专利名称：：喹诺酮类抗生素多残留酶联免疫检测方法
技术领域：
：喹诺酮类抗生素多残留酶联免疫检测方法，具体的说是用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测动物性食品中喹诺酮类抗生素的残留。属于抗生素残留检测方法
技术领域：
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背景技术：
：喹诺酮是一类合成抗生素类药物，在化学上与萘啶酮酸相关，其作用机理是直接作用于细菌的核、抑制细菌的DNA旋转酶，使酶不能在DNA双链上引入切口，破坏细菌的代谢和繁殖，迅速杀灭细菌。最初这类药物用于治疗尿道感染，现在已发展到治疗系统感染疾病，并且在动物饲养中作为预防和治疗药物普遍使用。近年来，这些药物在动物组织中的残留己引起广泛的注意。联合国粮农组织、世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量。喹诺酮类药物各种残留分析方法，主要包括高效液相法(HPLC)以及与此相关的HPLC—UV、HPLC—FD、HPLC—DVD、LC—MS/MS，LC一ESI-MS/MS，另外还有荧光光谱法、毛细管电泳法等。LesleyJohnston等用HPLC-MS(Massspectrometer)法检测鱼类和海产品中的喹诺酮类和氟喹诺酮类药物的残留，所有被分析物均获得很好的回收率，检测极限达到l3mg/kg。GeryvanVyncht等用LC-ESI-MS-MS法检测猪肾中的11种喹诺酮类药物。尽管这些方法灵敏度较高，但样品的前处理步骤较多，相对费时且检测费用较高，特别是不适用于大量样品的筛选。酶联免疫吸附测定法(ELISA)提供了一种痕量氯菊酯的快速、灵敏、选择性检测方法。王战辉选择四种喹诺酮类药物做为半抗原，采用混合酸酐法直接和BSA相偶联合成免疫原，活化酯法合成包被原，通过筛选，以CIP为半抗原的单克隆抗体识别多种QNs，其中对DIF和SAR的交叉反应率低于3。/。，对其他12中药物QNs均高于29y。。但是上述方法要求使用单克隆抗体，单克隆抗体制备过程复杂，价格昂贵，不宣普及。目前还缺少切实可行的动物性食品中喹诺酮类抗生素多残留的检测方法。
发明内容本发明的目的是建立了动物性食品中的喹诺酮类抗生素的多残留ELISA检测方法，为喹诺酮类抗生素在动物性食品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。检测限(IC9o)为0.0126ng/mL、半数抑制量(ICso)为0.54ng/mL和检测范围(;10:2()1(^8())为0.0446714ng/mL。此外，还从方法的特异性、准确性、灵敏度来评估了本ELISA方法。回收率分别是63%95%，变异系数小于20%。除与5种喹诺酮类药物(QNs)的交叉反应低于5%外，其余13种QNs分别在16%和112%之间。符合多残留ELISA方法检测的要求。本发明的技术方案一种喹诺酮类抗生素多残留酶联免疫检测方法，利用合成的喹诺酮类抗生素多簇抗原免疫得到多克隆抗体(李雅丽，胥传来，王灿辉中国专利200710134500.4)，以喹诺酮类抗生素半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物作为包被抗原，以喹诺酮类抗生素为标准品，建立动物性食品中的喹诺酮类抗生素的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下(1)以9%的生理盐水稀释包被抗原1:1001:200作为包被液，加入酶标板中，每孔加入100pL，4'C孵育过夜，按照常规ELISA方法洗涤封闭；(2)将多克隆抗体以抗体稀释液按1:1001:200比例稀释后，加入酶标板中，每孔加35pL;同时每孔分别加入用标准品稀释液稀释的0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL—系列浓度之一的喹诺酮类抗生素标准品或者添加待测样品，每孔加65pL，37°C孵育lh后以PBST洗涤液洗涤3~5次；(3)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，以抗体稀释液按1:廳01:3000比例稀释，每孔加脚L，37。C孵育lh后以PBST洗涤液洗涤35次；(4)配制显色液A液配方为每100mL水中加入0.933g柠檬酸，3.68gNa2HP04'12H20，18|iL30%H2O2;B液配方为60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇；使用前将A液与B液以4:1体积混合；(5)每孔加入显色液lOO(iL，37。C显色15min;每孔加入终止液2M硫酸溶液100(iL，酶标仪450nm测吸光值0D。待测样品为动物性食品的提取方法为(1)以1ng/g样品和5ng/g样品的水平的喹诺酮类抗生素加入阴性样品，在室温下至少静置15min;(2)取2g已经搅碎的样品，加于2550mL离心管中，再加入10mL乙酸乙酯-PBS体积比1:1的混合液，然后用匀浆器匀浆，涡旋混合后超声提取30min，3500rpm/min离心10mm;(3)移取上层有机层到另一新的带帽试管中，在6070。C的热水浴中，一边用氮气吹干(注意在下层呈碱性的水相中含有高浓度的盐将会对检测反应造成严重污染。故而在移取上层有机层时，不要吸取到下层水相)。(4)加入lmLPBS溶液溶解后待用(注意对有些样品来说，也许会出现沉淀或混浊液体。在加样前，可将其离心35分钟。或加热)。更详细的步骤为1)配制磷酸盐(PBS)缓冲液Na2HP04.12H203.12g，NaH2P04.2H201.76g，加水100mL。2)配置PBST溶液含0.05%Tween-20的PBS溶液。3)配制OVA/生理盐水封闭液称取O.lgOVA溶解于lOOmL生理盐水配制成0.1%的OVA/生理盐水封闭液。4)配置抗体稀释液含0.iy。OVA的PBST溶液。5)合成包被抗原(诺氟沙星半抗原与卵清蛋白OVA偶联物)。6)以9°/。生理盐水稀释包被抗原l:100l:200，加入酶标板中，每孔100&。4°C孵育过夜。7)甩去包被抗原液后，以PBST、洗涤2遍，加入OVA/生理盐水封闭液，每孔脚L，37。C温育2h。8)甩去酶标板中的封闭液，用PBST洗涤两遍，每次23分钟。9)将抗血清用抗体稀释液稀释1:1001:200后，每孔35pL加入酶标板中，同时加入一系列浓度的喹诺酮类抗生素标准品，每孔65pL。37t:孵育lh后以PBST洗涤35次。10)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(GAR—HRP)，以抗体稀释液稀释为1:10001:3000。每孔100|aL。37。C作用lh后以PBST洗涤35次。11)配置显色液A液配方为每100mL水中加入0.933g柠檬酸，3.68gNa2HP04'12H20，18|aL30%H2O2;B液配方为60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇；使用前将A与B以4:1体积混合。12)加入显色液每孔1C%iL，37'C显色15min。13)加入终止液2MH2SO;，酶标仪450nm测吸光值(OD)。本发明的有益效果以诺氟沙星半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了动物性食品中喹诺酮类抗生素的间接ELISA方法，为喹诺酮类抗生素在动物性食品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好。检测限(IC9。)为0.0126ng/mL、半数抑制量(IC5。)为0.54ng/mL和检测范围(IC2oIC8o)为0.0446714ng/mL。此外，还从方法的特异性、准确性、灵敏度来评估了本ELISA方法。回收率分别是63%95%，变异系数小于20%。除与5种QNs的交叉反应低于5%外，其余13种QNs分别在16%和112%之间。符合多残留ELISA方法检测的要求。图l诺氟沙星的标准抑制曲线。具体实施方案以下通过实施例进一步说明本发明。一、仪器TGL—40B台式低速离心机上海安亭科学仪器厂；KFLO纯水机凯佛隆公司；ZD-9556水平摇床太仓科教器材厂；Costar96孔8x12可拆酶标板上海吉泰生物科技有限公司；MuLtiskaMks酶标仪ThermoLabsystems公司；可调试移液器ThermoLabsystems公司，匀质器Fluka公司；涡旋混合器上海沪西仪器分析。二、试剂辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)康成生物工程公司；四甲基联苯胺(TMB)华美生物工程公司；其他试剂均为分析纯试剂。三、步骤1.免疫原和包被原的合成合成免疫原(诺氟沙星半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联物)和包被原(诺氟沙星半抗原与卵清蛋白OVA偶联物)，用戊二醛法偶联，具体步骤如下1)取0.1mmol的诺氟沙星半抗原溶于2mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌下缓慢滴加戊二醛溶液(终浓度为1.25。/。)成A液。2)取0.002mmol的牛血清蛋白或卵清蛋白(BSA或者OVA)溶于10mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中成B液。3)搅拌条件下将A液缓慢滴加到B液中。搅拌过夜，纯水透析5天。分装冻干保存于一2(TC冰箱中。2.免疫制备多克隆抗体3.ELISA反应过程1)将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100pL/孔，于4'C冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200pLPBST溶液，摇床上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍千，继续洗涤2次。以下洗涤方法相同。2)充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200pL/孔，于37'C温育箱内温育2h后取出烘干待用。3)将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100(iL/孔，37'C孵育lh后洗涤、拍干。4)每孔加入100(iL，l:3000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，37r孵育lh后洗涤、拍干。5)每孔加入IOOiiL显色液，暗处37。C反应15min，取出后每孔加入100终止液(2mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A450。4、回收率及样品提取方法的确定1)以1ng/g和5ng/g的水平加入QNs样品，在室温下至少静置15min。2)取2g已经搅碎的样品，于50mL离心管中。再加入10mL乙酸乙酯-PBS(1:1)，然后用匀浆器匀浆。涡旋混合后超声提取30分钟，3500卬m/min的转速，离心IO分钟。3)移取上层有机层到另一新的带帽试管中，在6070'C的热水浴中，一边用氮气吹干(注意在下层呈碱性的水相中含有高浓度的盐将会对检测反应造成严重污染。故而在移取上层有机层时，不要吸取到下层水相)。4)加入1mLPBS溶液溶解(注意对有些样品来说，也许会出现沉淀或混浊液体。在加样前，可将其离心35分钟；或加热)。5)移取50pL样品溶液，直接加样于微孔中，进行ELISA测定。6)回收率的计算根据不同添加浓度的样品OD值计算相应的抑制率，再根据相应的抑制率从标准曲线上查到各自的浓度。检测浓度与真实浓度之比为对应浓度的回收率。试验结果如下1、标准曲线:本发明所获得的抗原检测的线性范围是为0.0446714ng/mL，具体请见说明书附图。2、灵敏度灵敏度是所得卯％最大吸光值所对应的标准品的浓度，即ICw为0.0126ng/mL。3、交叉反应率(CR。/。)利用喹诺酮类抗生素进行交叉反应研究。cr=(半抗原)xl。Q%。由下表可知，除与5种QNs的交叉反应低于5%外，IC50(喹诺酮类抗生素)其余13种QNs分别在16%和112%之间。符合多残留ELISA方法检测的要求。表1交叉反应率的测定
tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11回收率测定加标样品回收后进行ELISA检测表2加5，回收率分别是63%95%，变异系数小于20°/^际回收率的测定(n=5)tableseeoriginaldocumentpage11权利要求1、一种喹诺酮类抗生素多残留酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的喹诺酮类抗生素多簇抗原免疫得到多克隆抗体，以喹诺酮类抗生素半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物作为包被抗原，以喹诺酮类抗生素为标准品，建立动物性食品中的喹诺酮类抗生素的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下(1)以9％的生理盐水稀释包被抗原1∶100～1∶200作为包被液，加入酶标板中，每孔加入100μL，4℃孵育过夜，按照常规ELISA方法洗涤封闭；(2)将多克隆抗体以抗体稀释液按1∶100～1∶200比例稀释后，加入酶标板中，每孔加35μL；同时每孔分别加入用标准品稀释液稀释的0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL一系列浓度之一的喹诺酮类抗生素标准品或者添加待测样品，每孔加65μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；(3)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP，以抗体稀释液按1∶1000～1∶3000比例稀释，每孔加100μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；(4)配制显色液A液配方为每100mL水中加入0.933g柠檬酸，3.68gNa2HPO4·12H2O，18μL30％H2O2；B液配方为60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇；使用前将A液与B液以4∶1体积混合；(5)每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；每孔加入终止液2M硫酸溶液100μL，酶标仪450nm测吸光值OD。2、根据权利要求1所述的喹诺酮类抗生素多残留酶联免疫检测方法，其特征在于待测样品为动物性食品的提取方法为(1)以lng/g样品和5ng/g样品的水平的喹诺酮类抗生素加入阴性样品，在室温下至少静置15min;(2)取2g已经搅碎的样品，加于2550mL离心管中，再加入10mL乙酸乙酯-PBS体积比1:1的混合液，然后用匀浆器匀浆，涡旋混合后超声提取30min，3500rpm/min离心10min;(3)移取上层有机层到另一新的带帽试管中，在6070'C的热水浴中，一边用氮气吹干(注意在下层呈碱性的水相中含有高浓度的盐将会对检测反应造成严重污染。故而在移取上层有机层时，不要吸取到下层水相:)。(4)加入lmLPBS溶液溶解后待用。全文摘要喹诺酮类抗生素多残留酶联免疫检测方法，属于抗生素残留检测方法
技术领域：
。本发明利用合成的喹诺酮类抗生素多簇抗原免疫得到多克隆抗体，以喹诺酮类抗生素半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物作为包被抗原，以喹诺酮类抗生素为标准品，建立动物性食品中的喹诺酮类抗生素的间接竞争酶联免疫检测方法；为喹诺酮类抗生素在动物性食品中的残留检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好，检测限(IC90)为0.0126ng/ml、半数抑制量(IC50)为0.54ng/ml和检测范围(IC20～IC80)为0.04467～14ng/ml。此外，还从方法的特异性、准确性、灵敏度来评估了本ELISA方法，符合多残留ELISA方法检测的要求。文档编号G01N21/25GK101315376SQ200810022358公开日2008年12月3日申请日期2008年6月26日优先权日2008年6月26日发明者李雅丽,胥传来申请人:江南大学