一种牛大力花不同发育时期的化学成分检测方法

本发明涉及化学成分分析，具体涉及一种牛大力花不同发育时期的化学成分检测方法。

背景技术：

1、牛大力为豆科鸡血藤属植物美丽鸡血藤callerya speciosa(champion exbentham)schot的干燥根，主产我国广东、广西和海南等地，具有补虚润肺、强筋活络、提高免疫等功能，是岭南地区著名的食药两用植物，应用时以日常药膳为主，以中药方剂为辅，包括壮腰健肾丸、活络止痛丸和舒筋健丸等。目前，牛大力的功效研究和产品开发主要围绕地下块根(薯)开展，地上部位较少被关注。在民间，有以牛大力花煲汤或做茶饮、鲜花饼的食用习惯。牛大力在开花期白色的花朵缀满枝条，具有花期长、花量大和花穗长的特点，并且与地下根的生长密切相关。研究表明，牛大力中含有黄酮、三萜、生物碱、脂肪酸，以及多糖、氨基酸、维生素等多种活性物质。植物生长发育过程中存在库源关系，且有效成分在不同器官与组织中不断合成并会发生转移，随着时空发生动态变化，那么理清牛大力花的化学成分，对于研究牛大力地上部位化学成分与地下根(薯)化学物质积累的关系，牛大力去花处理的可行性，以及牛大力花资源的科学开发和合理利用都有重要意义。

2、本发明以2种植株形态(蔓性和直立性)牛大力的花为对象，收集了花蕾期、初花期、盛开期和凋萎期4个发育时期的样本。基于植物代谢组学的分析方法，采用uplc-q-exactive ms技术，对花的初生代谢物、次生代谢物和挥发性物质进行分析、鉴定，使用正交偏最小二乘法判别分析、主成分分析和层次聚类分析等方法进行差异分析，以期探明不同生长发育时期牛大力花化学物质组成和变化规律。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种牛大力花化学成分的检测方法，能够有效分离和不同发育时期的牛大力花中的化学成分。

2、本发明的第一个方面是提供一种牛大力花化学成分的检测方法，以花蕾期、初花期、盛开期或凋萎期的蔓性牛大力花或直立性牛大力花为检测对象，采用超高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱进行测定。

3、其中，超高效液相色谱的条件为：

4、色谱柱为100mm×2.1mm，1.8μmwaters acquityuplc hss t3色谱柱；柱温：42-48℃；体积流量：0.25-0.45ml/min；流动相：流动相a为体积浓度0.05-0.15％甲酸水溶液；流动相b为体积浓度0.005-0.015％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱。

5、优选地，洗脱梯度如下：

6、0～2min，95％流动相a，5％流动相b；

7、2～4min，95％→70％流动相a，5％→30％流动相b；

8、4～8min，70％→50％流动相a，30％→50％流动相b；

9、8～10min，50％→20％流动相a，50％→80％流动相b；

10、10～14min，20％→0％流动相a，80％→100％流动相b；

11、14～15min，0％流动相a，100％流动相b；

12、15～15.1min，0％→95％流动相a，100％→5％流动相b；

13、15.1～16min，95％流动相a，5％流动相b。

14、其中，在采用超高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱进行测定前，将检测对象采用醇水溶液进行提取制成待测样品。

15、优选地，所述醇水溶液中的醇为甲醇和/或乙醇。

16、优选地醇水溶液中醇的体积百分比为5-95％，优选为10-90％，更优选为30-80％，更优选为50％-70％。

17、优选地，超高效液相色谱的条件中，所述柱温为45℃；所述体积流量为0.3-0.4ml/min，优选为0.35ml/min；流动相a为体积浓度0.08-0.12％甲酸水溶液，优选为体积浓度0.1％甲酸水溶液；流动相b为体积浓度0.008-0.012％甲酸乙腈溶液，优选为体积浓度0.01％甲酸乙腈溶液。

18、其中，超高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱中的质谱仪的质谱条件为：采用电喷雾离子源(esi)，分别采用正、负离子模式检测。优选地，正离子模式：喷雾电压3.8kv，鞘气流量40arb，辅助气流量10arb。优选地，负离子模式：喷雾电压3.0kv，鞘气流量35arb，辅助气流量8arb。优选地，毛细管温度为320℃，以70000分辨率进行全扫描，采用高能诱导裂解进行二级裂解，分辨率为17500，扫描范围为m/z 70～1000da。

19、采用本发明的高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱从花蕾期、初花期、盛开期或凋萎期的蔓性牛大力花或直立性牛大力花分离化合物情况如下表1所示。

20、本发明的第二个方面是提供一种牛大力花化学成分的分离方法，以花蕾期、初花期、盛开期或凋萎期的蔓性牛大力花或直立性牛大力花为分离对象，采用超高效液相色谱进行分离。

21、其中，超高效液相色谱的条件为：

22、色谱柱为100mm×2.1mm，1.8μmwaters acquityuplc hss t3色谱柱；柱温：42-48℃；体积流量：0.25-0.45ml/min；流动相：流动相a为体积浓度0.05-0.15％甲酸水溶液；流动相b为体积浓度0.005-0.015％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱。

23、优选地，洗脱梯度如下：

24、0～2min，95％流动相a，5％流动相b；

25、2～4min，95％→70％流动相a，5％→30％流动相b；

26、4～8min，70％→50％流动相a，30％→50％流动相b；

27、8～10min，50％→20％流动相a，50％→80％流动相b；

28、10～14min，20％→0％流动相a，80％→100％流动相b；

29、14～15min，0％流动相a，100％流动相b；

30、15～15.1min，0％→95％流动相a，100％→5％流动相b；

31、15.1～16min，95％流动相a，5％流动相b。

32、其中，在采用超高效液相色谱进行分离前，将分离对象采用醇水溶液进行提取制成待测样品。

33、优选地，所述醇水溶液中的醇为甲醇和/或乙醇。

34、优选地醇水溶液中醇的体积百分比为5-95％，优选为10-90％，更优选为30-80％，更优选为50％-70％。

35、优选地，超高效液相色谱的条件中，所述柱温为45℃；所述体积流量为0.3-0.4ml/min，优选为0.35ml/min；流动相a为体积浓度0.08-0.12％甲酸水溶液，优选为体积浓度0.1％甲酸水溶液；流动相b为体积浓度0.008-0.012％甲酸乙腈溶液，优选为体积浓度0.01％甲酸乙腈溶液。

36、采用本发明的超高效液相色谱能够从花蕾期、初花期、盛开期或凋萎期的蔓性牛大力花或直立性牛大力花分离化合物情况如下表1所示，表1中+表示能够分离得到，-表示不能分离得到。

37、本发明的第三个方面是提供一种化合物的制备方法，所述化合物如表1所示，采用超高效液相色谱从花蕾期、初花期、盛开期或凋萎期的蔓性牛大力花或直立性牛大力花分离得到，表1中+表示能够分离得到，-表示不能分离得到。

38、其中，超高效液相色谱的条件为：

39、色谱柱为100mm×2.1mm，1.8μmwaters acquityuplc hss t3色谱柱；柱温：42-48℃；体积流量：0.25-0.45ml/min；流动相：流动相a为体积浓度0.05-0.15％甲酸水溶液；流动相b为体积浓度0.005-0.015％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱。

40、优选地，洗脱梯度如下：

41、0～2min，95％流动相a，5％流动相b；

42、2～4min，95％→70％流动相a，5％→30％流动相b；

43、4～8min，70％→50％流动相a，30％→50％流动相b；

44、8～10min，50％→20％流动相a，50％→80％流动相b；

45、10～14min，20％→0％流动相a，80％→100％流动相b；

46、14～15min，0％流动相a，100％流动相b；

47、15～15.1min，0％→95％流动相a，100％→5％流动相b；

48、15.1～16min，95％流动相a，5％流动相b。

49、其中，在采用超高效液相色谱进行分离前，将分离对象采用醇水溶液进行提取制成待测样品。

50、优选地，所述醇水溶液中的醇为甲醇和/或乙醇。

51、优选地醇水溶液中醇的体积百分比为5-95％，优选为10-90％，更优选为30-80％，更优选为50％-70％。

52、优选地，超高效液相色谱的条件中，所述柱温为45℃；所述体积流量为0.3-0.4ml/min，优选为0.35ml/min；流动相a为体积浓度0.08-0.12％甲酸水溶液，优选为体积浓度0.1％甲酸水溶液；流动相b为体积浓度0.008-0.012％甲酸乙腈溶液，优选为体积浓度0.01％甲酸乙腈溶液。

53、本发明采用超高效液相色谱结合特定的流动相和洗脱程序能够从各个花期的蔓性牛大力花和直立性牛大力花中分离出225个化合物，进一步采用四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱的分析方法，快速地对225个化合物进行了鉴定，以黄酮类、三萜类和苯丙素类等次生代谢物为主，包含少量氨基酸、糖等初级代谢产物。结果表明，牛大力花中含有丰富的黄酮类、三萜类、有机酸类、氨基酸类和糖类等活性成分和营养物质，具有很强的生态学意义，开发利用价值较高。本发明丰富了牛大力的化学成分，并为其药理活性及开发利用研究奠定基础，同时提供了多个化合物的新的制备方法，丰富了化合物的来源。