本发明属于畜牧业动物营养技术研究领域，涉及一种以嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌为添加剂的复合益生菌饲料配方，更具体的说是一种提高断奶仔猪生长性能和免疫力等方面的应用。
背景技术：
抗生素类生长促进剂是通过干扰细胞壁的结构物质肽聚糖的生物合成从而抑制细菌的繁殖。目前，养殖业中由于抗生素滥用造成的细菌耐药性、药物残留、动物免疫力下降等问题已严重影响了我国的畜产品质量安全，亦给经济增长带来了极大损失。近年来，保障仔猪健康、提高其免疫力等方面逐渐成为猪营养与饲料研究领域的热点和难点，饲料添加剂的研究也正在向着无残留、无耐药性和对人类健康和环境无危害的方向发展。饲料添加剂嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌因为其特有的多功能性、益生作用及不易产生耐药性等优点在动物生产中被广泛应用。
嗜酸乳杆菌属于乳酸菌类微生态制剂，主要存在小肠中，释放乳酸、乙酸和一些对有害菌起作用的抗生素，通过竞争营养物质，抑制肠道不良微生物增殖；具有为动物机体提供营养物质及多种酶类，促进动物消化吸收，增强机体免疫力等功能。枯草芽孢杆菌具有调节肠道微生态平衡、促进消化吸收、提高饲料利用率、增强动物免疫力等功能。嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌作为外源益生菌具有无污染、无有害残留、适合在肠道生存等特性，且二者具有相似的生物学特性，因而逐渐作为抗生素替代品之一被越来越广泛地应用于畜牧业养殖生产中。
查阅近年来资料以及结合实际情况，表明：断奶仔猪营养不仅是养猪业的热点，也是难点，仔猪生长性能和免疫力这一领域的创新性有待于提高。通过嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌调节机体的营养物质的消化吸收和增强免疫球蛋白表达等功能，我们研究了一种断奶仔猪复合益生菌饲料添加剂，以此来改善仔猪生长性能和免疫力，在一定程度上提高养殖业的经济效益。
技术实现要素：
本发明的一个目的是公开了一种断奶仔猪复合益生菌饲料添加剂及应用。
本发明的另一个目的是公开了所配制的饲粮在断奶仔猪生长性能、血液T淋巴细胞亚群和血清猪瘟病毒抗体方面的应用效果。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容
一种断奶仔猪复合益生菌饲料添加剂，其特征在于在饲料原料中使用嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌饲料添加剂，进行合理配制日粮，由下述重量份数的原料组成：
玉米58-65 豆粕16-24 乳清粉2-5
鱼粉4-8 小麦麸1-5 葡萄糖1-3
酸化剂0.1-0.5 磷酸氢钙0.5-1.5 石粉0.5-1.2
食盐0.1-0.6 L赖氨酸盐酸盐0.1-0.8 DL-蛋氨酸0.1 -0.7
苏氨酸0.1-0.7 仔猪预混料1-4
嗜酸乳杆菌添加剂0.001-0.01（冻干粉中活菌含量为1×109CFU/g，饲粮中浓度为1×104~1×105CFU/g）
枯草芽孢杆菌添加剂0.001-0.01（冻干粉中活菌含量为1×109CFU/g，饲粮中浓度为1×104~1×105CFU/g）。
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
本发明所述酸化剂指的是安徽华扬农牧科技有限公司产品，主要成分是乳酸、正磷酸、柠檬酸、富马酸、甲酸。
本发明所述的断奶仔猪配合饲料的制备方法：将玉米、豆粕两种原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分别进行称量，在小型混合机中混匀即可。
本发明一个优选的配方（重量份数）：
玉米62.698 豆粕18 乳清粉4.5
鱼粉4 小麦麸4 葡萄糖3
酸化剂0.4 磷酸氢钙1.1 石粉0.65
食盐0.3 L-赖氨酸盐酸盐0.15 DL-蛋氨酸0.1
苏氨酸0.1 仔猪预混料1
嗜酸乳杆菌添加剂0.001（饲粮中嗜酸乳杆菌浓度为1 × 104CFU/g）
枯草芽孢杆菌添加剂0.001（饲粮中枯草芽孢杆菌浓度为1×104CFU/g）；
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
本发明另一个优选的配方（重量份数）：
玉米62.23 豆粕17 乳清粉4.5
鱼粉4 小麦麸5 葡萄糖3.5
酸化剂0.4 磷酸氢钙1.1 石粉0.65
食盐0.3 L-赖氨酸盐酸盐0.1 DL-蛋氨酸0.1
苏氨酸0.1 仔猪预混料1
嗜酸乳杆菌添加剂0.01（饲粮中嗜酸乳杆菌浓度为1 × 105CFU/g）
枯草芽孢杆菌添加剂0.01（饲粮中枯草芽孢杆菌浓度为1×105CFU/g）；
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
本发明进一步公开了断奶仔猪复合益生菌饲料添加剂在作为提高断奶仔猪生长性能和免疫力中的应用。试验指标：断奶仔猪的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）、全血中T淋巴细胞亚群CD4＋、CD8＋的比例及CD4＋/CD8＋的比值、血清中猪瘟病毒（CSFV）抗体阻断率，从而说明对仔猪免疫力的影响。
本发明的断奶仔猪复合益生菌饲料添加剂试验结果表明：
（1）与对照组相比，试验6组日粮中添加一定量的嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌，显著（P＜0.05）提高了仔猪的ADG、ADFI，显著（P＜0.05）降低了F/G，表明该饲料配方能促进断奶仔猪营养物质的吸收，有效提高断奶仔猪的生长性能；
（2）与对照组相比，试验6组日粮中添加嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌，显著提高全血中CD4＋/CD8＋比值，极显著（P＜0.01）提高血清中CSFV抗体阻断率，表明这种饲料添加剂能有效改善断奶仔猪健康状况，提高断奶仔猪免疫力。
为了更进一步说明本发明的积极效果，提供如下的试验：
1．试验动物及分组
采用单因子试验设计，选取体重7.47 ± 0.62 kg的健康“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪168头，临床健康、发育正常，随机分为7个处理，每个处理分为4个重复，每个重复6头猪。7个处理组分别饲喂：
1）对照组：基础饲粮（不含菌）；
2）试验2组：基础饲粮＋0.001嗜酸乳杆菌添加剂（浓度为1 × 104CFU/g）；
3）试验3组：基础饲粮＋0.001枯草芽孢杆菌添加剂（浓度为1 × 104CFU/g）；
4）试验4组：基础饲粮＋0.0005嗜酸乳杆菌添加剂（浓度为0.5 × 104CFU/g）＋0.0005枯草芽孢杆菌添加剂（浓度为0.5 × 104CFU/g）；
5）试验5组：基础饲粮＋0.001嗜酸乳杆菌添加剂（浓度为1 × 104CFU/g）＋枯草芽孢杆菌添加剂0.001（浓度为1 × 104CFU/g）；
6）试验6组：基础饲粮＋0.01嗜酸乳杆菌添加剂（浓度为1 × 105CFU/g）＋0.01枯草芽孢杆菌添加剂（浓度为1 × 105CFU/g）；
7）试验7组：基础饲粮＋0.02嗜酸乳杆菌添加剂（浓度为2 × 105CFU/g）＋0.02枯草芽孢杆菌添加剂（浓度为2 × 105CFU/g）。试验期内随时观察中毒表现及死亡情况。
嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌为市售产品。
2．基础饲粮配方及营养水平
根据NRC（1998）配制猪基础日粮配方及营养水平如表1所示；
表1 基础饲粮组成及营养水平（饲喂基础）
a 每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
b 根据NRC（1998）饲料成分表计算。
3．试验规程
试验在一个大型商品猪场进行，试验期14天。饲喂、管理、免疫按猪场规定程序进行。饲喂2周后，从生长性能最佳的处理组的每个重复组中随机选取3头断奶仔猪采血，进行血液指标（CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋和Blocking rate）分析。整个试验过程中观察仔猪的健康状况，记录死、淘仔猪以及腹泻、用药情况。
4．测定指标
血液指标测定：试验结束后，仔猪通过前腔静脉采两管血，采血后，一管采用武汉博士得生物工程公司的SABC免疫组织化学染色试剂盒方法，测定全血中T淋巴细胞亚群CD4＋、CD8＋的比例及CD4＋/CD8＋的比值；另一管立刻将血液静置1h后，3000r/min离心10min，吸取上清液，-20℃保存待检。使用美国IDEXX猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒测定抗体阻断率（Blocking rate）。
5．统计分析
采用SAS统计软件下的Compare Means模块中的One-Way ANOVA进行方差分析，并采用Duncan’s多重比较进行组间差异显著性检验，P<0.05为差异显著。
本发明公开的断奶仔猪复合益生菌饲料添加剂在断奶仔猪饲料中的应用效果，主要包括：
（1）生长性能：
表2不同剂量的嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能的影响
注：同行之间肩注，无字母或小写字母相同表示差异不显著（P＞0.05），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下表同。
结果：
①由此可知，试验2组和试验3组的ADG显著（P＜0.05）高于对照组；试验4组的ADG显著（P＜0.05）高于试验2组和试验3组；试验2组、试验3组和试验4组的ADFI和F/G与对照组相比，差异均不显著（P＞0.05）。
因此，单独添加嗜酸乳杆菌或枯草芽孢杆菌均能促进断奶仔猪的平均日增重，且试验4组复合添加后，对ADG的影响更明显；
②试验6组的ADG显著（P＜0.05）高于试验4组、试验5组和试验7组；试验6组的ADFI显著（P＜0.05）高于试验5组和试验7组；试验6组的F/G显著（P＜0.05）低于试验5组和试验7组；试验5组和试验7组的ADG、ADFI和F/G均差异不显著（P＞0.05）。
与对照组相比，试验5组即可对仔猪的生长性能有显著（P＜0.05）改善，综合考虑饲喂效果和成本因素，试验6组为最佳添加量。
结论：因此，此益生菌复合添加剂中嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌添加量范围均为0.001~0.01（饲粮中浓度为1 × 104CFU/g~1 × 105CFU/g）。
（2）血液指标：
①对照组：基础饲粮（不含益生菌添加剂）；
②试验6组：基础饲粮＋0.01嗜酸乳杆菌添加剂（浓度为1 × 105CFU/g）＋0.01枯草芽孢杆菌添加剂（浓度为1 × 105CFU/g）；
表3 对血液指标的影响
注：同行肩注小写字母不同表示差异显著P<0.05，肩注大写字母不同表示差异极显著P<0.01，无肩注字母表示差异不显著P>0.05。**表示P<0.01。
由表3试验数据结果表明：
（1）T淋巴细胞亚群是反映机体内细胞免疫功能正常与否的重要指标，当CD4＋/CD8＋比值维持在较高水平时，说明机体处于较高的免疫状态，试验6组的CD4＋/CD8＋比值显著高于对照组，因此，该复合益生菌饲料添加剂能提高仔猪免疫力。
（2）与对照组相比，试验6组日粮中添加嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌，极显著（P＜0.01）提高了猪瘟病毒的抗体阻断率。因此，该复合益生菌饲料添加剂有助于断奶仔猪病毒抗体的产生，从而提高仔猪免疫力。
本发明对以嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌为饲料添加剂的饲料配方进行了安全性试验，其方法如下：
（1）步骤：
材料和方法：选择28日龄，7.52±0.47 kg断奶的“杜×长×大”仔猪6头，临床健康、发育正常，饲养于专用代谢笼中，试验期2周。试验期内随时观察中毒表现及死亡情况。
（2）饲喂的仔猪基础饲料原料组成：
包括玉米62.66、豆粕19、乳清粉4.7、鱼粉4、小麦麸3.45、葡萄糖3、酸化剂0.3、磷酸氢钙0.6、石粉0.6、食盐0.3、L-赖氨酸盐酸盐0.1、DL-蛋氨酸0.1、苏氨酸0.15、仔猪预混料1、嗜酸乳杆菌0.02（饲粮中活菌浓度为2 × 105CFU/g）、枯草芽孢杆菌0.02（饲粮中活菌浓度为2 × 105CFU/g）。
结果：给断奶仔猪饲喂上述试验饲粮，连续饲喂14天，未见明显中毒现象，观察期内无死亡，随机尸检其中一头仔猪，各主要脏器未见明显异常。
（3）结论：
断奶仔猪日粮中添加0.02%的嗜酸乳杆菌（饲粮中浓度为2 × 105CFU/g）和0.02%的枯草芽孢杆菌（饲粮中浓度为2× 105CFU/g）饲喂仔猪，饲喂效果安全。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作一步说明，但不作为本发明的限制。本发明的实施例中所述的重量份数原料指的是克、公斤或吨，可根据生产实际的需要加以调整。本发明所用到的各种原料例如：玉米、豆粕、乳清粉、小麦麸、磷酸氢钙、石粉、食盐、L-赖氨酸盐酸盐、DL-蛋氨酸、苏氨酸、酸化剂、预混料、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌等对外均有售；其中下面的产品均有市售：
酸化剂指的是安徽华扬农牧科技有限公司产品；
乳清粉指的是天津市升腾饲料有限公司产品；
仔猪预混料指的是正大预混料（天津）有限公司；
豆粕指的是中粮集团有限公司产品；
嗜酸乳杆菌添加剂指的是武汉远城科技发展有限公司产品；
枯草芽孢杆菌添加剂指的是沧州市益宏动物保健品有限公司；
玉米指的是天津玉米世纪科技有限公司产品；
鱼粉指的是进口秘鲁鱼粉；
小麦麸和葡萄糖指的是天津市鼎圣饲料有限公司产品。
实施例1
断奶仔猪复合益生菌添加剂配合饲料原料组成：
包括玉米61.589、豆粕20、乳清粉3.95、鱼粉4、小麦麸4、葡萄糖3、酸化剂0.4、磷酸氢钙0.7、石粉0.7、食盐0.3、L-赖氨酸盐酸盐0.1、DL-蛋氨酸0.1、苏氨酸0.15、仔猪预混料1、嗜酸乳杆菌0.01（饲粮中浓度为1 × 105CFU/g）、枯草芽孢杆菌0.001（饲粮中浓度为1 × 104CFU/g）。其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
制备方法：将玉米、豆粕两种原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分别进行称量，在小型混合机中混匀即可。
实施例2
断奶仔猪复合益生菌添加剂配合饲料原料组成：
包括玉米62.589、豆粕19、乳清粉3.95、鱼粉4.5、小麦麸4、葡萄糖2.5、酸化剂0.4、磷酸氢钙0.7、石粉0.7、食盐0.3、L-赖氨酸盐酸盐0.1、DL-蛋氨酸0.1、苏氨酸0.15、仔猪预混料1、嗜酸乳杆菌0.001（饲粮中浓度为1×104CFU/g）、枯草芽孢杆菌0.01（饲粮中浓度为1×105CFU/g）。
其中所述的仔猪预混料是指每千克预混料中含有：14,600 mg铁，630 mg铜，410 mg 锰，10,400 mg锌，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg烟酸，8 mg生物素。
制备方法：将玉米、豆粕两种原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分别进行称量，在小型混合机中混匀即可。
实施例3
一种断奶仔猪复合益生菌添加剂配合饲料由下述重量份数的原料组成：
包括玉米63.08、豆粕18.5、乳清粉3.95、鱼粉4、小麦麸4.5、葡萄糖2.5、酸化剂0.4、磷酸氢钙0.7、石粉0.7、食盐0.3、L-赖氨酸盐酸盐0.1、DL-蛋氨酸0.1、苏氨酸0.15、仔猪预混料1、嗜酸乳杆菌0.01（饲粮中浓度为1×105CFU/g）、枯草芽孢杆菌0.01（饲粮中浓度为1×105CFU/g）。
制备方法：将玉米、豆粕两种原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分别进行称量，在小型混合机中混匀即可。
实施例4
采用断奶仔猪的配合饲料饲喂断奶仔猪的方法：
此系列配方适用断奶仔猪，适用期为30~45天，根据情况让仔猪自由采食即可，必须提供充足的饮水，其他按正常的饲养管理进行。
实施例5
比较试验
常规的仔猪饲料：
方法：配制玉米-豆粕型仔猪饲粮，不添加嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌。选择6头7.28±0.54 kg仔猪，试验期14天。试验结束后对6头仔猪进行采血。
步骤：试验结束后，仔猪通过前腔静脉采两管血，采血后，一管采用武汉博士得生物工程公司的SABC免疫组织化学染色试剂盒方法，测定全血中T淋巴细胞亚群CD4＋、CD8＋的比例及CD4＋/CD8＋的比值；另一管立刻将血液静置1h后，3000r/min离心10min，吸取上清液，-20℃保存待检，使用美国IDEXX猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒测定CSFV的抗体阻断率。
结果：全血中CD4＋、CD8＋和CD4＋/CD8＋分别为28.51%、27.92%和1.02，血清中CSFV的抗体阻断率为56.34%。
日粮中添加嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌后饲料：
方法：配制玉米-豆粕型仔猪日粮，添加0.01%嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌0.01%。选择6头7.31±0.48kg仔猪，试验期14天。试验结束后对6头仔猪进行采血。
步骤：试验结束后，仔猪通过前腔静脉采两管血，采血后，一管采用武汉博士得生物工程公司的SABC免疫组织化学染色试剂盒方法，测定全血中T淋巴细胞亚群CD4＋、CD8＋的比例及CD4＋/CD8＋的比值；另一管立刻将血液静置1h后，3000r/min离心10min，吸取上清液，-20℃保存待检，使用美国IDEXX猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒测定CSFV的抗体阻断率。
结果：全血中CD4＋、CD8＋和CD4＋/CD8＋分别为29.74%、24.83%和1.20，血清中CSFV的抗体阻断率为78.79%。
结论：日粮中添加嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌能显著提高全血中CD4＋/CD8＋的比值，显著提高血清CSFV的抗体阻断率。通过比较试验说明：日粮中添加嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌能调节仔猪免疫力。