尿激酶原的低分子量衍生物及含有它们的药用组合物的制作方法

专利名称：尿激酶原的低分子量衍生物及含有它们的药用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及尿激酶原(单链尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活因子(SCU-PA))以及通过DNA重组来制备这些化合物的方法。
本发明提供的衍生物显示令人感兴趣的、改善了的药理作用，具体来讲它们可用作有效的溶解血栓的药物。
我们采用部位引导的诱变技术来修饰人类表达尿激酶原(又称scu-PA)的基因，并且将突变后的基因在大肠杆菌(E.Coli)的重组株上得到表达。这些修饰以得到低分子量的衍生物为目的。
本发明中的尿激酶原的新的分子形式被纯化，然后确定了其生物化学及生物学性能。它们保留与原型的尿激酶原类似的特异性和选择性溶解血栓的性能，然而它们失去了尿激酶原的细胞结合区域，因此在血液循环中显示更长的半衰期。
另外，它们可以高效率地用DNA重组技术制得，从而可以较低的成本制得血栓溶解剂。
对调节生理状态下纤维蛋白溶解的分子间作用认识的不断深入，给了解血栓溶解的机制和发展一些新的血栓溶解剂带来一些启示。
在人类纤维蛋白溶解系统中，酶原即纤维蛋白溶酶原可以被几种类型的纤维蛋白溶酶原激活因子激活为活性酶，即纤维蛋白溶酶。(Collen，D.和Lijnen，H.R，人类的纤维蛋白溶解系统，CRC Critical Reviews in oncology/hematology，4，№3，249，1986;Verstraete，M和collen，D.，八十年代的血栓溶解疗法，Blood，67，№1529，1986)。纤维蛋白溶酶是降解血栓中纤维蛋白组分的主要蛋白霉(Rakoczi.I.，Wiman，B.，和Collen，P.，纤维蛋白，纤维蛋白溶酶原和抗纤维蛋白溶酶间特异性作用的生物学意义，Biochim.，Biophys.，Acta，540，295，1978;Robbins，K.C.，Summaria，L.，Hsieh，B.，和Shah，R.S.;人类纤维蛋白溶酶的肽链，人类纤维蛋白溶酶原到纤维蛋白溶酶的激活机理，J.Biol.Chem，242，2333，1967;Widman，B.，人类纤维蛋白溶酶B链的一级结构，Eur.J.Biochem.，76，129，1977)。然而，纤维蛋白溶酶对一些血浆蛋白也显示其溶蛋白作用，这些蛋白包括血液凝固途径中的成份纤维蛋白原，因子Ⅴ和因子Ⅶ(Collen，D.和Lijnen，H.R.人类纤维蛋白溶解系统，CRC Critical Reviews in Oncology/hematology.4，№3，249，1986;Verstraete，M.和Collen，D.八十年代的血栓溶解疗法，Blood 67，№6，1529，1986;Wiman，B.，B.，Ljinen，H.R.和Collen.D.，纤维蛋白溶酶的赖氨酸结合位点和α2-抗纤维蛋白溶酶和纤维蛋白原的补充位点的特异性作用，Biochim.Biophys.Acta，579，142，1979)。
纤维蛋白溶酶原的激活可能发生在全身的血液循环中，这样使血液循环中的纤维蛋白溶酶很快被α2-抗纤维蛋白溶酶中和，因此不能用来溶解纤维蛋白(Collen，D.和Lijnen，H.R.人类的纤维蛋白溶解系统，CRC Critical Reviews in Oncology/hematology，4，№3，249，1986;Verstraete，M.和Collen，D.，八十年代的血栓溶解疗法，Blood，67，№6，1529，1986)。当α2-抗纤维蛋白溶酶水平明显降低时，纤维蛋白溶酶被中和得较慢，这样不但对纤维蛋白，而且对上述的血液凝固蛋白可以显示蛋白溶解作用。血浆中纤维蛋白原，因子Ⅴ和因子Ⅷ水平的过度降低，同某些纤维蛋白原降解产物对止血过程，血小板凝集和纤维蛋白聚合显示的抑制作用一起导致止血困难，从而有大量失血的危险(Latallo，2.S.和Lpaciuk，S.血栓溶解疗法的新途径与链激酶连接的去纤维蛋白酶的应用，Thrombos.Diath.Haemouh.，56，253，1973;Totty，W.G.，Gilula，L.A.，Mc.Clennman，M.，Ahmed，P.，和Sherman L.低剂量血管内的纤维蛋白溶解疗法，Radiology 143，59，1982)。另一方面，纤维蛋白溶酶原的激活可能发生在纤维蛋白水平(纤维蛋白结合的纤维蛋白溶酶原激活)，得到纤维蛋白结合的纤维蛋白溶酶(Collen，D.和Lijnen，H.R.人类的纤维蛋白溶解系统，CRC Critical Reviews in Oncology/hematology，4.№3，249，1986;Verstraete，M.和Collen，D.八十年代的血栓溶解疗法，Blood，67.№6，1529，1986)，这样的纤溶酶不受α2-抗纤维蛋白溶酶的影响，因而不会导致全身性纤维蛋白原的溶解。
在人类惯常难ㄈ芙饬品ㄖ凶畛Ｊ褂玫南宋鞍兹苊冈せ罴粒蚣っ负土醇っ付韵宋鞍酌挥刑匾煨裕饬礁龌衔锛せ钛貉分谢蛳宋鞍捉岷系南宋鞍兹苊冈负趺挥惺裁辞穑╖amarron，C.，Lijnen，H.R.VanHoet，B.和Collen，D.人类尿激酶的酶原和活性形式的生物学和血栓溶解性能，Ⅰ.由人类或用DNA重组技术得到的尿激酶体外在人血浆中的纤维蛋白溶解和纤维蛋白原溶解性能，Throm.Haemostasi，52，19，1984;Samama，M.和Kher，A.，纤维蛋白溶解剂和抗纤维蛋白溶解剂，Sem.Hop.Paris，61，№20，1423，1985)。因此，在使用链激酶和尿溶酶的治疗过程中，经常导致全身性止血困难，这样，大失血危险性的增加，阻碍了这些血栓溶解剂在临床上的广泛应用，尽管它们有很强的临床效用(Samama，M.，和Kher，A.纤维蛋白溶解剂和抗纤维蛋白溶解剂，Sem.Hop.Paris，61，№20，1423，1985;Maizel，A.S.，和Bookstein，J.J.链激酶、尿激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂，药代动力学、相对的优点以及提高速率和溶解一致性的方法，Cardiovasc.Intervent.Radiol.，9，236，1986;Bell，W.R.，链激酶和尿激酶用于治疗肺栓塞，Thromb.Haemostas.，35，57，1976;Acar，J.，Vahanian.A.，Michel，P.L.，Slama，M.，Cormier，B.和Roger，V.，急性心肌梗塞的血栓溶解疗法，SeminarsinThromb.andHaemost.，13，№2.186，1987;GISSI急性心肌梗塞有效的静脉血栓溶解疗法，Lancet，1，397，1986)。
相反，组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)(Hoylaerts，M.，Ryken，D.C.，Lijnen，H.R和Collen，D.人组织纤维蛋白溶酶原激活性剂激活纤维蛋白溶酶原的动力学，纤维蛋白的作用。J.Biol.Chem.，257，№6，2912，1982)和更近的尿激酶原(ProcUK)(Husain，S.S.，和Gureuhich.V.，人尿中单链、高分子量形式的尿激酶的纯化和部分定性，Arch.Biochem.Biophys.，220，31，1983)，这两个天然存在的蛋白质是血液循环中的纤维蛋白溶酶原的弱激活剂，相反地是纤维蛋白结合的纤维蛋白溶解酶原的强激活剂，它们既不引起全身性止血困难，也不消耗α2-抗纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原，所以它们的临床应用带来的失血危险性较小。
t-PA的纤维蛋白特异的溶解血栓的活性，归因于其通过特异的赖氨酸结合部位与纤维蛋白相结合的能力，特异的赖氨酸结合部位位于分子的三重二硫键的“Kringle”区域，因此，与纤维蛋白结合的纤维蛋白溶酶原可以在不显著影响止血功能的情况下被激活(Collen.D.和Lijnen，H.R.，组织纤维蛋白溶酶原激活剂的作用机理和溶血栓性能，Haemostasis，16，№3，25，1986)。另一方面，尿激酶原(又称为单链尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂，Scu-PA)不与纤维蛋白结合，然而，它显示纤维蛋白特异的溶血栓作用而不影响全身性的止血功能(Pannell，R.和Gurewieb，V.，尿激酶原，其血浆中的稳定性和选择性溶纤维蛋白作用机理的研究，Blood，67，1215，1986;Gurewich，V.和Pannell，R.，单链尿激酶(尿激酶原)的纤维蛋白结合和发酵作用，SeminarsinThromb.和Haemostat，B，№2，146，1987;Lijnen，H.R.，Zamarron，C.，Blaber，M.，Winbler，M.Z.和Collen，D.，尿激酶原对纤维蛋白溶酶原的激活，I，机理，J.Biol.Chem.261，1253，1986)。对人类表达这些蛋白的基因的分离和定性以及后来用DNA重组技术制备这些蛋白进行了广泛的研究(Collen，D.，Stassen，J.M.，Marafino，B.J.，Ruilder，JR.S.DeCock，F，Ogez，Jajiri，D.，Pennica，D.，Bennett，W.T.Salwa，T.和Hoyng.C.F.由重组DNA在哺乳动物细胞中表达得到的人类组织型纤维蛋白溶酶原激活剂的生物学性质，J.Pharmacol，Exp.Ther.，231，№1，146，1984;Holmes，W.E.，Pennica，D.，Blaber，M.，Rey，M.W.，Gunzler，W.A.，Steffens.G.J.和Heynecker，H.L.代表尿激酶原的基因在大肠杆菌(EscherichiaColi)中的克隆化和表达，Biotechnology，3，923，1985)。
重组的t-PA曾送交多中心临床试验，用于急性心肌梗塞的病人，结果表明它在疏通堵塞了的冠状动脉方面显然比链激酶更有效(欧洲重组组织型纤维蛋白溶酶原激活剂联合研究组急性心肌梗塞中静脉使用重组组织型纤维蛋白溶酶原激活剂和链激酶对比的随机试验，Lancet，1，842，1985;Sheehan，F.H.，Braunwald，E.，Canner，D.，Doodge，H.T.，Gone，J.，VanNattaP.，Passamani，E.R.，Williams，D.O.，Zaret，B.静脉溶血栓疗法对左室δ艿挠跋欤豪醋孕募」Ｈ═IMI相I)中血栓溶解的有关组织型纤维蛋白溶酶原激活剂和链激酶的报告，Circulation，75，4，817，1987)。尿激酶原目前处于临床Ⅱ期的试验中，被认为在溶血栓活性和安全性方面至少同t-PA一样有效(VandeWerf，F.，Nobuhara，M.和Collen，D.急性性肌梗塞的病人使用人单链尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(尿激酶原)后冠状动脉的血栓溶解，AnnalsofInternalMedicline，104，345，1986;VandeWerf，F.，Vanhaecke.J.，DeGeest，H.，Verstraehe，M.，和Collen.D.急性心肌梗塞的病人使用重组单链尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂后的冠状动脉血栓溶解，Circulaton，74，№5，1066，1986)。
在人尿、血浆和许多细胞组成的适宜的培养基中发现至少有三种尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(U-PAS)的不同形式。第一种形式的特点为含有一个有溶解纤维蛋白活性的含有410个氨基的多肽，其表观分子量为54000道尔顿，含有两个由二硫键连接的肽链(Gunzler.W.A.，Steffens，G.J.，Oetting，F.，Kim，SM.A.，Frankus，E.，和Flohe，L，从人尿中得到的高分子量的尿激酶的一级结构，A链所有氨基酸的序列，Hoppe-Seyler′sA.Phisiol.Chem.，363，1155，1982)。
A链或轻链含有157个氨基酸和一个由三重二硫键构成的“Kringle”结构。这个链还含有一个正常细胞和新生物细胞(单细胞、类单细胞和A431表皮样细胞)的受体结合区域。B链或重链(30，000道尔顿)含有253个氨基酸并含有催化区域。
U-PA的这一分子形式通常被为尿激酶(UK)、双链尿激酶(TC-UK)或高分子量尿激酶(HMW-UK)(Gunzler，W.A.，Steffens，G.J.，Dtting，F.，Buze，G和Fohe，L.，高分子量和低分子量尿激酶之间的结构关系，Hoppe-Seyler′sZ.Phisiol.Chem.，363，133，1982)。
U-PA的第二种形式的分子量为33，000道尔顿，是由纤维蛋白溶酶或胰蛋白对HMW形式的溶蛋白降解而得到的，它被称为低分子量尿激酶(LMW-UK)，蛋白质序列分析表明LMW-UK与HMW-UK一致，不同的是LMW-UK没有NH2-端的135个氨基酸，它们是被纤维蛋白溶酶或胰蛋白酶特异性地去除的(Steffens，G.J.，Gunzler，W.A.，Otting.，F.，Fraankens，E.，和Flohe，L.由人尿中得到的低分子尿激酶全部氨基酸的序列，Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Ohem.，363，1043，1982)。
已确定的U-PA的第三种形式为尿激酶原(ProUK)，为尿激酶的一个单链(54，000道尔顿)形式，从而也称作单链尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(SCU-PA)。
尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的所有分子形式均已由DNA重组技术制得(Zamarron.C.，Lijnen，H.R.，VanHoef，B.，和Collen，D.人尿激酶的酶原和活性形式的生物学和溶血栓性质，I.从人尿中或由DNA重组技术得到的尿激酶体外在人血浆中的纤维蛋白溶解作用或纤维蛋白原溶解作用，Thromb.Haemostas.，52，19，1984;Holmes，W.E.，Pennica，D.，Blaber，M.，Rey，M.W.，Gunzler，W.A.，Steffens，G.J.和Heynecker，H.L.大肠杆菌(EscherichiaColi)中尿激酶原基因的克隆化和表达，Biotechnology，3，923，1985;Gunaler，W.A.，Henninger，W.，Hennies，H.H.，Otting，F.，Schneider，J.，Friderichs，E.，Giertz，H.，Flohe，L.，Blaber，H.和WinklerM.由细菌产生的人尿激酶对比于从人尿中得到的尿激酶的功能定性，Haemostasis，14，60，1984)。
通过部位特异的诱变，我们从人类表达尿激酶原的基因开始，得到了一系列表达新的和原来的单链尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂衍生物的修饰了的基因，这些衍生物为在开始的162个氨基酸中失去不同大小的序列片段的较低分子量的类似物。
修饰后的基因在大肠杆菌(E.coli)的重组株中表达，新的重组产物，以其单链形式被纯化，并确定它们有特异性溶解纤维蛋白栓塞的能力。
这些新分子形式的化合物，以前从未在自然界中发现过，这正是本发明的目的所在。这些单链低分子量的尿激酶原衍生物具有特异的血栓溶解作用，可有效地替代原来的或重组的尿激酶原。试验表明它们的半衰期较长，从而也延长了其药理作用。
本发明的一个方面是提供一个人尿激酶原的低分子量衍生物，它至少含有完整尿液酶原单链构型的氨基酸163到氨基酸411之间的序列。
更好的情况是，衍生物至少含有氨基酸151到411，氨基酸141到411之间的序列，或者至少含有完整尿激酶原的氨基酸1到10连到完整尿激酶原的氨基酸136到411的序列。
本发明还提供一个衍生物，其中不存在包含在序列氨基酸48～135间的完整尿激酶原的“kringle”区域或包含在序列氨基酸11～47间的完整尿激酶原的受体结合区域或细胞结合区域。
本发明还包括进一步修饰的上述衍生物，可以是氨基酸的去除、插入或取代，或者含有至少一个附加的氨基酸。
本发明还进一步包括含有上述衍生物的药用组合物，以及制备这些衍生物的DNA序列、载体和转换宿主。
完整的尿激酶原理解为长度完整的尿激酶原。
另外，本发明提供的衍生物至少缺少下列一个完整尿激酶原的区域-“Kringle”区域-受体结合区域，或细胞结合区域。
再者，衍生物在多肽的-NH端可以有一个附加的蛋氨酸残基，或可带有至少一个糖甙侧链。衍生物也可含有另外的至少一个任何来源的氨基酸序列。
本发明中后面的几类衍生物可通过用纤维蛋白溶酶处理前述的衍生物来得到。
本发明中的衍生物可以做成与适于药用的载体相混合的药用组合物的形式，这样的药用组合物为有效的溶血栓药物。
新尿激酶原衍生物的分子特性新的尿激酶原衍生物是由寡核苷酸引导的诱变来得到的。具体来讲，设计并合成一些寡核苷酸来导致尿激酶原基因的密码区域的去除。这一方法的原理是将尿激酶原基因亚克隆化至一个能以单链形式得到的载体上，例如质粒载体M13。重组的单链与补充的合成的含有所需密码序列而不含有要除去的序列的寡脱氧核糖核苷酸一起孵育，然后用DNA聚合酶和连接酶来延长新链并将其连接成环状形式。新生成的杂二重DNA用来将细胞线转化为可以复制的，并得到一个子代，其中带有原型基因和已进行过必要的消除的基因的质粒将分成两种不同的分子种类。起始的致突变的寡核苷酸可用作检测突变基因的探针。
突变基因随后可插到大肠杆菌表达载体上，这些载体可指导新尿激酶原衍生物的合成，然后重组的分子得到纯化和定性。
组成本发明主要内容的新尿激酶原衍生物可归纳如下a)称为△125的形式，(表观分子量约为31kd)，是通过去除尿激酶原基因中从氨基酸11到氨基酸135之间的DNA序列而得到的。这一衍生物由286个氨基酸组成，它保留了原有的溶蛋白区域而失去了“Kringle”区域，它以单链形式分离得到，可以被纤维蛋白溶酶转化为其双链构型。△125用纤维蛋白溶酶处理后具有解酰胺的活性。
b)称为△140的形式，(表观分子量约为30kd)，它是去除尿激酶原的开始的140个氨基酸而得到的。由271个氨基酸组成的这个衍生物是以其单链构型分离得到的，用纤维蛋白溶酶处理后可得到其有解酰胺活性的双链形式。
c)称为△150的形式，(表观分子量约为29Kd)，是由尿激酶原中去除开始的150个氨基酸而得到的。含261个氨基酸的这一衍生物的单链构型是无解酰胺活性的，当用纤维蛋白溶酶处理后，则变成完全有活性的。
d)称为△162的形式，(表观分子量约为27kd)，是从尿激酶原中去除开始的162个氨基酸而得到的。这个含有249个氨基酸的衍生物相当于B链尿激酶，只是没有开始的4个氨基酸。
所有我们的新衍生物，以图表形式归纳于

图1，其各自的特异性活性列于表1。
体外125I-标记的纤维蛋白栓溶解及纤维蛋白原溶解活性。
在如前所述的125I标记的人血浆栓塞浸在含柠檬酸的人血浆组成的体外试验系统中测定了代表性的尿激酶原衍生物的相对溶纤维蛋白和溶纤维蛋白原活性(Matsuo，O.，Ryken，D.C.和Collen，D.体外组织纤维蛋白溶酶原激活剂和尿激酶的相对溶纤维蛋白原、溶纤维蛋白和溶血栓作用的比较，Throm.Haemost.，45，225，1981)。原型的尿激酶原和人尿中的双链尿激酶作为参照产物。
将125I标记的血栓加至2.0毫升沉淀过的血浆中，记数，在水浴37℃时加或不加(对照)1.50i.u./ml各个尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的情况下孵育，研究TC-UK时其浓度为50i.u./ml。孵育4小时后，除去血浆样品，125I标记测定，由溶解了的放射性同位素可算出溶解百分率。另外，还测定了各个样品的血浆纤维蛋白原水平(Vermylen，C.，De Vreker，.R.，和Verstraete，M.纤维蛋白原的快速酶法测定纤维蛋白的聚合时间(FPT-试验)，Clin.Chim.Acta，8，418，1963)，并表示为基线值(对照样品)百分数。
尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂(尿激酶原及其低分子量衍生物浓度为iu/ml;TC-UK的浓度为50i.u./ml)在血浆中的稳定性在室温预孵育14小时后测定。预孵育后，往各混合物中加入新鲜制备的125I标记血栓，并置于37℃，将三重样品如上测定并计算其溶解率。
所得结果列于表2。结果表明，所有受试的低分子量衍生物均可诱导完全的血栓溶解而无明显的溶纤维蛋白原作用。本发明中的低分子量尿激酶原衍生物显示极为有效的纤维蛋白特异的栓溶作用。
另外，本发明的低分子量衍生物在人血浆中孵育24小时后仍保留其溶栓效力，这表明这些分子在血浆中更稳定，类似原型的尿激酶原，而不类似于TC-UK。
新尿激酶原衍生物的药代动力学曲线。
本发明一些代表性尿激酶原衍生物的药代动力学曲线通过纺普通鼠静脉注射80.000IU/kg的方法测定。
类尿激酶抗原水平及优球蛋白组分的溶解纤维蛋白活性在注射前及注射后0.5，1，2，5，10，20，30分钟后测定。
所得结果见图2。
这些结果显示与天然原型尿激酶原衍生物△125比较(初始t1/2小于5分钟)，U-PA相关抗原的血浆消失速率慢得多。
另外，优球蛋白部分的溶解纤维蛋白活性与血浆中U-PA抗原水平相关。
这些新尿激酶原衍生物与肝素的作用在抗凝血治疗中经常会在血浆中碰到药理剂量的肝素(在0.01至1IU/ml范围内)，这剂量在体外明显增加纤维蛋白溶酶活化一些代表性的新LMW衍生物△125的活化速率(图3显示)。天然原型尿激酶原也显示出这种作用，但程度小得多。
讨论和结果本发明中受试的新衍生物△125，△140和△150所观察到的酰胺解行为显示任何含有尿激酶原最后261个氨基酸的单链构型在纤维蛋白溶酶把它活化而转变成双链构型(表1)后，都显示出酰胺解活性。
在进行溶解血栓治疗而伴有抗凝血作用时，肝素可达一定浓度(0.01-1IV/ml)，此浓度能极显著地刺激本发明中的一个衍生物(△125)被纤维蛋白溶酶的转化成双链构型。原型尿激酶原也显示出此作用，但程度要小得多。
另一方面，此新LMW衍生物能使125I-标记的人纤维蛋白栓完全溶解而不引起持续性纤维蛋白原溶解作用，而双链尿激酶不是这样。
另外，在加入I标记的人纤维蛋白栓前在血浆中对此新衍生物进行至少24小时的孵育仍有上述作用。与此相反，在人血浆中进行长时间孵育后，TC-UK的栓溶解作用完全消失。
最后，本发明中的一个新衍生物(△125)给大鼠一次静脉注射后，观察到其血中的半衰期显著地延长了(图3)。
由此可得到下述结论-本发明中的新分子量的衍生物具有原型尿激酶原内在的酰胺解作用并且可在纤维蛋白溶酶的激活下完全活化成一具有酰胺解活性的双链型。
-纤维蛋白溶酶对本发明的新分子量的衍生物的活化作用及随后把它们转化成完全具酰胺解活性的双链构型过程能显著地被肝类刺激。由于临床上肝素往往与溶解血栓治疗相关，这种对本发明的新尿激酶原衍生物的刺激作用也许改善其血栓溶解活性。
-与非特别异性的TC-UK比较，本发明的新分子量的衍生物对纤维蛋白栓的溶解作用更专一。因此，所有具有氨基酸序列151至411的单链构型尿激酶原衍生物是比TC-UK优越的血栓溶解剂，具有更小的大出血危险。
-另外，由于新的尿激酶原衍生物没有尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂位于残基13-30(Appella，E.Robinson，E.A.，Ullrich，S.J.stoppelli，M.P.，Corti，A.，Cassani.G.，和Blasi，F.，Theveceptorbindingsequenceofurokinase，J.Biol.Chem.262，№10，4437，1987)的细胞结合部位，与原型尿激酶原和TC-UK比较，前者在循环中的半衰期可显著地延长。因此，本发明新的低分子量的尿激酶原衍生物的纤维蛋白特异的溶栓活性，肝素治疗中其作用的潜在增强和在循环中半衰期的延长，无疑使它们比双链尿激酶和原型尿激酶原在治疗上有优越性。
方法诱变用已发表的方法(ManiatisT.，FritschE.F.和SambrookJ.，MoleculorClonging，实验指导，ColdSpringHarbour1982)Weizmann研究所(以色列)对人前尿激酶原的基因密码进行了克隆化。为完成所要的诱变，采用方便的限制性内切段并在M13质粒载体上进行亚克隆化(ZollerM.J.和SmithM.用M13-衍生载体进行寡核苷酸引导诱变在任何DNA片段上产生点突变的一种有效而通用的方法，《核酸研究》，101，6487，1982)。
用已发表的方法生长单链形式的重组质粒载体20ng;这些M13单链DNA在10毫摩尔浓度的Tris-HCl(PH为7.5)，0.1毫摩尔浓度EDTA，50毫摩尔浓度Na Cl液中于95℃加热5分钟然后逐步冷却至室温得普通寡核苷酸。然后顺序加入下列组分ATP至浓度为0.4毫摩尔浓度，dCTP，dGPT，dTTP至0.12毫摩尔浓度，dATP至0.04毫摩尔浓度，1单位的大肠杆菌多聚酶I的Klenow片段和0.5单位的T4 DNA连接酶(Boenringer Mannheim)。最后加入浓度为35毫摩尔浓度Tris-HCl(PH为7.5)，0.1毫摩尔浓度EDTA，6毫摩尔浓度MgCl2，0.006毫摩尔浓度DTT的50微升溶液。在15℃下孵育12小时后，按已知的方法(Zoller M.J.和Smith M.，用M13衍生载体进行寡核苷酸引导的诱变在任何DNA片段上产生点突变的一种有效而通用的方法，《核酸研究》，101，6487，1982)用所得DNA横切大肠杆菌JM101细胞。
用于产生所需消除的寡核苷酸用含150βCi(α-32P)ATP(新英格兰核，6000Ci/毫摩尔)，70毫摩尔浓度的Tris-HCl(PH为8)，10毫摩尔浓度的MgCl2，5毫摩尔浓度的DTT和10单位的T4多聚核苷激酶(Boekringer Mannkeim)的50微升混合物于37℃下孵育30分钟。标记的寡核苷酸用于杂交产生突变的质粒DNA。
在10毫摩尔浓度Tris-HCl(PH为8)，其中含有3×ssc，0.1%SDS，10×Denhart′s和0.2毫克/毫升变性的鲑鱼精子DNA的溶液于65℃下杂交过夜。用0.4ssc，0.1%SDS在65℃下洗涤硝基纤维素过滤器30分钟，然后把过滤器用X光照射过夜。选出显示已杂交的段用美国M13序列分析仪进行Sanger二脱氧核苷酸序列分析。
用传统的表达质粒(ManiatisT.，FristschE.F和SammbrookJ.，《分子克隆》，一实验室手册，ColdSpringHarbour1982)，突变的基因表达于重组的大肠杆菌株上，然后进行培养生产所需分子。
重组分子的纯化破坏细菌后，重组产品在不溶组分内。用10毫摩尔浓度的Triis-HCl(PH为8.5)，0.1%Triton×100洗涤固体后，不溶物重新悬浮于含6摩尔浓度盐酸胍、0.1摩尔浓度β-巯基乙醇、10毫摩尔浓度的Tris-HCl(PH为8.5)的溶液中。此悬浮液然后在4℃下摇晃16小时并离心分离，上清液然后以1∶25的比例加入含10毫摩尔浓度Tris-HCl(PH为8)、2.5毫摩尔浓度尿素，8毫摩尔浓度EDTAD缓冲液中进行变构。此溶液在15℃下保持24小时。为降低离子强度，此变构缓冲液首先用超滤法浓缩10倍，然后用含10毫摩尔浓度Tris-HCl(PH为7.8)、2.5摩尔浓度尿素、8毫摩尔浓度EDTA的溶液稀释4倍。此重新激活的纤维蛋白溶解剂然后用快速琼脂糖(Pharmacia)进行离心交换色谱纯化，用(0至1摩尔浓度)氯化钠溶液线性梯度洗脱。收集活性组分，用交联葡聚糖G-25(Pharmacia)进行过滤脱盐(用50毫摩尔NH4HCO3溶液)，然后冷冻干燥。最后的纯度在80%至98%之间。
作为另一种方法，本发明的衍生物可以连同信号肽一起表达，从而从上清液内收集到衍生物。
尿激酶型酰胺解活性TC-UK(Serono;batch№870402)，尿激酶原(sero研究所，batchODO1205100)及本发明的低分子量衍生物(△125，△140，△150)的酰胺解活性用生色底物S-2444(Glu-Gly-Arg-ONa;KabiVitrum)确定。这种分析方法基于TC-UK内在的酰胺解活性及在纤维蛋白溶酶激活下这些单链尿激酶型纤维蛋白溶酶原活剂得到的酰胺解活性。尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂与生色底物作用所产生的DNA量在波长为410纳米时用分光光度法用微板读数仪(minireaclerⅡ，Dynatech)检测。
浓度逐渐增大的各纤维蛋白溶酶原激活剂(范围从1纳克至100微克/每毫升)在含0.05摩尔浓度Tris，0.038摩尔浓度NaCl，0.01%吐温80的Tris-HCl缓冲液(PH为8.8)在纤维蛋白溶酶存在下(12.5微克/毫升)于37℃孵育15分钟，使其活化。同时，也包括相应的对照组(无纤维蛋白溶酶活化)。孵育后，取各活化液20微升加入含0.25毫克/毫升S-2444和100KIU/毫升aprofinin的含底物的180微升Tris-HCl缓冲液(PH为8.8)中。
这些混合物在37℃下继续孵育30分钟。加入50微升50%的乙酸水溶液中止反应。
采用相同的方法，参考从P.J.Gaffney博士(国家生物标准研究所，英国伦敦)得到的“制备尿激酶国际参考标准”建立校准曲线。
对每一产品，都通过上述校准曲线把吸光密度结果转化成IU/毫升。
通过测量各尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂制品用Bio-rad产的Bradford微量分析仪(标准Ⅱ，BSA)测定蛋白含量后计算出其特异性活性(IU/毫克蛋白)。S-2444试验和蛋白分析已有描述(Pannell，R.，和Gurewich.，V.，单链或双链尿激酶对纤维蛋白溶酶原的激活作用。A.单链尿激酶具有低的催化活性(尿激酶原)的论证，blood，69，№1，22，1987;Bradford，M.M.，一种用蛋白染色原理测定微克级蛋白质快速而灵敏的定量方法。Anal.Biochem.，72，248，1976)。
肝素中的尿激酶原型的酰胺解活性将原型尿激酶原(终浓度1000IU/ml)和新尿激酶原衍生物△125(终浓度1000IU/ml)的0.05MTris-HCl缓冲液(PH为7.4，含0.038MNaCl和0.01%Tween80)在肝素(浓度0.001-10IU/ml)存在或不存在下于37℃用血浆(终浓度10mg/ml)处理。在不同的时间间隔(5，10，15分钟)，除去等分试样并用已述的产色素的底物S-2444测量产生的双链尿激酶原型酰胺解活性。
尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的栓溶活性(Matsuo.O.，Ryken，D.C.，和Collen.D.，体外组织纤维蛋白溶酶原和尿激酶的相对溶解纤维蛋白原、溶解纤维蛋白和溶解血栓作用的比较。Thromb.Haemost.，45 25，1981)。
在4℃下通过对血样(收集于10毫摩尔浓度的柠檬酸三钠中于3000转下离心分离10分钟得到含血小板少的正常血浆(PPP)。
含有125I标记的人纤维蛋白原的加入柠檬酸盐的可分量入PPP(0.5毫升)通过加入CaCl(最后浓度为25毫摩尔浓度)和人凝血酶(最终浓度为2NIH/毫升)而成栓。混合物抽吸至硅管(内径为4毫米)中，然后在37℃5下成栓30分钟。将管切成1.5厘米的小段。栓倾于Petri盘中于室温下用0.15摩尔浓度NaCl液以不同方式洗涤5分钟。
放射性同位素记数后，栓立刻于37℃下在含2毫升PPP和50微升含0.05摩尔浓度Tris-HCl(PH为7.4)、0.038摩尔浓度NaCl和0.01%吐温80的溶液中孵育。
加入尿激酶类纤维蛋白溶酶原激活剂溶液，(当为尿激酶原、△125，△140，△150时，最终浓度为150IU/毫升;当TC-UK1米最终浓度为50IU/毫升)或缓冲液(Tris-HCl为0.05摩尔浓度，NaCl为0.038摩尔浓度和0.01%Tween80，PH为7.4)。
在37℃下孵育4小时后通过三份样品的从血栓释至血浆介质中的放射性同位素的量计算栓溶程度。结果用基线值(无纤维蛋白溶解剂)的百分比表示。
尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的稳定性。
TC-UK(50IU/毫升)，尿激酶原和其低分子量衍生物(150IU/毫升)在人普通含拧酸盐的PPP中室温下孵育24小时。然后，加入新制备的I标记的人血栓并用前述方法测量栓溶程度(Matsuo，O.，Ryken，D.C.，和Collen，D.，体外组织纤维蛋白溶酶原和尿激酶的相对溶解纤维蛋白原、溶解纤维蛋白和溶解血栓的作用比较。Thromb.Halmost.，45，225，1981)。
血浆纤维蛋白原水平。
125I标记的人血栓与各个尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂在37℃下孵育4小时后，收集血浆组份(50微升为一份)并用纤维蛋白原-纤维蛋白聚合试验(Vermylen，C.，De Vreker，R.，和Verstraete，M.，纤维蛋白原的快速酶法测定纤维蛋白聚合时间的酶测定方法(FPT试验)、(Clin.Chim.Acta，8，418，1963)测定其纤维蛋白原的含量。
药代动力学研究使用体重在150-200克的雄性正常大鼠(SpragueDawley;CharlesRiuer)。
所有大鼠禁食过夜，实验用时当天用戊巴比妥(50毫克/公斤，肌肉注射)麻醉。原型尿激酶原和新低分子量尿激酶原衍生物△125单剂量80.000IU/公斤静脉注射(尾部血管)。对照组注射盐水。注射后于0(注射前)，0.5，1，2，5，10，20，30分钟从腹部主动脉取血样并加入拧酸酸三钠(最终浓度为0-0.11摩尔/升)抗凝。每一样品、每一时间间隔至少包括3只大鼠。血样离心分离(200xg.;15分钟，4℃)，血浆用纤维蛋白一板方法(AtrupT.和Muellertz，S.，Arch.Biochem.Biophys.，40，346-351，1952)测定优球蛋白部分的溶解纤维蛋活性并用原型尿激酶原内标样品校准的酶连接的免疫吸附分析(Elisa)测定尿激酶相关抗原的水平(Grondahl，HansenJ.，AgerlinN.，Munkholm，LarsenP.，BachF.，NielsenL.S.，DcmbernowskyP.和DanoK.，尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的灵敏而专一的酶连接的免疫吸附分析及其在乳腺癌病人血浆中的应用，J.Lab.Clin.Med.，111，1，42-51，(1988)。
表1低分子量尿激酶原衍生物的尿激酶型酰胺解活性分子酰胺解活性(i.U/毫克)＊不含纤维蛋白溶酶含纤维蛋白溶酶△125测不出96000△140测不出85000△150测不出105000pro-UK测不出98000TC-UK128000128000＊在纤维蛋白溶酶(12.5μg/ml)处理前和处理后尿激酶酰胺解活性用生色底物S-2444测定(Pannell，R.，和Gurewich，V.，单链或双链尿激酶对纤维蛋白溶酶原的激活作用。A.单链尿激酶具有低的催化活性(尿激酶原)的论证，Blood，69，№1，22，1987)。
尿激酶原及其低分子量衍生物及人TC-UK的特异性活性的测定，参考从P.J.Gaffney博士(国家生物标准研究所，伦敦)得到的“制备尿激酶国际参考标准”建立标准曲线。
表2低分子量尿激酶原衍生物的溶解纤维蛋白和溶解纤维蛋白原活性分子血浆中125I标记基底体积的纤 24小时孵育后血栓的溶解活性维蛋白原水平栓中125I标记栓(用百分数)(占百分数)解活性的稳定性△125958590△140859090△1501005085pro-UK1008580TC-UK100100
权利要求
1.一个单链构型的至少含有完整尿激酶原氨基酸序列163至411的低分子量人尿激酶原衍生物。
2.一个单链构型的至少含有完整尿激酶原氨基酸序列151至411的低分子量人尿激酶原衍生物。
3.权利要求1和2中的一个衍生物，其中不存在位于完整尿激酶原的氨基酸的48-135序列Kringle区域。
4.权利要求1至3中任何一项中的一个衍生物，其中至少不含有位于氨基酸序列11-47的受体结合区域或细胞结合区域。
5.权利要求2中的一个衍生物，其中完整尿激酶原氨基酸序列1-10与序列136-411相联。
6.权利要求2中的一个衍生物，其中含完整尿激酶原氨基酸序列141-411。
7.权利要求2中的一个衍生物，其中含完整尿激酶原氨基酸序列151-411。
8.权利要求1中一个衍生物，其中含完整尿激酶原氨基酸序列163-411。
9.上述权利要求中任何一项中的一个衍生物，其氨基端加一个蛋氨酸残基。
10.上述权利要求中任何一项中基一个衍生物，其至少接一个糖苷侧链。
11.构成蛋白质的上述权利要求中任何一项中的一个衍生物由氨基酸缺失、取代或插入得到，再含有至少一个任何形式的氨基酸序列。
12.用纤维蛋白溶酶处理上述任何权利要求中的衍生物所得的一个低分子量衍生物。
13.由图1所描述的任何一个低分子量衍生物。
14.由上述权利要求中任何一项的衍生物与适于药用的载体组成的一个药用组合物。
15.权利要求1-13中的任何一个衍生物作为溶血拴剂。
16.利用权利要求1-13中的任何一项中的衍生物生产溶血拴剂。
17.权利要求1-13的任何一个衍生物的DNA序列密码。
18.一个生产权利要求17中DNA序列的方法，其中包括部位特异性诱变人尿激酶原基因的步骤。
19.权利要求18中的方法，其中采用不含所要去除序列的合成寡脱氧核糖核苷酸来完成部位特导性诱变，并用标记挽救技术(marker rescue technique)来完成。
20.一个权利要求17中的DNA序列的表达载体。
21.根据权利要求20由载体转变的一个宿主微生物，其中还含有助催化剂Ptrp和质粒MS-2的Shine-Dalgarno序列。
全文摘要
低分子量尿激酶原衍生物及含有它们的药用组合物。
单链构型的至少含有完整尿激酶原氨基酸序列163—411的人尿激酶原低分子量衍生物。
较好的是，衍生物不含Kiangle区域、受体结合区域或细胞结合区域的氨基酸序列。
这些衍生物可与适于药用的载体混合制剂。这些制剂具有溶解血栓的作用。
文档编号C12N9/72GK1037360SQ8910235
公开日1989年11月22日 申请日期1989年4月18日 优先权日1988年4月18日
发明者安娜·布兰达扎, 杰克兰·兰森, 盖·玛祖, 波罗·萨明托斯 申请人:法米塔利亚·卡洛·埃巴有限责任公司