一种控制条件下合欢盆距兰种子快繁方法

本发明涉及植物的组织培养技术，尤其涉及合欢盆距兰的组织培养方法，包括了外植体选择、消毒等处理、原球茎诱导形成、原球茎芽形成、发芽球茎生根诱导培养、幼苗移栽炼苗等步骤。

背景技术：

1、兰科植物为被子植物的第二大科，全球有899属，27801种，均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》的保护范围。我国兰科植物资源丰富，有194属，1620种，其中有1257种兰科植物被列入《国家重点保护野生植物名录》，丰富的兰科植物资源在森林生态系统维护及推动经济社会发展方面发挥了重要作用。合欢盆距兰为兰科盆距兰属植物，生于群山林中树干上。在我国分布地域狭窄，报道仅见于台湾中部山区，以及湖南新宁县、会同县境内。截止到2022年，新宁县总共发现合欢盆距兰500株。因数量稀少，野生动植物保护行政主管部门2009年将其列入《全国极小种群野生植物拯救保护实施方案》第103号物种。

2、合欢盆距兰数量濒危。在湖南省林业局指导下，新宁县林业局已经在合欢盆距兰分布点建立了保护站，并安装了围栏。但因其生态系统脆弱，种子野外自然萌发极其困难，仅依靠就地保护和自然繁衍，难以确保其种群持续稳定。只有实现合欢盆距兰的人工繁育，并结合野外归化技术，促进种群恢复到足够基数，才能保障该物种在原生境可持续地繁衍生息。但目前尚未有合欢盆距兰繁育在技术上和野外实际归化中成功的案例见诸报道，也未有合欢盆距兰组培技术专利的申请。

3、兰科植物种类繁多，目前部分种类已开展种子繁育特性研究，但不同种类之间差异较大，我们的前期研究表明，铁皮石斛种子经过45d左右诱导后，可产生原球茎。而春兰、建兰等国兰种子萌发则比较困难，即使经特殊处理，萌发也需要150d。可见，不同兰科植物种子萌发特性差异较大。迄今，关于合欢盆距兰种子萌发特性和促萌方法的研究尚未见报道。本发明公开一种以合欢盆距兰种子为繁殖材料，通过控制温度、湿度、光照强度、洁净度等环境因子和生物因子等条件，提高合欢盆距兰种子萌发率的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有促进兰科植物种子萌发技术的不足，提供一种简便、高效合欢盆距兰种子在控制条件下的萌发成苗方法。该方法首次利用合欢盆距兰未开裂成熟蒴果进行免hgcl2消毒的消毒方法，获得大量种子作为外植体，并能快速诱导原球茎和不定芽，其原球茎和不定芽诱导率，以及生根率均达到优异水平。

2、本发明的目的是通过以下方式实现的。

3、一种合欢盆距兰在控制条件下的快繁方法，包括以下步骤：

4、(1)未开裂的成熟蒴果经过消毒后无菌条件下获得种子；

5、(2)种子诱导形成原球茎；

6、(3)原球茎芽诱导；

7、(4)发芽球茎生根诱导；

8、(5)幼苗移栽炼苗。

9、步骤(1)所述的未开裂的成熟蒴果是指合欢盆距兰于4月中旬开花授粉后，经历5～6个月果实成熟期，果实表面颜色为浅黄绿色至黄色，表面无病斑，无虫蛀且未开裂的健康成熟蒴果。

10、步骤(1)蒴果的消毒过程如下：用水将蒴果表面冲洗干净后，按照无菌操作规范，先用70～75％的酒精浸泡15～40s，优选20～30s；然后用无菌水冲洗一次，再用1～3％的naclo浸泡2～4min，优选1.5～2％的naclo浸泡2.5～3min；随后用无菌水冲洗三次备用。

11、进一步地，优选小心去掉蒴果顶端枯萎组织，不破坏蒴果的完整性，然后用自来水将蒴果表面冲洗干净后，置于超净工作台之无菌器皿上。

12、进一步地，将步骤(1)消毒后的蒴果，无菌条件下，用灭菌滤纸吸干蒴果表面水分，然后剖开，将果皮内的种子备用。

13、步骤(2)将步骤(1)得到的无菌种子撒播于原球茎诱导形成培养基中，培养基组分为1/2ms培养基+2～6mg/l 6-ba(优选3～4mg/l)+0.2～0.5mg/l(优选0.3～0.4mg/l)naa+0.3～0.8mg/ltdz(优选0.4～0.6mg/l)，蔗糖浓度30g/l，琼脂粉浓度6g/l，调整ph为5.8，培养温度为23±1℃，湿度为55～70％(优选60～65％)；在光照12h、黑暗12h的光周期，光照强度1500～2400lx条件下培养，20～30d后，原球茎即大量形成。

14、步骤(3)将步骤(2)得到的原球茎转移至原球茎芽诱导培养基中，并加入适量无菌水，使原球茎均匀平铺于培养基表面，培养基组分为1/2ms培养基+2～6mg/l 6-ba(优选3～4mg/l)+0.2～0.5mg/lnaa(优选0.3～0.4mg/l)+0.3～0.8mg/ltdz(优选0.4～0.6mg/l)+2～4g/l活性炭(优选2.5～3.5mg/l)，蔗糖浓度30g/l，琼脂粉浓度6g/l，调整ph为5.8，培养温度为23±1℃，湿度为55～70％(优选60～65％)；在光照12h、黑暗12h的光周期，光照强度1500～2400lx条件下培养25～40d，原球茎即诱导长出芽，称为发芽球茎。

15、步骤(4)将步骤(3)获得的发芽球茎转移至生根培养基中进行诱导生根培养，生根培养基组分为1/2ms培养基+0.2～0.8mg/lnaa(优选0.2～0.5mg/l)+1～5g/l活性炭(优选2～3g/l)，30g/l的蔗糖以及4g/l的琼脂粉，调整ph为5.8，培养温度为23±1℃，湿度为55～70％(优选60～65％)；在光照12h、黑暗12h的光周期，光照强度1500～2400lx条件下培养25～30d后，发芽球茎开始陆续长根。

16、步骤(5)待步骤(4)发芽球茎的根长出2条以上，平均长度1～3cm时，称为幼苗，此时可对瓶内幼苗进行炼苗。

17、进一步地，移栽基质由泥炭土(粒径不超过10mm)：发酵腐熟松树皮(粒径9～12mm)：鹿沼土(粒径3～6mm)：蛭石(粒径3～6mm)按照体积比＝(7～12)：(6～10)：(3～6)：(3～6)混合而成。

18、优选移栽基质由泥炭土(粒径不超过10mm)：发酵腐熟松树皮(粒径9～12mm)：鹿沼土(粒径3～6mm)：蛭石(粒径3～6mm)按照体积比＝(8～10)：(7～8)：(4～5)：(4～5))的体积比，混合后在120℃高温下灭菌1～2h。

19、更进一步地，将装有幼苗的容器至于自然光和不超过30℃环境，培养3d，然后将容器瓶盖打开一半继续培养12～24h；从所述容器中取出幼苗，在20～30℃清水中轻轻洗掉根部附着的培养基，将苗移栽到配置好的高温灭菌的移栽基质中；苗移栽基质后，将炼苗容器基质表面覆盖干苔藓，适量浇水后，置于相对湿度70％～90％、、遮阴度50％的自然光温室大棚中，每天通风3～5次；待单株叶片长至3～5片，叶长度长至1～2cm，将合欢盆距兰苗移栽至野外适生生境。

20、本发明有益效果：本发明以合欢盆距兰种子为外植体，获得了合欢盆距兰从取得种子到在控制条件下培养成幼苗的全套技术方法。该技术方法具有以下优点：

21、(1)省时、省力：外植体取自合欢盆距兰未开裂的成熟蒴果内的种子，不需要用到嫩芽。同时包含外植体的蒴果表面较嫩芽等组织更易去污、净化手续简单便捷。

22、(2)简便、高效、无hgcl2残留：只需对包含大量种子外植体的蒴果用70～75％的酒精和1～3％的naclo进行分步消毒，最后用灭菌水稍加漂洗即可完成。不用hgcl2消毒，因此无hgcl2残留，也无需用大量的灭菌水来漂洗，节约了水资源，减少了对环境的潜在危害。上述灭菌剂无需直接作用于外植体。该方法消毒效果好，可将外植体污染率控制在6％以内。

23、(3)保护合欢盆距兰野生资源：外植体取自秋季未开裂的成熟蒴果。因合欢盆距兰种子在野外极难自行萌发，蒴果采收不会对野生合欢盆距兰的生长繁育造成影响。

24、(4)原球茎诱导效率高：使用本发明的技术方法，原球茎诱导率可达90％以上，高于已公布的同属的尖叶盆距兰用芽尖为外植体的诱导效率[1]。技术优势明显。

25、(5)技术体系完整：提供了合欢盆距兰控制条件下培养过程中从外植体采集到球茎发芽生根培养的成套技术方法，并对各个技术环节进行了充分优化，最快70d左右即可获得完整的幼苗，适于合欢盆距兰种苗的规模化生产。