辣椒疫霉调控游动孢子发育相关蛋白及其编码基因与应用

本发明属于生物，具体涉及一种辣椒疫霉调控游动孢子发育相关蛋白及其编码基因与应用；特别涉及来自植物病原卵菌中的疫霉属病原菌(phytophthora spp.)的含有afil和spa结构域的调控游动孢子发育mesa及其编码基因与应用。

背景技术：

1、卵菌(oomycetes)是一类数量庞大的真核生物，目前已知的卵菌数量超过1800种，在世界范围内广泛分布，可引起多种动植物疾病。虽然卵菌和真菌在菌丝形态和营养物质吸收方式等方面相似，但是卵菌和真菌的亲缘关系较远，和硅藻亲缘关系较近，均属于茸鞭生物界。植物病原卵菌占卵菌总数的60％左右，可以分为疫霉属(phytophthora)、腐霉属(pythium)、霜霉属(peronospora)等。其中疫霉属病原(phytophthora spp.)在农业生产中危害严重，有6种疫霉属病原菌被列为世界十大重要植物病原卵菌，包括致病疫霉(phytophthorainfestans)、大豆疫霉(phytophthora sojea)和辣椒疫霉(phytophthoracapsici)等。其辣椒疫霉(phytophthoracapsici)寄主广泛，可侵染包括茄科中的辣椒、烟草以及豆科、葫芦科等26科70多种蔬菜作物。辣椒疫霉在苗期至果期均会引起植株的病害，并导致作物的根茎部、果实的腐烂，严重时导致植株萎蔫甚至猝倒，对作物产量和品质的影响极大，造成严重的经济损失。

2、辣椒疫霉的生活史包括有性阶段和无性阶段，有性阶段通过异宗配合产生卵孢子；无性阶段则是通过成熟的孢子囊在低温潮湿的条件下从孔口释放游动孢子，游动孢子到达寄主表面形成休止孢，条件适宜下萌发成菌丝直接侵入或者通过伤口或孔口侵染植物，这是主要的侵染来源。孢子囊和游动孢子随风雨和灌溉水进行远程传播，是造成植物疫病爆发的主要原因。因此，抑制游动孢子的产生可进一步抑制病原菌的侵染和致病力以达到切断病害循环、控制辣椒疫霉引起的植物疫病的流行。

3、mesa蛋白是一类在病原菌中保守存在的极性轴稳定相关蛋白，其在玉米黑粉菌(ustilagomaydis)、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)和构巢曲霉(aspergillusnidulans)的菌丝正常形态维持和侵染致病方面发挥重要作用。mesa同源蛋白在卵菌中普遍存在，但其生物学功能尚未见报道。

技术实现思路

1、发明人前期研究发现，辣椒疫霉的mesa蛋白虽和丝状菌丝的mesa蛋白均具有afil(avl9 superfamily)和spa(stabilization ofpolarity axis)结构域，但是蛋白同源性均小于25％，这表明卵菌mesa蛋白可能具有区别于真菌mesa蛋白的功能特征。进一步生物信息学分析发现，辣椒疫霉mesa蛋白和其他卵菌mesa蛋白同源性很高，均在60％以上。系统发育进化关系分析发现疫霉属mesa蛋白的亲缘关系更近，辣椒疫霉mesa与其蛋白同源性均在70％以上，其中与橡树疫霉(phytophthora ramorum)mesa蛋白同源性为91.11％。综上所述，mesa蛋白在卵菌尤其是疫霉菌中具有较高的同源性。

2、基于此，通过发明人的研究发现，辣椒疫霉中存在含有mesa蛋白保守结构域afil和spa的pcmesa。该蛋白调控游动孢子的形成，因此，可以通过控制游动孢子发育蛋白pcmesa来阻断卵菌的正常侵染，达到控制(抑制或阻断)卵菌引起的病害大规模的传播和流行。

3、因此，本发明提供了一种疫霉病菌中含有afil和spa结构域的游动孢子发育调控蛋白，名称为mesa，为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

4、a1)氨基酸序列是如seq id no.2所示的蛋白质；

5、a2)在如seq id no.2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；

6、a3)将如seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如seq id no.2所示的蛋白衍生的蛋白质；

7、a4)与如seq id no.2所示的氨基酸序列相似性在60％以上，优选在70％以上，更优选在90％以上且具有与如seq id no.2所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

8、为了使a1)中的蛋白方便纯化，也可以在如seq id no.2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；所述标签可以为poly-arg(rrrrr)、poly-his(hhhhhh)、flag(dykddddk)、strep-tag ii(wshpqfek)、c-myc(eqkliseedl)等标签。

9、上述a1)-a4)中的生长发育调控蛋白一般来源于自然界中疫霉菌中，即一般来讲，其为天然产物，也可以人工表达或者合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a2)-a4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中seq id no.2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。其中，其中，辣椒疫霉(phytophthora capisici)pcmesa的序列如seq id no.2所示,序列表中seq id no.2(mesa)由560个氨基酸残基组成。

10、本发明目的之二是提供编码所述含有afil和spa结构域的mesa蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。

11、其中，上述mesa蛋白的编码基因为如下b1)或b2)或b3)：

12、b1)序列表中seq id no.1所述的核苷酸序列所示的dna分子；

13、b2)与b1)所示的核苷酸序列的具有60％以上或70％以上或90％以上同一性，且编码上述pcmesa蛋白的cdna分子或dna分子；

14、b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述pcmesa蛋白的cdna分子或dna分子。

15、在本发明中，致病调控蛋白的dna序列(编码基因和cdna)可以具体地如seq idno.1所示，序列表中seq id no.1由2028个核苷酸组成，自序列1的5’端第1-2028位核苷酸为编码序列，编码序列表中seq id no.2所示的蛋白质(pcmesa)。

16、本发明之三提供了如上任意一种dna序列转录得到的rna序列，优选的，所述rna分子的序列为如下c1)或c2)：

17、c1)如seq id no.1所示的dna序列转录的rna序列的相似性在60％以上，进一步优选在70％以上，更优选在90％以上且具有与如seq id no.1或seq id no.1所示的dna序列转录的rna序列相同功能的rna序列；

18、c2)最优选rna序列为如seq id no.1所示的dna序列转录的rna序列。

19、本发明之四提供与上述的生长发育调控蛋白、编码基因或上述rna分子相关的生物材料，为下述d1)至d10)中的任一种：

20、d1)含有所述编码基因的表达盒；

21、d2)含有所述编码基因的重组载体、或含有d1)所述表达盒的重组载体；

22、d3)含有所述编码基因的重组微生物、或含有d1)所述表达盒的重组微生物、或含有d2)所述重组载体的重组微生物；

23、d4)含有所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有d1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

24、d5)含有所述编码基因的转基因植物组织、或含有d2)所述表达盒的转基因植物组织；

25、d6)含有所述编码基因的转基因植物器官、或含有d2)所述表达盒的转基因植物器官；

26、d7)抑制所述编码基因表达的核酸分子；优选的，所述核酸分子为敲除所述编码基因的核酸分子，或者沉默所述编码基因的核酸分子，也可以为编码表达靶向待敲除目的基因的sgrna片段，如靶向于pcmesa基因的sgrna序列(编码序列)aacatcccaccattccctct；

27、d8)含有或表达d7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系，重组载体可以包括基于crispr/cas9的基因敲除法是将目的基因的donor载体和sgrna及cas9蛋白表达质粒；所述donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、donor dna序列(可以为nptii或gfp或rfp等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。sgrna及cas9蛋白共表达质粒为编码表达靶向待敲除目的基因的sgrna片段和表达cas9蛋白的dna序列的载体，其中，所述待敲除目的基因为pcmesa基因，靶向于pcmesa基因的sgrna序列(编码序列)为aacatcccaccattccctct。优选的，所述sgrna及cas9共表达质粒是以pyf515载体为出发载体，将pcmesa基因的sgrna退火得到的双链sgrna编码序列，插入pyf515载体的nhe i和bsa i酶识别位点之间，得到sgrna及cas9共表达质粒；

28、d9)抑制所述rna分子翻译的核酸分子；

29、d10)含有或表达d9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

30、本发明目的之五是提供辣椒疫霉pcmesa蛋白及编码pcmesa蛋白的核酸分子或含有编码pcmesa蛋白的核酸分子的生物材料的应用。

31、所述应用为下述1)-5)中任一种或几种：

32、1)在调控(提高或降低)卵菌游动孢子产量中的应用；

33、2)在调控(提高或降低)卵菌侵染寄主能力中的应用；

34、3)在抑制和/或杀灭卵菌中的应用。

35、优选的，其中，所述应用中，包括通过抑制序列1所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制所述的rna分子的翻译，或抑制和/或灭活序列2所述的pcmesa蛋白的活性来实现1)-3)所述的应用。

36、所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录，或抑制上述的rna序列的翻译，或抑制和/或失活上述pcmesa蛋白的活性来影响卵菌游动孢子产生和调控侵染寄主能力。

37、本发明的目的之六为提供所述序列表中seq id no.2所示的pcmesa蛋白、所述序列表中seq id no.1所示的编码基因或上述rna分子或上述生物材料或如权利要求5所述的蛋白或者dna在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选卵菌抑菌和/或杀菌剂中的应用；所述抑菌或杀菌剂可通过抑制或者灭活卵菌seq id no.2所示的pcmesa蛋白抑制游动孢子的产生，从而能够抑制或杀灭卵菌。优选的，所述致病调控蛋白的cdna序列为如seq id no.1所示的dna序列。优选的，所述方法用于抑制和/或杀灭卵菌引起的生产上的卵菌病害。

38、所述卵菌优选为疫霉，更优选为辣椒疫霉病菌(phytophthora capsici)。

39、本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选卵菌(如疫霉，特别是辣椒疫霉)抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述卵菌，当所述待检测物能够抑制如上dna序列的转录，或抑制如上rna序列的翻译，或抑制和/或失活如上所示mesa蛋白的活性，则所述待测物质为候选的植物卵菌抑菌和/或杀菌剂。

40、本发明目的之八是提供一种降低卵菌活性的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因的转录，或抑制所述的rna分子的翻译，或抑制和/或失活如上所述的mesa蛋白的活性；

41、本发明还提供降低卵菌侵染寄主能力的方法，是通过所述的抑制卵菌(如疫霉，特别是辣椒疫霉)游动孢子的产生来降低卵菌侵染寄主能力。

42、上述方法中，通过敲除如上任意一种dna序列，抑制卵菌游动孢子的产生。所述卵菌优选为疫霉，更优选为辣椒疫霉病菌(phytophthora capsici)，如辣椒疫霉病菌bya5菌株。

43、本发明的一个实施方式中，其中上述基因敲除和回补的方法采用基于crispr/cas9的基因敲除法。

44、具体的，基于crispr/cas9的基因敲除和回补法是将目的基因的donor载体和sgrna及cas9共表达质粒转染卵菌筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。

45、所述敲除相关载体，其中donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、donor dna序列(可以为nptii或gfp或rfp等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体；所述回补相关载体，其中donor载体为依次含有敲除目的基因上游800-1500bp的序列、donordna(pcmesa基因序列)和敲除目的基金的下游800-1500bp的序列的重组载体。

46、sgrna及cas9蛋白共表达质粒为编码表达靶向待敲除目的基因的sgrna片段和表达cas9蛋白的dna序列的载体，其中，所述待敲除目的基因为pcmesa基因及gfp基因，靶向于pcmesa基因的sgrna序列(编码序列)为aacatcccaccattccctct，靶向gfp基因的sgrna序列(编码序列)为ccacggaacagggagctttc。

47、优选的，所述sgrna及cas9共表达质粒是以pyf515载体为出发载体，分别将pcmesa基因和gfp基因的sgrna退火得到的双链sgrna编码序列，插入pyf515载体的nhe i和bsa i酶识别位点之间，得到sgrna及cas9共表达质粒。

48、上述应用中，所述pcmesa表达和/或活性的物质为抑制pcmesa表达和/或抑制其编码基因的转录和/或抑制pcmesa的编码基因转录得到的rna分子的翻译的物质。

49、试验证明，本发明所提供的mesa蛋白在疫霉菌的游动孢子发育过程中起作用。利用peg-cacl2介导的原生质体转化技术并结合crispr/cas9基因编辑技术获得的敲除突变体，其游动孢子生长发育较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：mesa蛋白缺失后孢子囊内容物不能正常分裂，不能形成正常形态的游动孢子。因此，疫霉菌游动孢子发育调控蛋白mesa在疫霉菌无性繁殖过程可发挥重要作用，进而切断病害循环影响卵菌对植物的侵染。本发明为进一步探究疫霉属病菌乃至卵菌的游动孢子形成过程及致病机制提供了技术支持，并为卵菌引起的植物疫病防治及新型杀菌剂的研发提供了技术基础。