一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测的制作方法
【专利摘要】本发明公开一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测。本发明通过构建尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶（UXS6）基因与表达载体pEGX-4T-2的重组质粒，导入到细菌中进行原核表达，将UXS6蛋白与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸反应后用高效液相色谱仪进行功能检测，并测定该酶在不同温度及不同pH值下酶活性反应的最适条件。本发明通过将重组质粒浸染烟草，进行过表达，进一步探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶在植物中的作用。由于反应后生成尿苷二磷酸木糖，是半纤维素木聚糖的底物，在工业上具有重要的应用价值。本发明为工业需求提供了一种人为的可靠的途径，可根据现实需要沉默或过表达植物中葡萄糖醛酸基因，从而获得最大的经济效益。
【专利说明】一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测
【技术领域】
[0001]本发明属于生物分析领域，具体涉及一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶(UDP-Glucuronic acid decarboxylase, UXS)基因的功能检测。
【背景技术】
[0002]半纤维素木聚糖(Xylan)是植物中仅次于纤维素的重要组成成分，其合成的重要底物是尿苷二磷酸木糖(UDP-Xylose)。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶(UXS)可以不可逆催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(M)P-GlcA)脱羧产生尿苷二磷酸木糖(UDP-Xylose，UDP-Xyl)。因而UXS可能在植物木聚糖的合成中起重要作用。另外，UXS酶还可以应用在与食品、药品紧密相关的木糖醇和低聚木糖的开发上。
[0003]目前为止，还没有UXS基因在植物体内的功能报道，其原因可能是由于UXS基因为一个家族基因，有冗余现象，较难分析了它们对植物生长发育的影响，另一个原因是没有找到可行的方法来分析它们在体内的活性。
[0004]UXS6基因是UXS基因家族成员之一，至今还未见UXS6基因的克隆及原核表达的报道。而目前并无类似这种基因在植物体内中的功能报道，也没有任何有关UXS基因家族抗体检测的报道。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技 术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶(UXS6)基因的功能检测。本发明通过对USX6基因进行克隆，并构建重组质粒，进行原核表达，探讨其功能。然后再定位到植物当中，进一步探讨USX6基因在植物中的表达及其功能检测。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶(UXS6)基因的功能检测，包括如下步骤:
[0007]对USX6基因进行克隆，并构建重组质粒，进行原核表达，在体外探讨其功能；然后再过量表达到植物中，进一步探讨USX6基因在植物中的表达及其功能。
[0008]所述的植物优选为烟草；
[0009]所述的UXS6基因的功能检测,具体包括如下步骤:
[0010]①克隆USX6基因，并构建重组质粒pGEX-4T-2-UXS6 ;将重组质粒pGEX-4T-2_UXS6导入大肠杆菌BL21感受态细胞中进行表达，收集表达产物，并对其进行纯化、浓缩，得到UXS6蛋白；并进行SDS-PAGE分析；将UXS6蛋白注入到小鼠体内，并抽取腹水，离心后吸取上清获得抗体；并进行Western-blot检测；
[0011]②将步骤①获得的UXS6蛋白与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸反应，反应产物进行高效液相色谱分析，并以GST蛋白为对照；
[0012]③以获得的cDNA为模板，并设计带有Gateway位点的引物(横线部分为同源重组序列):UXS6-F2:5' ~GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGTCTAATTCTTCTAACGG~3/ ；UXS6-R2:5 , -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTCTTCGGAACACCAAGCCTTAG-3 ,；进行PCR扩增，将所得片段与PD0NR207进行BP反应，得到重组质粒pD0NR207_UXS6，将重组质粒pD0NR207-UXS6进行测序，于_20°C保存测序正确质粒；将重组质粒pD0NR207_UXS6与双元载体pEarleylOl进行LR反应，转入至双元载体pEarleylOl中，得到重组质粒pEarleyl01-p35S::UXS6,测序正确后提取质粒；
[0013]④将步骤③中的重组质粒pEarleyl01_p35S::UXS6导入到农杆菌中，用转化成功的农杆菌浸染烟草，进行过量表达，将其过表达产物进行Western-blot检测；
[0014]⑤从Columbia野生型拟南芥的根，茎上部，茎中部，茎下部，幼苗，叶子，花蕾，果荚中提取RNA，反转录成cDNA，再进行PCR，测定UXS6在各个组织部位的表达水平；
[0015]⑥从步骤④中的农杆菌浸染的烟草中提取总蛋白，并提取未转化的烟草中的总蛋白做空白对照；
[0016]⑦将步骤⑥中的总蛋白分别进行超滤后，与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸反应，将其反应产物用高效液相色谱检测；
[0017]⑧将步 骤①中得到的UXS6蛋白，与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸反应，分别测定在不同温度和不同PH值对酶活性的影响；将其反应产物用高效液相色谱检测。
[0018]所述的烟草优选为本氏烟(Nicotiana benthamiana),且不限于该品种；
[0019]步骤①中所述的纯化优选通过GST标签纯化树脂柱进行纯化，除去多余的杂质；所述的浓缩优选为用截留分子量为IOKDa的超滤管进行浓缩，以免蛋白损失；
[0020]步骤①中所述的将UXS6蛋白注入到小鼠体内，并抽取腹水优选是将5~6mg UXS6蛋白分4次注入到8~12周龄小鼠体内，25~28天后抽取腹水；
[0021]所述的分4次优选为在第1次注射6~7天后注射第2次，之后每一周后注射一次，共四次；
[0022]步骤①中所述的离心的条件优选为室温，3, OOOg离心30s~Imin ；
[0023]步骤①和④中所述的Western-blot检测所用的一抗为步骤①中获得的抗体；
[0024]所述的农杆菌优选为土壤农杆菌C58 ；
[0025]步骤②、⑥和⑧中所述的高效液相色谱，其中，高效液相色谱的色谱柱为C0SM0SIL5C18-AR-1I，流动相A为20mM乙酸三乙胺(pH=7.0)，流动相B为含有10% (v/v)乙腈的20mM乙酸三乙胺(pH=7.0);分析条件为用100% (v/v)流动相A冲洗柱子10分钟，然后以每分钟上升1% (v/v)的浓度上升流动相B的浓度(在整个冲洗过程中，流动相是由流动相A和流动相B组成，刚开始冲洗是流动相A占据总量的100% (v/v),没有流动相B，随着时间的延长，以1%的体积分数的速度增加流动相B的用量，同时以1%的速度降低流动相A的用量，最终流动相A占85% (v/v)，流动相B占15% (v/v))，冲洗15min ；
[0026]步骤②和⑦所述的反应的条件优选为室温反应2~5h ;
[0027]步骤⑧中所述的测定在不同温度对酶活性的影响的条件分别优选为在0°C、10°C、20°C、30°C、40°C、50°C和60°C水浴中反应25~35min，更优选为反应30min ；
[0028]步骤⑧中所述的测定在不同pH值对酶活性的影响的条件分别优选为在pH为2、3、
4、5、6、7、8、9、10和11下30°C水浴反应25~35min，更优选为反应30min。
[0029]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果:
[0030](I) UXS6基因是UXS基因家族成员之一，研究UXS6基因的克隆及原核表达、蛋白纯化、酶活分析有利于分析该基因产物的体外功能。利用烟草过量表达，可以帮助我们分析UXS6基因在植物体内的功能。对这个UXS家族基因的功能以及进一步了解木聚糖的合成起至关重要的作用。
[0031](2)本发明提供了一整套从UXS6克隆到原核表达活性检测以及在烟草中过量表达的活性利用高效液相色谱(HPLC)检测的技术以及方法。本发明可填补UXS6基因在植物中功能研究领域的空白，提供了一个UXS6基因的克隆及其产物的功能检测方法以及不同温度和不同PH值对酶反应活性的影响的测定方法。
[0032](3)本发明制备了 UXS6蛋白的抗体，国内外目前还没有这个家族基因的任何抗体报道，而利用这个抗体可以用于检测植物体内UXS蛋白的表达及木聚糖的合成等功能分析，也为分析尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因在植物体内的功能提供应用价值。
[0033]本发明通过将重组质粒浸染烟草，进行过表达，进一步探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶在植物中的作用。由于反应后生成尿苷二磷酸木糖，而木糖是植物细胞壁生长所不可或缺的成分，是半纤维素木聚糖的底物，在工业上具有重要的应用价值。本发明为工业需求提供了一种人为的可靠的途径，可根据我们现实需要沉默或过表达植物中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因(UXS)，从而获得最大的经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为pGEX-4T-2-UXS6重组载体的序列比对图。
[0035]图2为原核表达的UXS6蛋白的SDS-PAGE检测图，其中，泳道Marker为250KD的双色Marker ;泳道I为诱导原 核表达之前菌体提取物；泳道2为诱导表达4h后的提取物；泳道3为诱导4h后的提取物的纯化物。
[0036]图3为UXS6基因原核表达产物Western-blot检测图。
[0037]图4为UXS6基因在植物中过表达产物的Western-blot检测图。
[0038]图5为UXS6基因在植物各个组织的表达谱分析图。
[0039]图6为从上至下依次为UDP-Xylose和UDP-GlcA的Mix图，UDP-GlcA的单标图，UDP-Xylose的单标图。
[0040]图7为UXS6基因原核表达产物的反应产物经HPLC检测图。
[0041]图8为UXS6基因在植物中过表达产物的反应产物经HPLC检测图。
[0042]图9为不同温度对原核表达的UXS6酶活性影响。
[0043]图10为不同pH对原核表达的UXS6酶活性影响。
【具体实施方式】
[0044]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0045]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0046]实施例1:UXS6基因的克隆
[0047](I)从Tair网站查询得到拟南芥UXS6基因(登录号:AT2G28760.1)的核苷酸序列，设计引物，如下:
[0048]UXS6-F1:5/ -CCCTCGAGGGATGGCGTCTAATTCTTCTAACGG-3;(横线部分为 Xho I 酶切位点)；
[0049]UXS6-R1:5/ -CGGAATTCCGTTACTTCTTCGGAACACCAAGCC-3;(横线部分为 EcoR I 酶切位点)；
[0050]提取Columbia野生型拟南芥(购自美国拟南芥研究中心，ArabidopsisBiological Resource Center, Ohio State University, USA ;SALK)颈部的总 RNA,反转录成cDNA (反转录的反应体系为:总RNA2yg，Oligo (dT) I μ L，酶0.5 μ L，RNA酶抑制剂
0.5μ L，dNTP2y L，加 ddH20 至总体系为 20 μ L ;反应条件为:37°C 15min ；85°C 5s);引物合成在中美泰和生物技术(北京)有限公司进行。
[0051](2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，用步骤(1)中的引物进行PCR扩增，得到UXS6 基因。PCR 扩增的反应体系为:cDNA3 μ L, 10 X buffer5 μ L, LA Taq0.5 μ L, dNTP8 μ L,UXS6-F11 μ L，UXS6-R11 μ L，32.5μ L ddH20，共 50μ L ;反应程序为:95°C 预变性 3min ；95°C变性30s ;50°C退火25s，72°C延伸50s, 36个循环；72°C延伸IOmin0
[0052](3)用Xho I (购自Takara公司)对步骤(2)中得到的UXS6基因和质粒载体PGEX-4T-2 (购自Invivogen公司)分别进行单酶切(反应体系为:PCR扩增产物IOyL或者质粒载体 5yL，3yL Xho I, IOXH BufferlO μ L，加 ddH20 至总体积为 50 μ L ; )，37°C 酶切
2.5h后纯化；再用EcoR I (购自Takara公司)对纯化回收的UXS6基因和载体pGEX_4T_2分别进行单酶切(反应体系为:纯化回收的UXS6基因10 μ L或者纯化回收的载体5 μ L，3 μ LEcoR I ,IOXH BufferlOy L，加 ddH20 至总体积为 50μ L ; )，37°C 酶切 2.5h 后再纯化；将再纯化回收后的片段UXS6与载体片段pGEX-4T-2用T4连接酶(反应体系和反应条件按说明书操作)连接，16°C连接过夜，得到连接产物；
[0053](4)将步骤(3)中得到的连接产物热激法转化到大肠杆菌DH5ci感受态细胞(购自上海鼎国生物技术有限公司)中；接着涂布于含有氨苄青霉素(AMP)和X-gal的LB培养基平板上，37°C培养16h后，挑取白色菌落，用步骤(1)中的引物进行菌落PCR验证，对PCR (用引物对UXS6-F1/R1)验证为阳性的菌落提取质粒，将该阳性重组质粒命名为PGEX-4T-2-UXS6，并进行测序；测序在中美泰和生物技术(北京)有限公司进行；通过序列比对(如图1所示)证实构建的重组质粒为pGEX-4T-2-UXS6。
[0054](5)测序结果成功；得到UXS6基因的编码核苷酸序列，如下所示:
【权利要求】
1.一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测，其特征在于包括如下步骤: 对USX6基因进行克隆，并构建重组质粒，进行原核表达，在体外探讨其功能；然后再过量表达到植物中，进一步探讨USX6基因在植物中的表达及其功能。
2.根据权利要求1所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测，其特征在于:所述的植物为烟草。
3.根据权利要求1所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测，其特征在于:所述的UXS6基因的功能检测，具体包括如下步骤: ①克隆USX6基因，并构建重组质粒pGEX-4T-2-UXS6;将重组质粒pGEX-4T-2_UXS6导入大肠杆菌BL21感受态细胞中进行表达，收集表达产物，并对其进行纯化、浓缩，得到UXS6蛋白；并进行SDS-PAGE分析；将UXS6蛋白注入到小鼠体内，并抽取腹水，离心后吸取上清获得抗体；并进行Western-blot检测； ②将步骤①获得的UXS6蛋白与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸反应，反应产物进行高效液相色谱分析，并以GST蛋白为对照； ③以获得的cDNA为模板，并设计带有Gateway位点的引物，其中，横线部分为同源重组序列:UXS6-F2:5' ~GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGTCTAATTCTTCTAACGG~3/ ；UXS6-R2:5 ' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTCTTCGGAACACCAAGCCTTAG-3 '；进行PCR扩增，将所得片段与PD0NR207进行BP反应，得到重组质粒pD0NR207_UXS6，将重组质粒pD0NR207-UXS6进行测序，于_20°C保存测序正确质粒；将重组质粒pD0NR207_UXS6与双元载体pEarleylOl进行LR反应，转入至双元载体pEarleylOl中，得到重组质粒pEarleyl01-p35S::UXS6,测序正确后提取质粒； ④将步骤③中的重组质粒pEarleyl01-p35S::UXS6导入到农杆菌中，用转化成功的农杆菌浸染烟草，进行过量表达，将其过表达产物进行Western-blot检测； ⑤从Columbia野生型拟南芥的根，茎上部，茎中部，茎下部，幼苗，叶子，花蕾，果荚中提取RNA，反转录成cDNA，再进行PCR，测定UXS6在各个组织部位的表达水平； ⑥从步骤④中的农杆菌浸染的烟草中提取总蛋白，并提取未转化的烟草中的总蛋白做空白对照； ⑦将步骤⑥中的总蛋白分别进行超滤后，与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸反应，将其反应产物用高效液相色谱检测； ⑧将步骤①中得到的UXS6蛋白，与尿苷二磷酸葡萄糖醛酸反应，分别测定在不同温度和不同PH值对酶活性的影响；将其反应产物用高效液相色谱检测。
4.根据权利要求3所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测，其特征在于:所述的烟草为本氏烟。
5.根据权利要求3所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测，其特征在于:步骤①中所述的将UXS6蛋白注入到小鼠体内，并抽取腹水是将5~6mg UXS6蛋白分4次注入到8~12周龄小鼠体内，25~28天后抽取腹水。
6.根据权利要求5所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测，其特征在于:所述的分4次为在第1次注射6~7天后注射第2次，之后每一周后注射一次，共四次。
7.根据权利要求3所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测，其特征在于:步骤①中所述的纯化通过GST标签纯化树脂柱进行纯化；所述的浓缩为用截留分子量为IOKDa的超滤管进行浓缩； 步骤①中所述的离心的条件为室温，3，OOOg离心30s~Imin ； 步骤①和④中所述的Western-blot检测所用的一抗为步骤①中获得的抗体； 所述的农杆菌为土壤农杆菌C58 ； 步骤②和⑦所述的反应的条件为室温反应2~5h。
8.根据权利要求3所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测，其特征在于:步骤⑧中所述的测定在不同温度对酶活性的影响的条件分别为在0°C、10°C、2(TC、30°C、40°C、50°C和 60°C水浴中反应 25 ~35min ； 步骤⑧中所述的测定在不同pH值对酶活性的影响的条件分别为在pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10和11下30°C水浴反应25~35min。
9.根据权利要求3所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测，其特征在于:步骤②、⑥和⑧中所述的高效液相色谱，其中，高效液相色谱的色谱柱为C0SM0SIL5C18-AR-1I，流动相A为pH=7.0的20mM乙酸三乙胺，流动相B为pH=7.0的含有10%乙腈的20mM乙酸三乙胺；分析条件为用100%流动相A冲洗柱子10分钟，然后以每分钟上升1%的浓度上升流动相B的浓度，冲洗15min。
10.根据权利要求9所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测，其特征在于:所述的分析条件为在整个冲洗过程中，流动相是由流动相A和流动相B组成，刚开始冲洗是流动相A占据总量的100%，没有流动相B，随着时间的延长，以1%的体积分数的速度增加流动相B的用量，同时以1%的速度降低流动相A的用量，最终流动相A占85%，流动相B占 15%。
【文档编号】G01N33/573GK103952473SQ201410120185
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】吴蔼民, 周纯, 匡倍庆, 樊晶, 倪春旭, 付浩洋 申请人:华南农业大学