专利名称：尿激酶生产方法
技术领域：
本发明涉及以工业规模精制人尿而制取高纯度尿激酶的方法。更具体地讲，从含尿激酶的人尿中，以氯化锌或硫酸铜为主要成分，沉淀出尿激酶。
尿激酶为人尿中以约30-80g/l存在的一种酶，可通过血纤维蛋白溶酶原转换成活性血纤维蛋白溶酶的作用而溶解血管内的凝固血栓。数十年来，精制尿激酶一直用于治疗因血管内形成血栓而导致的心肌梗塞，脑中风等疾病。
以前，为了从人尿中提取尿激酶，第一步的高浓缩方法被认为是最重要的过程，而吸附剂则使用硫酸钡，硅胶，硼润土，沸石，羟基磷灰石，磷酸纤维素，控制孔径玻璃(CPG-10)等，大部分操作既复杂，回收率又低，溶解后的变性也大，因此在工业上的应用受到许多限制。而且，就用重金属作吸附剂的蛋白质沉淀方法而言，虽然1920年代就已有报告，但在工业上的应用都很少。最近，Zawarski为回收重组蛋白质，建议使用锌(见P.G.Zawarski and G.S.Gill，Anal.Biochem.173，440(1988))。
但是，用锌的上述方法不过是使从少量培养液中分泌出的重组蛋白质部分沉淀，因此工业上强烈要求开发一种高效尿激酶生产方法。
为了解决上述各种问题，本发明人进行了广泛的研究，结果发现，采用氯化锌或硫酸铜作沉淀剂，用适当溶液回收尿激酶后，直接进行亲和性色谱分析，即可迅速，简便，高效率地生产出尿激酶，从而完成了本发明。
本发明目的是提出高纯度精制尿激酶生产方法。
以下详述本发明。
人尿中加碱或碱性水溶液调节至pH7.5-8.0，放置后尿中大部分固体成分沉淀出来，然后滤出上层清液，为使氯化锌或硫酸铜充分溶解于其中可用盐酸等酸溶液调至pH4-6之后添加氯化锌或硫酸铜，使其浓度保持在1-2mM。此时，添加了氯化锌或硫酸铜的人尿中含有的组氨酸残基与露出的蛋白质结合，以水溶液形式存在。如用氢氧化钠水溶液将其pH调为中性，则锌离子或铜离子就会形成复合体而沉淀出来，同时也使蛋白质沉淀出来。图2和3所示，在氯化锌或硫酸铜达到1-2mM的低浓度状态下，尿激酶可选择性沉淀，相反，占人尿蛋白质80-95%的清蛋白要在10mM以上的浓度下才会沉淀，因此用氯化锌或硫酸铜进行尿激酶沉淀不仅具有浓缩效果，而且具有精制效果。使前述形成沉淀的溶液离心分离而回收沉淀物，再用高浓度EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)溶解，可使其完全溶解。此时，作为溶解使用的EDTA溶液在pH7.0-8.0之间使用，而且其体积比氯化锌或硫酸铜处理所得沉淀物大4倍，故若充分搅拌，则可达到95%以上的回收率。
最近，日本化学制品公司，丙烯腈公司等皆有约90%溶解回收率的报告(参照南朝鲜专利公告第77-49号)，但其价格高，且溶解所用强碱会使尿激酶活性发生变化。而本发明所用EDTA不仅对尿激酶活性完全没有影响，而且可使尿激酶比活性度比原尿提高约20倍，纯度则可达每mg总蛋白质1000IU值。
由于以上所述沉淀和部分精制步骤只需在反应槽内进行1小时，工艺简单，而且经济，回收率和精度均很高。
上述EDTA溶液溶解的尿激酶呈水溶液状态，若放在低温下，则再沉淀出对尿激酶活性完全没有影响的尿素等固体成分。可离心分离除去沉淀物，再将上层清液小心倾倒在亲和性柱上。该亲和性柱上使用与单一抗体结合的琼脂糖(セファロ-ズ)及联苯胺结合的琼脂糖。在精制程度和回收率方面考虑，用琼脂糖效果好，工业处理100001以上人尿时，应用单一抗体的免疫亲和性柱要受到各种限制，如用于工业生产规模时，必须用数十克单一抗体，从技术和成本上讲均不理想，而且即使单一抗体在载体上固化，也会再度混入分离后的制品中的缺点等，由于不方便，所以特别希望用联苯胺-琼脂糖亲和性柱色谱法完成最终精制过程。
据报告，除了尿激酶以外，联苯胺-琼脂糖还对数种丝氨酸蛋白酶(セリンフロテア-ゼ)具有亲和性，而在本发明中，已发现可通过调节氯化锌或硫酸铜的浓度，而选择性地分离这些丝氨酸蛋白酶。
通过上述用联苯胺-琼脂糖进行的精制过程，可使尿激酶的比活性度高达每mg总蛋白质约123000IU，可得到分子量大部分为53000的高纯度尿激酶。这里，比活性度的测定可用公知的尿激酶活性测定法(参照Astrupetal.Arch.Biochem.Biophys.40，346(1952))，其中由定量测定所得蛋白质量而得比活性度(参照Bradford(1976)Anal.Biochem.72，248)。
以下举例详述本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1(确定氯化锌浓度)将5N氢氧化钠水溶液加在1000升新鲜人尿中，调为pH8.5后放置1小时。离心分出沉淀，然后得到上层清液，再加入5N盐酸调为pH4.5。之后加入氯化锌，使此溶液中各5ml溶液的氯化锌最终浓度分别达到0mM，1mM，5mM，10mM，25mM和50mM，再加5N氢氧化钠水溶液使溶液达到pH7，放置30分钟后用蛋白定量测量法求得沉淀物和滤液中的蛋白含量。结果列于表1并示于图2。
表1(根据氯化锌浓度测得人尿中蛋白质含量(%))氯化锌浓度(mM) 0 1 5 10 25 50蛋白质上层清液 100 99 96 84 20 1沉淀物 0 1 4 16 80 99
注1)(%)表示原尿中尿激酶活性以100%计。
2)蛋白测量法按上述Bradford提出的方法进行。
实施例2(根据氯化锌浓度形成沉淀物重量)除了将氯化锌最终浓度保持为1mM，2mM，3mM，4mM和5mM之外，按前述实施例1进行操作而得到的沉淀经连续离心分离法得到(流速81/分)，重量如下表2和图4所示。
表2氯化锌浓度 1 2 3 4 5(mM)沉淀重量(kg) 0.3 1.1 2.1 5.0 9.6实施例3向新鲜人尿1001中加入5N氢氧化钠水溶液，调为pH8.5后放置1小时，形成沉淀。向离心分离得到的上层清液中加5N盐酸，调为pH4.5，然后加氯化锌并使其浓度保持在2mM。之后，加5N氢氧化钠水溶液，使溶液调为pH7，放置30分钟而形成沉淀。再进行高速离心分离而除去上层清液，回收沉淀物，用4倍EDTA溶解后4℃放置约1小时，其它固体成分再次沉淀出来。上层清液回收后放在联苯胺-琼脂糖柱(5cm×20cm)上，用0.1M甘氨酸-HCl(pH3.0)溶出。用吸光器(Pharmacia公司制品)在280nm上测定所得各部分吸光度，其中70-100部分显示出高吸光度和比活性度，如
图1所示。图1中，实线表示蛋白浓度，虚线表示尿激酶活性。
上述实施例所生产的尿激酶量及收率列于下表3。
表3试样 工艺阶段 体积或量 非活性尿 收率 精制度(IU/mg)人尿 原尿 10001 80 100 1沉淀物 氯化锌沉淀 1kg - 99 -溶出物 EDTA溶出液 41 1774 92 22溶出液 联苯胺-琼脂糖柱 0.121 123000 66 1540
实施例4向1001新鲜人尿中添加作为蛋白质分解酶抑制剂的抑肽酶，收取后，每阶段添加抑肽酶使浓度达到10KIU/ml，再按实施例3精制单链粗尿激酶(プロゥロキナ-ゼ)。在80%的还原条件下，可得单链分子量为53000的经抑肽酶处理而精制的尿激酶。为精制纯单链尿激酶，可在DTT(二硫苏糖醇)处理后通过FPLC Superose 12柱精制得单链分子量53000道尔顿的蛋白质。
结果列于下表4表4试样 工艺阶段 总体积 非活性度 收率 精制度(IU/mg)(%)人尿 原尿 1001 80 100 1沉淀物 氯化锌沉淀 100kg - 99 -溶出物 EDTA溶出物 0.41 1774 92 22溶出液 联苯胺柱 0.012 123000 66 1540粗尿 FPLC 0.009 144000 20 1800激酶 Suprose 12柱实施例5(根据氯化锌浓度形成的蛋白质沉淀与尿激酶活性沉淀比较试验结果)除了将氯化锌最终浓度保持在0mM，1mM，5mM，10mM，25mM和50mM之外，其它操作同上述实施例3，根据上述氯化锌浓度变化而形成沉淀物中蛋白质重量和尿激酶活性度列于下表5并示于图3。
表5氯化锌浓度(mM) 0 1 5 10 25 50蛋白质(%) 0 1 4 16 80 99尿激酶活性度 0 80 96 99 100 100实施例6将1001新鲜尿液按实施例3精制，其中使用单一细胞群抗体-琼脂糖代替联苯胺-琼脂糖，结与实施例3几乎相同。
实施例7将1001新鲜尿液按实施例3用氯化锌处理，使活性尿激酶沉淀之后，以1M甘氨酸(pH9.0)代替EDTA作溶液。以沉淀物重量的4倍处理1M甘氨酸(pH9.0)溶液，尿激酶溶出结果与EDTA相同。
实施例8在实施例7中，用1M柠檬酸盐(pH9.0)代替1M甘氨酸(pH9.0)，从沉淀物中溶出尿激酶的结果是，溶出率与用EDTA溶出或1M甘氨酸溶出结果几乎相同。
实施例9将5N氢氧化钠水溶液加入1001新鲜人尿中，调为pH8.5后，常温放置2小时。将上层清液移送到新容器后，加硫酸铜使最终浓度达到2mM，然后搅拌30分钟。再用连续离心分离机分离后回收沉淀物，之后用4倍的EDTA溶液溶解。
以上所得尿激酶回收率约90%，并且可如同实施例3完成完全精制工艺，结果列于下表6。
表6试样 工艺阶段 体积 非活性度 收率 精制度(IU/mg) (%)人尿 原尿 1001 80 100 1沉淀物 硫酸铜沉淀 0.7kg - 97 -溶出物 EDTA溶出物 2.81 100 90 20如上述实施例所示，本发明方法可用人尿大量生产高纯度尿激酶，而且是迅速又经济的回收方法。
图1示出了实施例1中柱色谱各部分吸光度和活性度。
图2示出了根据蛋白定量法所吸水各氯化锌浓度所形成的沉淀。
图3示出了根据氯化锌浓度所形成沉淀物中蛋白质与尿激酶活性度之间的相互关系。
图4示出了10001尿中根据氯化锌浓度形成沉淀中固体成分重量。
权利要求
1.尿激酶生产方法，其特征在于，以1-2mM氧化锌或1-2mM硫酸铜作为主要成分，从人尿中沉淀尿激酶，沉淀所得尿激酶用EDTA溶液按公知方法溶出，再用联苯胺-琼脂糖亲和性柱精制。
2.权利要求1所述的生产方法，其特征在于，用单一细胞群抗体-琼脂糖柱代替联苯胺-琼脂糖柱。
3.权利要求1所述的生产方法，其特征在于，用甘氨酸和柠檬酸盐溶液代替EDTA溶出沉淀物内的活性尿激酶。
4.权利要求1所述的生产方法，其特征在于，精制生产尿激酶以外的粗尿激酶。
5.权利要求1所述的生产方法，其特征在于，以浓度为1-2mM的硫酸铜代替氯化锌。
全文摘要
尿激酶生产方法，其特征在于，以1-2mM氧化锌或1-2mM硫酸铜作为主要成分，从人尿中沉淀尿激酶，沉淀所得尿激酶用EDTA溶液按公知方法溶出，再用联苯胺-琼酯糖亲和性柱精制。
文档编号C12N9/72GK1053813SQ9110070
公开日1991年8月14日 申请日期1991年2月5日 优先权日1990年2月5日
发明者郑光会, 禹汉祥, 申光淳, 白承福 申请人:牧岩生命工学研究所