一种快速检测左旋肉碱的方法及其试剂盒与流程

本发明涉及食品检测领域，尤其涉及一种快速检测左旋肉碱的方法及其试剂盒。
背景技术：
：左旋肉碱又称L-肉碱，是一种促使脂肪转化为能量的内氨基酸，红色肉类是左旋肉碱的主要来源，对人体无毒副作用，左旋肉碱也是条件性婴儿必需的营养物质，在婴儿利用脂肪作为能量来源的代谢中起重要作用。左旋肉碱在婴幼儿食品、饮料、饼干以及一些减肥产品中普遍存在。目前文献报道中测定左旋肉碱的方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法和质谱分析法等，但分光光度法仍是最主要的检测方法。分光光度法检测左旋肉碱大多需要先发生一步化学反应，例如样品中游离的左旋肉碱在乙酰肉碱转移酶的催化作用下与乙酰辅酶A反应，生成游离的辅酶A，辅酶A被进一步氧化后产生有色物质或具有紫外吸收的物质，颜色深浅与左旋肉碱的含量成正比，进而间接检测游离的左旋肉碱的含量。国标GB29989中对婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的检测原理和方法做了明确规定，主要采用比色法，测试样经过水提取，用高氯酸沉淀蛋白质后过滤，滤液经碱皂化后，结合态的左旋肉碱游离出来，左旋肉碱与乙酰辅酶A在乙酰肉碱转移酶的催化下反应生成乙酰肉碱和游离的辅酶A。游离的辅酶A和2-硝基苯甲酸反应生成黄色物质，其颜色深浅与游离的辅酶A含量成正比。因游离的辅酶A与左旋肉碱是等摩尔反应关系，可间接求出试样中左旋肉碱含量。目前国标法检测左旋肉碱含量，采用紫外分光光度计，主要有以下几个方面的缺点：(1)乙酰辅酶A和肉碱乙酰转移酶费用昂贵，检测成本很大；(2)所耗费的体积较大，采用传统比色皿进行测试，需要2-3mL体积的用量，在比色阶段比较耗时；(3)所用到的酶以水溶液形式保存，其有效期有限，酶活力会受到很大程度影响，严重影响实验的稳定性；(4)样品处理需要称量5g，后期样品处理消耗试剂量大，在对某些基质处理上不能透明，影响后续的检测效果。发明专利申请(CN106198531A)：检测左旋肉碱含量的方法：将待测样品与显色液和乙酰辅酶A进行第一接触和第一酶标检测；将第一接触后样品与肉碱乙酰转移酶进行第二接触和第二酶标检测；以及基于第二酶标检测与第一酶标检测的差值，确定待测样品中左旋肉碱的含量。国标GB29989中，样品处理方法复杂、耗时长，并且试剂用量大，检测过程繁琐，重复性差；而现有的左旋肉碱检测试剂盒试剂配制和保存繁琐，反应体系复杂。发明专利申请CN106198531A实际上就是GB29989检测体系的缩小版，改变试剂的用量实现在酶标板上的检测，在技术上没实质创新，仍不能解决酶的保存有效期和实验稳定性问题。BioVision及Sigma等公司已有针对左旋肉碱的检测试剂盒，其原理是将一个乙酰基团从乙酰辅酶A转运到肉碱上，生成的游离辅酶A随后参与到Oxi-Red探针的氧化过程，使其发出荧光，并用酶标仪读取在570nm处的吸收峰，目前市场上存在的试剂盒大多基于该原理。技术实现要素：为了克服现有方法的不足，可以快速高效地检测试样中的左旋肉碱含量，本发明提供快速检测左旋肉碱的方法及试剂盒，不仅能大大缩短试样中左旋肉碱的提取时间，避免了复杂的反应体系，减少在微孔板中的加样步骤，而且使用酶标仪可以快速批量地检测试样中左旋肉碱的含量。首先，本发明提供一种快速检测左旋肉碱的方法，包括：一种快速高效检测左旋肉碱含量的方法，其特征在于，包括：(1)、准备包含冻干乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶的微孔板A、包含沉淀剂包被的微孔板B；(2)、在微孔板A上设置标准孔、质控孔、样品孔，先将显色溶液加入各个孔，再将标准品、质控、及待测样品分别加入到相应的微孔中反应，进行酶显色检测，获得其光吸收值(OD)；(3)、参照步骤(2)在微孔板B同样操作，反应后进行酶显色检测，获得其光吸收值(OD空白)；(4)、基于两次酶显色的光吸收值的差值(OD-OD空白)，通过构建标准曲线来确定待测样品中左旋肉碱的含量。优选地，步骤(1)中微孔板A还包括沉淀剂，微孔板A的制备过程如下：(a)乙酰辅酶A溶液的制备称取20.0mg乙酰辅酶A溶于2.0mL水中，取400μL-600μL与5-50μL甘油和25-100mgD-海藻糖混匀；(b)乙酰肉碱转移酶溶液的制备吸取100μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，经1500r/min离心10min，弃去上层清液，沉淀用2mL水溶解，取400μL-800μL与5-50μL甘油和25-100mgD-海藻糖混匀；(c)冻干处理在微孔板的微孔中加入5-10μL乙酰辅酶A溶液和5-10μL乙酰肉碱转移酶溶液，并将该含乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶的微孔板放入-80℃下预冻30-60min，之后于冻干机中-70～-80℃下冻干6～8h，使乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶得以固定并干燥于微孔中，将冻干后获得微孔板A，将其置于低温干燥条件下保存备用。优选地，所述步骤(2)中显示液采用5x浓缩显色溶液，其配置方法如下：分别称取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL去离子水中，用10mol/LNaOH溶液调pH至7.4～7.6，然后用水定容至50mL，5倍稀释使用。优选地，待测样品制备方法如下：准确称取1.0g混合均匀的试样于烧杯中，用5-10mL水在35-45℃溶解，加入2mL13％高氯酸溶液，混合均匀后放置5-10min，使试样中的蛋白质变性沉淀，用蒸馏水定容至20mL，混匀，离心。取滤液0.8mL，加入0.08mL4mol/L氢氧化钾溶液置于35—45℃水浴震荡10-15min，使结合态的左旋肉碱游离出来。冷却后用13％高氯酸调节pH为6.0～8.0，加入15-30μL氯化钙，加水至2mL，混匀后4000-15000rpm离心，取上清液检测。最后上清液一定要保证澄清。按该过程，样品稀释倍数为50倍。优选地，待测样品制备方法如下：称取5.0g试样于三角瓶中，加入20-40mL0.1mol/LHCl，超声提取15-30min，用4％NaOH将pH值调至7.0～7.5，转入50mL容量瓶中定容后混匀，用滤纸过滤或离心后取滤液检测。优选地，待测样品制备方法如下：取试样5.0g，用温水溶解样品并转入50mL容量瓶中后加入5-15mL质量分数为3.6％的亚铁氰化钾、5—15mL质量分数为7.2％的硫酸锌以及15-30mL100mMNaOH溶液，每次加入都要混匀。定容，混合，过滤，取滤液检测。优选地，步骤(2)中，设置7个标准孔，左旋肉碱标准品配制浓度分别为：0、1.6、3.2、6.4、9.6、16、22.4μg/mL。优选地，步骤(2)、(3)中的酶显色检测均采用酶标仪在波长410-420nm测试吸光度，以二者的吸光度差作纵坐标，浓度值为横坐标，作标准曲线，从标准曲线中读出样品浓度，所得浓度乘以稀释倍数为待测样品中最终所含左旋肉碱浓度。本发明的有益效果如下：通过96孔板反应，减少反应体积和试剂的使用量，进而节约了成本；通过直接将乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶冻干固定于微孔板上，与其他检测试剂盒相比，减少了检测过程中试剂的配制并且减少了加样步骤，使操作更为简便，方法检出限达1mg/100g；通过酶标仪读数，可以实现批量检测，使检测过程更加高效，大大降低了时间成本并且具有高重现性；改良了试样的处理方法，使操作更为简便，且操作时间大为缩短。附图说明图1为本发明实施例检待测样品左旋肉碱浓度与吸光度的工作曲线。具体实施方式以下结合附图和具体实施例，对发明进行详细说明。本发明实施例中试剂盒组成包括96孔微孔板A、96孔微孔板B、5x浓缩显色溶液、左旋肉碱对照品。其中，微孔板A包含乙酰辅酶A和左旋肉碱转移酶及沉淀剂；微孔板B为沉淀剂包被。本发明中，微孔板A板的制备包括以下步骤：(1)乙酰辅酶A溶液的配制称取20.0mg乙酰辅酶A溶于2.0mL水中。临用时取490μL乙酰辅酶A溶液与7.6μL甘油和30mgD-海藻糖混匀。(2)乙酰肉碱转移酶溶液的配制：吸取100μL乙酰肉碱转移酶悬浮液，经1500r/min离心10min，弃去上层清液，沉淀用2mL水溶解。临用时取490μL乙酰肉碱转移酶溶液与7.6μL甘油和30mgD-海藻糖混匀。(c)冻干处理在96孔微孔板的微孔中加入7.5μL乙酰辅酶A溶液和7.5μL乙酰肉碱转移酶溶液，并将该含乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶的微孔板放入-80℃下预冻40min，之后于冻干机中-80℃下冻干7h，使乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶得以固定并干燥于微孔中，将冻干后获得微孔板A，将其置于低温干燥条件下保存备用。本发明中，5x浓缩显色溶液配制方法如下：分别称取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二钠溶于30mL去离子水中，用10mol/LNaOH溶液调pH至7.4～7.6，然后用水定容至50mL。使用时5倍稀释使用，例如吸取0.5mL浓缩液用水定容至2.5mL。本发明中，试样的处理方法有三种，可任选一种：(1)方法一：准确称取1.0g(精确0.001g)混合均匀的试样(如：奶粉、鲜奶、血清、细胞、组织、饲料、谷物等)于烧杯中，用6mL温水(40℃)溶解。加入2mL13％高氯酸溶液，混合均匀后放置6min,用蒸馏水定容至20mL(约5.75mL)，混匀，离心。取0.8mL滤液，加入0.08mL4mol/L氢氧化钾溶液置于40℃水浴震荡15min。冷却后用13％高氯酸(约75μL-85μL，以pH测试为准)调pH为7.0～7.2(检测过程中6.0～8.0即可)，加入20μL氯化钙，加水到2mL(约1.045mL)，混匀后7000-10000rpm离心，取上清液检测。最后上清液一定要保证澄清。按该过程，样品稀释倍数为50倍。(2)方法二：称取5.0g试样于三角瓶中，加入30mL0.1mol/LHCl，超声提取20min，用4％NaOH将pH值调至7.0～7.5，转入50mL容量瓶中定容后混匀，用滤纸过滤(或离心)后取滤液检测。(3)方法三：取试样5.0g(精确至0.1mg)，用温水溶解样品并转入50mL容量瓶中后加入10mL质量分数为3.6％的亚铁氰化钾、10mL质量分数为7.2％的硫酸锌以及20mL100mMNaOH溶液，每次加入都要混匀。定容，混合，过滤，取滤液检测。在做好以上的准备后，本发明的检测方法如下：(1)、本发明左旋肉碱标准品浓度为320μg/mL，将其分别配制成0、1.6、3.2、6.4、9.6、16、22.4μg/mL。(2)、取微孔板A，设置标准孔7个(0、1.6、3.2、6.4、9.6、16、22.4μg/ml)、质控孔一个(75μL显色液，不加样品与标准品)、样品孔；加入75μL显色液到各个孔，轻轻混匀，使孔内粉末充分溶解；取150μL标品、质控(已知含定量左旋肉碱的样品)及样品分别加入到相应的微孔中；反应10—20min，提前打开酶标仪，立刻用酶标仪410-420nm测试吸光度(OD)。(3)、取微孔板B为对照实验组，按与(2)中相同的顺序加样，反应10-20min，提前打开酶标仪，立刻用酶标仪410-420nm测试吸光度(OD空白)。14)用吸光度差(OD-OD空白)作纵坐标，浓度值为横坐标，做标准曲线，从标准曲线中读出样品浓度，所得浓度乘以稀释倍数为样品中最终所含左旋肉碱浓度。表1微孔板A/微孔板B的设置010203040506…ASTD1STD1T1T1T9T9…BSTD2STD2T2T2T10T10…CSTD3STD3T3T3T11T11…DSTD4STD4T4T4T12T12…ESTD5STD5T5T5T13T13…FSTD6STD6T6T6T14T14…GSTD7STD7T7T7T15T15…H质控质控T8T8T16T16…表1所示为本发明中微孔板A/微孔板B的设置，其中微孔板A为实验板条，微孔板B为对照实验组，加样完全相同；质控为已知左旋肉碱的样品。图1为本发明实施例检测获得的待测样品左旋肉碱浓度与吸光度的工作曲线。测试结果见表2，从表2的结果得知，使用本发明提供的测试方法，与国标方法检测结果非常接近，证明本发明直接将乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶冻干固定于微孔板上的测试方法切实可行。表2测试结果以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3