如seq id no.1所示，突变型rna模板的核苷酸序列如seq id no.2所示)，第一锁式探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，第二锁式探针的核苷酸序列如seqid no.4所示，滚环扩增引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，第一检测探针的核苷酸序列如seq id no.6所示，第二检测探针的核苷酸序列如seq id no.7所示，淬灭探针的核苷酸序列如seq id no.8所示。此处基于cyp2c9基因的rs1057910突变位点设计的所有引物和探针序列具有较好的特异性，可以用于cyp2c9基因的snp检测。