专利名称：用三磷酸尿苷和相关化合物治疗中耳炎的方法
背景技术：
本发明涉及通过给予特定的三磷酸尿苷、三磷酸腺苷或三磷酸胞苷消除或预防病人中耳中残留粘液分泌物的积聚。
背景技术：
中耳炎(OM)主要是，但不仅是，3岁以下的孩子的中耳病毒或细菌感染，其特征在于中耳中有充血液体存在，通常由于通过鼻咽和耳咽管扩散到中耳的呼吸道感染而突然发作。中耳炎的发病率在增长，年度因中耳炎而求医的从1975年到1990年增长了150％(L.McCraig和J.Hughes,JAMA273(3),214-19(1995))。这最可能是由于大组日托的孩子增加，在那里孩子暴露于更多的呼吸道病原体。每年约有25,000,000-40,000,000次就诊来诊断和治疗中耳炎，对于三岁的孩子，约75％孩子会患有至少一种急性中耳炎的疾病(最大的发病率在6-24个月)(J.Klein,Clin Infect Dis 19,823-33(1994))。从解剖学上来看，婴儿的耳咽管较短和较宽，位置比大孩子和成年人更为水平，这使病原体能容易地从鼻咽扩散到中耳(L.Schwartz和R.Brown,Arch Intern Med 152,2301-04(1992))。感染激发了耳咽管和中耳的粘膜组织的炎症反应，导致中耳中液体流出。所得的液体是粘稠的，并有脓，这使正常的粘膜纤毛运动变得困难，耳咽管在其最窄点峡部发生炎症，有效地阻滞液体排入鼻咽(J.Klein，同上(1994))。中耳充血预计会使病人有明显的疼痛、眩晕和听力的不可修复；由于液体积聚导致的听力丧失平均为25分贝。这对极幼小孩子极为重要，因为听力的不可修复会延误或严重地妨碍正常的认知发展，所述的认知发展需要依据于语言和社会交流(D.Teele等，J.Infect Dis 1621,685-94(1990))。中耳炎其它可能的后遗症(但不常见)包括乳突炎、脑膜炎、硬膜外脓肿、硬膜下积脓、大脑脓肿和侧静脉窦血栓症。
约80-90％中耳炎流出物在抗生素治疗后终于自然地解决；该过程可能长达三个月。但是，在充血液体用抗生素灭菌下由于粘液生成细胞持续分泌过多而使中耳充血可能持续数周甚至数月(S.Wintermeyer和M.Nahata,Annals ofPharmocotherapy 28,1089-99(1994))。尚不了解分泌过多状态的持续原因，但于未缓解的下面的耳咽管阻塞有关。妨碍治疗的再一个因素是，由于逐渐产生的细菌对抗生素的耐药性，抗生素疗法的效力在降低(M.Poole,Pediatr Infect Dis J.14(4),523-26(1995))。若中耳充血持续三个月以上，通常进行手术，插入鼓膜穿剌管以使病人的中耳通风(K.Grundfase,Arch Otolaryngol Head Neck Surg,120,797-98(1994))。鼓膜穿刺术目前是孩子中第二大常见的手术(包皮环切术第一)(J.Klein，同上(1994))。管子使液体流出耳朵，终于解决了大多数慢性病例中的该疾病。但是，手术费很昂贵(超过2000美元)，需要全身麻醉，这对于婴孩值得关注。此外，手术可能的后遗症(但不常见)包括持续耳液溢、鼓室膜永久地穿孔或疤痕以及珠光瘤(填充了角蛋白残片的囊肿样的囊，它使中耳闭塞并侵腐蚀周围结构)(J.Klein，同上(1995))。
这样，由于细菌耐药性和高费用及其与鼓膜穿刺术有关的危险使抗生素疗法的效果降低，结果医学研究者正在开发对该增加的流行病有效的其它疗法。法国生物技术公司，Laboratoires SYNTHELABO FRANCE，已经开发出治疗鼻粘膜液体充血的方法，其商品名为rhinATPTM，它使用了三磷酸腺苷(ATP)作为活性化合物。该技术得到美国专利5,420,116(申请人意在将该专利和其它专利参考文献和公开物并入本文供参考)。它们的治疗方法包括通过鼻喷雾剂或滴鼻剂对鼻腔给予ATP。如美国专利5,292,498所述，三磷酸尿苷(UTP)和三磷酸腺苷(ATP)已显示出对人体气道上皮细胞的离子转运活性起作用。具体的是，UTP和ATP诱导囊泡纤维化病人肺部上皮细胞分泌氯化物和水，帮助使高粘度气道表面的粘液(本疾病的特征)液化和容易转运。也已发现UTP和ATP刺激肺部上皮细胞的纤毛跳动频率，进一步使来自囊泡纤维化病人的肺部的粘液易于转运。参见R.Boucher等，腺苷和腺嘌呤核苷酸从分子生物学到一体化生理学，525-532页，题目为三磷酸尿苷在肺部的机理和治疗作用“(L.Belardinelli等编辑，AlumwerAcademic Publishers,美国波士顿1995)；也参见L.Gheber等，J.Membrane Biol.147,83-93(1995)。申请人已发现通过将UTP及其相关化合物和其它核苷酸磷酸盐，如5’-三磷酸腺苷(ATP)；5’-三磷酸胞苷(CTP)；1,N6-桥亚乙基腺苷三磷酸盐；腺苷1-氧化物三磷酸盐；3,N4-桥亚乙基胞苷三磷酸盐；P1,P4-二(腺苷-5’)四磷酸盐(A2P4)；或P1,p4-二(尿苷-5’)四磷酸盐(U2P4)给予液体阻滞位点可减轻中耳炎病人残留的中耳液体的高粘度。
UTP和其它核苷酸磷酸盐通过活化P2Y2嘌呤受体而诱导腔上皮细胞分泌氯化物和水。P2Y2受体是7个跨膜宽度家族，称为P2Y受体家族的G-蛋白偶合受体的部分。P2Y受体家族的多数膜，包括P2Y2与磷脂酶C(PLC)-肌醇三磷酸(IP3)的偶合途径(J.Simon等，Eur.J.Pharmacol.,291,281-289(1995)。最近研究显示在呼吸道上皮中的P2Y2嘌呤受体作用的试剂可改变氯离子的转运和其他因子影响粘膜纤毛对粘液分泌的清除(M.Knowles等，New Engl.J.Med.325,533-38(1991)；D.Drutz等，Drug Dev.Res.37,185(1996))。
由于UTP通过刺激呼吸道上皮组织中的P2Y2受体而显示了增强残留的粘液分泌的清除，故申请人积极地研究是否P2Y2受体在中耳和内耳的腔上皮中也同样表达。
发明综述本发明揭示了给需要治疗对象进行治疗中耳炎的方法。该方法包括对中耳炎对象给予式Ⅰ化合物，或其药学上可接受的盐，其用量为能有效地通过使中耳的粘液分泌物水化和通过增强中耳和促进耳咽管的纤毛颤动频率而使液体从中耳排干的量式Ⅰ
其中X1、X2和X3各自独立地是O-或S-。优选的X2和X3是O。
R1是O、亚酰氨基、亚甲基或二卤亚甲基(如二氯亚甲基、二氟亚甲基)。优选的R1是氧或二氟亚甲基。
R2是H或Br。优选的R2是H。特别好的式Ⅰ化合物是5’-三磷酸尿苷(UTP)和尿苷5’-O-(3-硫代三磷酸盐)(UTPγS)。
式Ⅰ是本发明化合物较适宜的技术方案，但是本发明方法也可包括给予式Ⅱ化合物(5’-三磷酸腺苷[ATP]或1,N6-桥亚乙基腺苷三磷酸盐或腺苷1-氧化物三磷酸盐)或式Ⅲ化合物(5’三磷酸胞苷[CTP]或3,N4-桥亚乙基胞苷三磷酸盐)，或式Ⅳ化合物(P1,P4-二(胞苷-5’)四磷酸盐(A2P4)或P1,P4二(尿苷-5’)四磷酸盐(U2P4)。式Ⅱ
其中R1、X1、X2和X3的定义与式Ⅰ中的相同。
当R2没有，N-1和C-6之间有双键(腺嘌呤)时，R3和R4是H，或当R2是O,N-1和C-6之间有双键(腺嘌呤1-氧化物)时，R3和R4是H，或连接在一起的R3、R4和R2是-CH=CH-,N-6和N-1与N-6和C-6之间的双键形成环(1,N6-桥亚乙基腺嘌呤)。
式Ⅲ
其中R1、X1、X2和X3的定义与式Ⅰ中的相同。
当R7没有，N-3和C-4之间有双键(胞嘧啶)时，R5和R6是H，或连接在一起的R5、R6和R7是-CH=CH-,N-3和N-4与N-3和C-4之间的双键形成环(3,N4-桥亚乙基胞嘧啶)。式Ⅳ
其中B是腺嘌呤或尿嘧啶。
本发明的第二方面是一种药物制剂，它在药物上可接受的载体中含有能有效地通过使中耳的粘液分泌物水化和通过增强中耳和耳咽管的纤毛颤动频率而使液体从中耳排出的量的式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ化合物。
本发明的第三方面是本文揭示的活性化合物在制备用于中耳粘液分泌物治疗性水化和病人中耳及其耳咽管纤毛颤动频率活化的药物中的用途。
特定的技术方案详述本发明可用于对为了任何理由而需要这类治疗的对象促进其从中耳和外耳排出充血的液体，包括(但不限于)中耳和外耳疾病，如中耳炎、急性中耳炎、持续流出液体的中耳炎、浆液中耳炎(由未解决的急性感染、过敏反应或如飞行时快速下降导致的气压伤引起)或外耳炎导致的残留的分泌物。本发明方法也可用来治疗内耳疾病，包括(但不限于)美尼尔氏症(Meniere)。包括通过使残留的分泌物水化和通过使中耳和耳咽管表面上的纤毛的颤动频率增强来排出中耳的粘液分泌物。粘液分泌物水化降低了它们的粘度，让它们能通过粘膜纤毛作用更容易地从中耳和耳咽管转运到鼻咽。另外，本发明加速了这样的粘膜纤毛作用，进一步使残留的中耳分泌物排入鼻咽。
本发明主要涉及治疗人体对象，但也可用于兽医，供治疗其它哺乳动物对象，如狗和猫。
上述式Ⅰ所示的化合物包括(a)5’-三磷酸尿苷(UTP)；(b)尿苷5’-O-(3-硫代三磷酸盐)(UTPγS)；和(c)5-溴-尿苷5’-三磷酸盐(5-BrUTP)。这些化合物是已知的或可用已知方法制备，或对本技术领域人员来说是很明显的其他方法。总的参见N.Cusack和S.Hourani,Annals N.Y.Acad.Sci.603,172-81(题目为“细胞外ATP”的生物学作用)。例如，UTP可用Kenner等在化学学会杂志(J.Chem.Soc.)1954,2288中所述的方法；或Hall和Khorana在美国化学学会杂志76,5056(1954)中所述的方法来制备。参见Merck Index，专著9795号(第11版1989)。UTPγS可用R.S.Goody和F.Eckstein在美国化学学会杂志93,6252(1971)中揭示的方法制备。
为了简化，本文式Ⅰ揭示了天然形成D构型的三磷酸尿苷活性化合物，但除非作特定说明，本发明也包括L构型化合物及其D和L构型化合物的混合物。天然形成的D构型化合物是优选的。
上述显示的式Ⅱ化合物包括(a)5’-三磷酸腺苷(ATP)和(b)1,N6-桥亚乙基腺苷三磷酸盐。上述式Ⅲ化合物包括(a)5’-三磷酸胞苷和(b)3,N4-桥亚乙基胞苷三磷酸盐。这些化合物可根据已知方法或对本技术领域人员来说很明显的其他方法来制备。例如，通过标准方法，如D.Hoard和D.Ott，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)87,1785-1788(1965)；M.Yoshikawa等，四面体(TetrahedronLett.)5065-68(1967)和idem.,Bull.Chem.Soc.(日本)42,3505-05(1969)；J.Moffatt和H.Khorana，美国化学学会杂志83,649-59(1961)；和B.Fischer等，药物化学杂志(J.Med.Chem.)36,3937-46(1993)所述的方法，在此并入供参考。胞苷和腺苷的桥亚乙基衍生物通过已知的方法制备，如N.Kotchetkov等四面体(TetrahedronLett.)1993(1971)；J.Barrio等，生物化学生物物理研究专栏(Biochem.Biophys.Res.Commun.)46,597(1972)；J.Secrist等，生物化学(Biochemistry)11,3499(1972)；J.Bierndt等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)5,789(1978)；K.Koyasuga-Mikado等Chem.Pharm.Bull.(东京)28,932(1980)。具有α、β和γ的硫代磷基团可通过下列方法或合适的方法来衍生J.Ludwig和F.Eckstein，有机化学杂志(J.Org.Chem.)54,631-35(1989)；F.Eckstein和R.Goody，生物化学(Biochemistry)15,1685(1976)；R.Goody和F.Eckstein，美国化学学会杂志93,6252(1971)。
R1是CCl2和CF2的式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ化合物的用与G.Blackburn等，J.Chem.Soc.Perkin Trans.I,1119-25(1984)所述的相似方法来制备。用与T.Myers等，J.Am.Chem.Soc.85,3292-95(1963)所述的相似方法来制备R1是CH2的式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ化合物。
式Ⅳ化合物包括P1,P4-二(腺苷-5’)四磷酸盐(A2P4)或P1,P4-二(尿苷-5’)四磷酸(U2P4)。这些化合物可根据下述的已知方法或其变体进行制备P.Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,838-42(1981)；和K.Ng和L.E.Orgel，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15(8),3572-80(1987)。
另外，UTP、ATP、CTP、A2P4、3,N4-桥亚乙基胞苷三磷酸盐、1,N6-桥亚乙基腺苷三磷酸盐、腺苷1-氧化物三磷酸盐、ATPγS、ATPβS、ATPαS、AMPPCH2P、AMPPNHP、N4-桥亚乙基胞苷和1,N6-桥亚乙基腺苷是市售的，如可从Sigma Chemical Company(美国)PO Box 14508,St.Louis,MO63178购得。
式Ⅰ-Ⅳ活性化合物可以本身的形式给予或以它们的药学上可接受的盐，如钠盐或钾盐等的碱金属盐、如锰盐、镁盐和钙盐等的碱土金属盐或铵盐和四烷基铵盐(NX4+)的形式给予。药学上可接受的盐是保留了母体化合物所需的生物活性，且没有不良的毒理作用。
本文揭示的活性化合物可通过各种合适的方法，优选地是给予由活性化合物构成的液体/液体悬浮液(可让给药对象吸入颗粒的鼻喷雾剂或液体制剂的鼻滴剂)给予病人的中耳以促进中耳中的液体排干。通过用本技术领域人员公知的技术使活性化合物与合适的赋形剂，如灭菌无热源水或灭菌盐水混合来制备生产鼻喷雾剂或鼻滴剂用的活性化合物的液体药物组合物。
促进液体排干的活性化合物剂量根据被治疗的疾病和给药对象的状态而定，但一般来说有效量是使对象中耳表面的活性化合物的浓度达到约10-7-10-2摩尔/升，更好的是约10-6到约3×10-4摩尔/升浓度的量。
根据给予的活性化合物特定制剂的溶解度，促进液体排干的每天剂量可划分为一次单位剂量或多次单位剂量给予。优选的是，每天剂量不超过两次/天。
将活性化合物给予病人中耳以促进液体排干的另一个方法包括给予活性化合物的口服剂型，通过活性化合物的液体悬浮剂倒人病人口中或通过丸剂给病人吞服给予。
另一个对中耳和内耳给予有效量活性化合物的方法涉及让病人将雾化形式的活性化合物吸入呼吸道，这样活性化合物进入耳咽管，接着进入病人的内耳和中耳。
另一个对中耳给予活性化合物的方法包括活性化合物的局部给药剂型，如以霜剂或凝胶剂给予外耳，接着通过鼓室膜渗透入病人的中耳。
另一个对中耳给予活性化合物的方法涉及活性化合物的注射剂型，从外耳经鼓室膜直接注入中耳，或经上颈区域简接地注入中耳。
另一个对中耳给予活性化合物的方法涉及活性化合物的栓剂，结果治疗有效量的化合物经全身吸收到达中耳。
给予活性化合物的另一个方法涉及通过活性化合物的凝胶、霜剂或液体悬浮剂将活性化合物腔内操作滴入中耳、内耳或外耳，这样治疗有效量化合物到达了中耳、内耳或外耳。
UTP和式Ⅰ-Ⅳ化合物与用于治疗中耳炎的其它药物合用时也有治疗效果，所述的药物是，但不限于如青霉素、青霉素+β-内酰胺、红霉素+sulisoxazole、ephalosporin、甲氧苄啶、甲氧苄啶+磺胺甲噁唑、大环内酯类和噁唑烷二酮的抗生素；疫苗；抗组胺药，减轻充血药，粘液溶解药；非甾族抗炎药；和皮质类固醇。UTP也可于开发中的药物，如NE-1530-a天然形成的气道低聚糖(NeoseTechnologies,Inc.)和基因疗法共用。
下列实施例更详尽地解释了本发明。这些实施例仅供阐述，不用于限定。
实验实施例1在人体耳咽管里P2Y2的表达在人体耳咽管上皮片断进行P2Y2受体的mRNA的分析。该过程采用L.Burch等，Am.J.Physiol.,269(2),C511-C518(1995)所述的方法。冷冻片断(8微米)在载玻片上制作标本，用4％多聚甲醛在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中固定2小时。固定后，载玻片在PBS中淋洗两次，脱水，空气干燥，在-80℃下贮存到使用。杂交前处理包括蛋白酶K消化，然后乙酰化。RNase对照片断用200毫克/毫升RN酶A处理。在54℃下含系列片断的载玻片在含106技术/分钟反向或正向母板的杂交缓冲液中杂交过夜。在体外转录系统中用Ambion MAXIscript合成35S-UTP-标记的RNA母板。杂交后，载玻片在室温下的4×SSC内洗涤，然后在RNase消化(20毫克/毫升)内，接着在室温下的2×SSC/1mM二硫苏糖醇(DTT)内和在54℃下0.5×SSC/1mMDTT的高强度(high-stringency)下洗涤(3×15分钟)然后进行乙醇脱水。干燥的载玻片浸在用0.6M乙酸铵稀释的柯达NTB2照相乳液中(1∶1)。让载玻片以1.5到2.5wk间隔显影，用苏木精和曙红复染色。
图1
图2
图1是用600bp反向母板人体P2Y2受体的原地杂交。图2是，作为对照，用600bp反向母板对人体P2Y2的原地杂交。反向和正向母板的比较表明耳咽管中的P2Y2受体表达组成的反向母板具有更强的发射自显照相信号。
权利要求
1．一种治疗需要治疗的对象的中耳炎的方法，其特征在于所述的方法包括对中耳炎对象给予式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ化合物，或其药学上可接受的盐，在药物载体中其用量为能有效地促使液体从中耳排出的量式Ⅰ
其中X1、X2和X3各自独立地选自OH或SH；R1选自O、亚酰氨基、亚甲基和二卤亚甲基R2选自H和Br；式Ⅱ
其中R1、X1、X2和X3的定义与式Ⅰ中的相同。当R2没有，N-1和C-6之间有双键(腺嘌呤)时，R3和R4是H，或当R2是O,N-1和C-6之间有双键(腺嘌呤1-氧化物)时，R3和R4是H，或连接在一起的R3、R4和R2是-CH=CH-,N-6和N-1与N-6和C-6之间的双键形成环(1,N6-桥亚乙基腺嘌呤)。式Ⅲ
其中R1、X1、X2和X3的定义与式Ⅰ中的相同。当R7没有，N-3和C-4之间有双键(胞嘧啶)时，R5和R6是H，或连接在一起的R5、R6和R7是-CH=CH-,N-3和N-4与N-3和C-4之间的双键形成环(3,N4-桥亚乙基胞嘧啶)。式Ⅳ
其中B是腺嘌呤或尿嘧啶。
2．根据权利要求1所述的方法，其中所述的化合物通过给予所述化合物的液体/液体悬浮液，包括鼻滴剂或喷雾剂释放到所述对象的鼻咽气道，结果治疗有效量的所述化合物可直接地，或通过全身吸收和循环与所述对象的耳咽管或中耳接触。
3．根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物通过口服形式使所述化合物释放到所述对象的中耳，这样治疗有效量的所述化合物通过全身吸收和循环与所述对象的耳咽管或中耳接触。
4．根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物通过给予所述化合物的气雾剂悬浮液释放到所述对象的鼻咽气道，这样治疗有效量的所述化合物与所述对象的耳咽管或中耳接触。
5．根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物通过局部给药形式将所述化合物通过所述对象的鼓膜释放到中耳，这样治疗有效量的所述化合物与所述对象的耳咽管或中耳接触。
6．根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物通过注射给药释放所述化合物，这样治疗有效量的所述化合物与所述对象的耳咽管或中耳接触。
7．根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物通过所述化合物的栓剂形式给药释放，这样治疗有效量的所述化合物通过全身吸收和循环与所述对象的耳咽管或中耳接触。
8．根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物以足以使所述对象的中耳或耳咽管表面的浓度达到约10-7到约10-2摩尔/升的量给予。
9．根据权利要求1所述的方法，其中X2和X3是OH。
10．根据权利要求1所述的方法，其中R1是氧。
11．根据权利要求1所述的方法，其中R2是H。
12．根据权利要求1所述的方法，其中所述式Ⅰ化合物选自5’-三尿苷磷酸、尿苷5’-O-(3-硫代三磷酸盐)、5-溴-尿苷5’-三磷酸盐及其药学上可接受的盐。
13．根据权利要求1所述的方法，其中所述式Ⅱ化合物选自5’-三腺苷磷酸、1,N6-桥亚乙基腺苷三磷酸盐、腺苷1-氧化物三磷酸盐及其药学上可接受的盐。
14．根据权利要求1所述的方法，其中所述式Ⅲ化合物选自5’-三磷酸胞苷(CTP)、3,N4-桥亚乙基胞苷三磷酸盐及其药学上可接受的盐。
15．根据权利要求1所述的方法，其中所述式Ⅳ化合物选自P1,P4-二(胞苷-5’)四磷酸盐(A2P4)和P1,P4二(尿苷-5’)四磷酸盐(U2P4)及其药学上可接受的盐。
全文摘要
本发明揭示了一种对需要治疗对象的充血的中耳促进液体排出的方法。该方法包括给对象的中耳使用诸如5’－三磷酸尿苷(UTP)的UTP类似物或其它类似物的三磷酸尿苷,其用量为能通过使中耳粘液分泌物水化或同时刺激中耳或耳咽管中纤毛的颤动频率来有效地促进充血的中耳液体排出的用量。该方法用来治疗患有中耳炎和其它中耳疾病、外耳炎和内耳疾病,包括美尼尔氏症(Meniere)疾病的病人。本发明也揭示了药物制剂及其制备方法。给药方法包括给予任何液体悬浮液(包括滴鼻剂或喷雾剂)口服剂、鼻吸入剂、局部给药、注射或栓剂。
文档编号B65B43/26GK1211186SQ97192262
公开日1999年3月17日 申请日期1997年2月14日 优先权日1996年2月21日
发明者D·J·德鲁兹, J·L·赖德奥特, K·M·雅各布斯 申请人:印斯拜尔药品股份有限公司