喹唑啉化合物在调控神经干细胞增殖和分化中的应用的制作方法

本发明属于药物化学领域，具体地，涉及喹唑啉化合物在调控神经干细胞增殖和分化中的应用。

背景技术：

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)具有自我更新和多向分化潜能，能分化为神经元、少突胶质细胞以及星形胶质细胞等。神经干细胞的分化技术为中枢神经系统损伤、神经系统变性疾病或遗传性代谢疾病、神经退行性疾病等疾病提供了新的治疗策略。因此调控神经干细胞向神经元的增殖和分化成为神经科学研究的热点。

目前，国内外通用的体外诱导神经干细胞增殖分化的方法是给予丝裂原，如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及表皮生长因子(epidermalgrowth factor，EGF)等，干预维持培养的神经干细胞，使其处于增殖状态，除去丝裂原并添加含胎牛血清的培养基后，诱导NSCs进行分化，但这种方法较为繁琐，神经干细胞难以获得和培养，而且所得到的分化细胞主要是胶质细胞，神经元比例较低。

骨髓基质细胞(Bone Marrow stroma cells，BMSCs)是一类具有自我更新能力的多潜能干细胞，在一定条件下可诱导分化为神经干细胞(neural stem cells,NSCs)。相比与神经干细胞，骨髓基质细胞更易获取和调控分化，组织相容性好。国内外报道先后报道利用小分子化合物诱导骨髓基质细胞分化获得神经元细胞。所使用的小分子有叔丁基对羟基茴香醚(Butylatedhydroxyarisol，BHA)、PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)/AKT抑制剂LY294002等。但这些诱导剂的诱导率还有待提高，且机理尚不明确。

因此，本领域迫切需要开发一种能够高效调控神经干细胞增殖、分化，用于修复神经损伤和治疗神经退行性疾病、以及用于神经干细胞移植治疗神经系统疾病的药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够高效调控神经干细胞增殖、分化，用于修复神经损伤和治疗神经退行性疾病、以及用于神经干细胞移植治疗神经系统疾病的药物。

本发明第一方面提供了一种式I化合物、其光学异构体、水合物、溶剂化物、其前药或其药学上可接受的盐，

式中，

R₁和R₂各自独立地选自下组：

(i)H；

(i i)取代或未取代的C₁-C₁₀烷基、取代或未取代的C₂－C₁₀链烯基、取代或未取代的C₂-C₁₀链炔基、取代或未取代的C₃-C₁₀环烷基；其中所述的取代为具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀卤代烷基、C₁-C₁₀卤代烷氧基、-OH、-CN、硝基、C₁－C₃羧基、-R₄-R₅基团、－NR₆(R₇)、未取代的苯基、或被C₁-C₃烷基或卤素取代的苯基；

(iii)取代或未取代的C₅-C₂₀芳基、取代或未取代的C₃-C₂₀杂芳基、取代或未取代的5-20元杂环基、取代或未取代的C₁₀－C₃₀的稠环基；其中，所述杂芳基或杂环基含有1至3个选自N、O、S的杂原子，并且所述的取代为具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀卤代烷基、C₁-C₁₀卤代烷氧基、-OH、-CN、硝基、－NR₆(R₇)；

其中R₄选自未取代的或卤代的C₁－C₈亚烷基，而R₅选自未取代的或卤代的C₅－C₂₀芳基；R₆和R₇各自独立地为氢、未取代或卤代的C₁-C₁₀烷基、未取代或卤代的C₂-C₁₀链烯基、未取代或卤代的C₂-C₁₀炔基；

或者，R₁与R₂可以和相连的N原子共同形成含有至少1个氮原子的、取代或未取代的3－8元杂环基，并且所述的3－8元杂环基中共含有1-3个选自N、O、S的杂原子，其中所述的取代为具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀链烯基、C₂-C₁₀炔基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀卤代烷基、C₁-C₁₀卤代烷氧基、-OH、-CN、硝基、-NH₂、C₁－C₃羧基；

以及R₃选自下组：H、取代或未取代的C₁-C₁₀烷基、取代或未取代的C₂－C₁₀链烯基、取代或未取代的C₂-C₁₀炔基、取代或未取代的C₃-C₁₀环烷基；其中所述的取代为具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀卤代烷基、C₁-C₁₀卤代烷氧基、-OH、-CN、-NH₂。

在另一优选例中，所述的卤素包括F、Cl、Br或I。

在另一优选例中，所述的卤素为F或Br。

在另一优选例中，所述化合物具有式Ia所示的结构：

式中，R₁和R₂的定义如上所述。

在另一优选例中，R₁、R₂各自独立地选自下组：

(i)H；

(ii)取代或未取代的C₂-C₈烷基、取代或未取代的C₂－C₈链烯基、取代或未取代的C₂-C₈炔基、取代或未取代的C₄-C₈环烷基；其中所述的取代为具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₁-C₃卤代烷基、C₁-C₁₀卤代烷氧基、-OH、-CN、硝基、C₁－C₃羧基、-R₄-R₅基团、－NR₆(R₇)、未取代的苯基、或被C₁-C₃烷基或卤素取代的苯基；

(iii)取代或未取代的C₅-C₁₀芳基、取代或未取代的C₃-C₁₀杂芳基、取代或未取代的5-10元杂环基、取代或未取代的C₁₀－C₂₀的稠环基；其中，所述杂芳基或杂环基含有1至3个选自N、O、S的杂原子，并且所述的取代为具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₁-C₃卤代烷基、C₁-C₁₀卤代烷氧基、-OH、-CN、硝基、－NR₆(R₇)；

其中R₄选自未取代的或卤代的C₁－C₆亚烷基，而R₅选自未取代的或卤代的C₅－C₁₀芳基；R₆和R₇各自独立地为氢、未取代或卤代的C₁-C₆烷基、未取代或卤代的C₂-C₆链烯基、未取代或卤代的C₂-C₆炔基；

或者，R₁与R₂可以和相连的N原子共同形成含有至少1个氮原子的、取代或未取代的3－8元杂环基，并且所述的3－8元杂环基中共含有1-2个选自N、O、S的杂原子，其中所述的取代为具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C₁-C₆烷基、C₂-C₆链烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基、C₁-C₆卤代烷氧基、-OH、-CN、硝基、-NH₂、C₁－C₃羧基。

在另一优选例中，R₁选自下组：H、甲基、乙基、苯基、或其组合。

在另一优选例中，R₂选自下组：H、甲基、乙基、丙基、丁基、或其组合。

在另一优选例中，R₁和R₂和相连的N原子共同形成吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、环己亚胺环、1,3-二氮杂卓环、或1,4-二氮杂卓环。

在另一优选例中，R₁、R₂、R₃为实施例中各具体化合物相对应的具体基团。

在另一优选例中，R₄、R₅、R₆、R₇为实施例中各具体化合物相对应的具体基团。

在另一优选例中，所述化合物为实施例中制备的各具体化合物，优选的化合物选自下组：

在另一优选例中，所述化合物选自下组：

本发明第二方面提供了一种式I化合物、其光学异构体、水合物、溶剂化物、其前药或其药学上可接受的盐的用途，用于制备药物或制剂，所述药物或制剂用于(i)治疗神经退行性疾病；(ii)修复神经损伤；和/或(iii)促进神经干细胞增殖。

在另一优选例中，所述药物或制剂还可用于(i)调控(包括上调或下调)nestin的表达；和/或(ii)促进神经干细胞向神经元和神经胶质细胞的分化。

本发明第三方面提供了一种药物组合物，包括：

(i)本发明第一方面所述的式I化合物，其光学异构体、水合物、溶剂化物、其前药或其药学上可接受的盐；和

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物含有治疗有效量或安全有效量的式I化合物，其光学异构体、水合物、溶剂化物、其前药或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述前药包括酯类化合物。

在另一优选例中，所述药物组合物中，含有0.0001-99wt％(较佳地0.01-90wt％，更佳地，0.1-80wt％)的组分(i)，以药物组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备神经干细胞增殖或分化的调控剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于(i)修复神经损伤；(ii)治疗和/或预防神经退行性疾病；和/或(iii)促进神经干细胞增殖。

在另一优选例中，所述神经退行性疾病选自下组：阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌肉萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、小脑萎缩症、多发性硬化症、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、或其组合。

本发明第四方面提供了一种式I化合物或其药学上可接受的盐的制法，包括步骤：

在惰性溶剂中，在碱的存在下，将化合物6和式II所示的胺进行反应，从而得到式I化合物；

各式中，R₁、R₂和R₃如本发明第一方面中所定义。

在另一优选例中，R₃为C₁-C₁₀烷基，如甲基。

在另一优选例中，所述惰性溶剂包括极性溶剂。

在另一优选例中，所述惰性溶剂选自下组：N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、四氢呋喃、或其组合。

在另一优选例中，所述碱选自下组：碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、氢化钠、氢氧化钠、氢化钠、三乙胺、二异丙胺乙基胺、或其组合。

在另一优选例中，所述胺选自下组：正丁胺、二乙基胺、吡咯烷、哌啶、吗啉、苄基胺、邻位取代苯胺、间位取代苯胺、对位取代苯胺、或其组合。

在另一优选例中，所述化合物6由如下方法制备：

(a)在碱存在下，将化合物5与三氯氧磷进行反应，从而得到化合物5a；

(b)将化合物5a与氨水进行反应，从而得到化合物6；

各式中，R₃如本发明第一方面中所定义。

在另一优选例中，R₃为C₁-C₁₀烷基，如甲基。

在另一优选例中，在步骤(a)中，所述碱选自下组：N,N-二甲基苯胺。

在另一优选例中，在步骤(a)中，所述反应温度40－150℃，更佳地，50-140℃，更佳地，90-110℃。

在另一优选例中，在步骤(a)中，所述反应时间0.1－15h，较佳地，1-10h，更佳地，1-4h。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应温度0℃－150℃，较佳地，10-100℃，更佳地，15-50℃。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述反应时间0.1-15h，较佳地，1-13h，更佳地，1-10h。

本发明第五方面提供了一种中间体化合物，所述中间体化合物选自下组：

本发明第六方面提供了一种用于治疗神经退行性疾病的方法，所述方法包括:

向所需对象施用本发明第一方面所述的式I化合物或本发明第三方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述对象包括人。

在另一优选例中，所述对象包括非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠。

在另一优选例中，施用剂量为10-10000mg/kg/天，较佳地，50-10000mg/kg/天，更佳地，100-1000mg/kg/天。

在另一优选例中，施用频率为1-5次/天，较佳地，1-2次/天。

在另一优选例中，施用包括一个或多个周期，各周期为2-30天，较佳地，3-7天。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了双报告基因平台的筛选结果。

图2显示了对双报告基因筛选平台筛选的结果进行验证。

图3显示了化合物Yhhu-3477、Yhhu-3481促进神经干细胞向神经元分化，使Tuj-1阳性细胞比例增加。

图4显示了化合物Yhhu-3477和Yhhu-3481可剂量依赖性地增加Tuj-1的表达。

图5显示了化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792可以提高Tuj-1和GFAP的表达水平。

图6显示了化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792促进神经干细胞的增殖。

图7显示了化合物Yhhu-3792促使BrdU阳性细胞比例增加。

图8显示了化合物Yhhu-3792促进BrdU+/Tuj-1+及BrdU+/GFAP+细胞数量增加。

图9显示了化合物Yhhu-3792促进Notch-1表达。

图10显示了化合物Yhhu-3792使核内NICD增加。

图11显示了化合物Yhhu-3792对SHH信号通路无明显影响。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，合成了一系列的喹唑啉化合物，所述的化合物能够高效调控神经干细胞增殖、分化，用于修复神经损伤和治疗神经退 行性疾病、以及用于神经干细胞移植治疗神经系统疾病。在此基础上，本发明人完成了本发明。

基团定义

如本文所用，术语“取代或未取代的”指所述基团可以是未取代的，或者所述基团中的H被一个或多个(如1-10个，较佳地1-5个，更佳地1-3个，最佳地，1-2个)取代基所取代。

如本文所用，所述的“取代”或“取代的”指所述基团具有一个或多个(较佳地1-6个，更佳地1-3个)选自下组的取代基：卤素、羟基、-NH₂、硝基、-CN、C₁-C₄烷基、C₁-C₄卤代烷基、C₁-C₄烷氧基、C₃-C₆环烷基、C₁-C₃羧基、C₂-C₄链烯基、C₂-C₄炔基、苯基、苄基。

如本文所用，术语“C₁-C₁₀烷基”是指具有1-10个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团；其中，术语“C₁-C₃烷基”是指具有1-3个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、或类似基团。

如本文所用，术语“C₃-C₁₀环烷基”指具有3-10个碳原子的环状烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、或类似基团。

如本文所用，术语“C₁-C₁₀亚烷基”指具有1-10个碳原子的二价烃基，如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、或类似基团。

如本文所用，术语“C₂-C₁₀链烯基”或“C₂-C₈链烯基”分别指具有2-10个或2-8个碳原子的直链或支链的烯基，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、或类似基团。

如本文所用，术语“C₂-C₁₀链炔基”是指具有2-10个碳原子的直链或支链的炔基，例如乙炔基、丙炔基、或类似基团。

如本文所用，术语“C₂-C₈链炔基”是指具有2-8个碳原子的直链或支链的炔基，例如乙炔基、丙炔基、或类似基团。

如本文所用，术语“C₅-C₂₀芳基”指5至20个(较佳5-14个)碳原子的单价芳香族碳环基团，它具有单环(如苯基)或稠环(如萘基或蒽基)，如果连接点在芳香碳原上，稠环可能是非芳香性的(如2-苯并噁唑酮，2H-1,4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)。所述取代或未取代的C₅－C₂₀芳基选自下组：邻位取代苯基、间位取代苯基、对位取代苯基。优选的芳基包括苯基和萘基。该术语包括取代或未取代的形式，其中取代基的定义如上。所述取代苯基的取代基选自下组：卤素、羟基、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、三氟甲基、或其组合。

如本文所用，术语“C₅-C₂₀杂芳基”指具有5至20个碳原子和1至4个选自氧、氮和硫的杂原子的芳香基团，这样的杂芳基可以是单环的(如吡啶基或呋喃基)或稠环(如吲嗪基(indolizinyl)或苯并噻吩基)，其中，所述稠环可以是非芳香性的和/或含有一个杂原子，只要连接点是通过芳香性杂芳基的原子。优选地杂芳基包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、噻吩基和呋喃基。该术语包括取代或未取代的杂芳基。

如本文所用，术语“C₅-C₂₀杂环基”指饱和的、部分饱和的或不饱和的基团(但不是芳香性的)，具有单环或稠环(包括桥环体系和螺环体系，具有5至20 个碳原子和1至4个选自氮、硫或氧的杂原子，在稠环体系中，一个或多个环可以是环烷基、芳基或杂芳基，只要连接点通过非芳香性环。该术语包括取代或未取代的杂环基。

如本文所用，术语“卤素”是指氟、氯、溴、或碘，优选氟、氯和溴。

如本文所用，术语“卤代的”指被相同或不同的一个或多个上述卤原子取代的基团，可以部分卤代或全部卤代，例如三氟甲基、五氟乙基、七氟异丙基、或类似基团。

如本文所用，术语“C₁-C₃卤代烷基”是指氢被1个或1个以上的卤素取代的具有1-3个碳原子的直链或支链烷基，例如，卤代甲基、卤代乙基、卤代丙基、卤代异丙基、或类似基团，优选三氟甲基。

本发明的化合物可以含有一个或多个不对称中心，并因此以消旋体、外消旋混合物、单一对映体、非对映异构体化合物和单一非对映体的形式出现。可以存在的不对称中心，取决于分子上各种取代基的性质。每个这种不对称中心将独立地产生两个旋光异构体，并且所有可能的旋光异构体和非对映体混合物和纯或部分纯的化合物包括在本发明的范围之内。本发明包括化合物的所有异构形式。

本文中，术语“室温”指4-40℃，优选为20-25℃。

本发明的化合物

如本文所用，术语“本发明化合物”指通式I(或式Ia)化合物、其光学异构体、水合物、溶剂化物、其前药或其药学上可接受的盐。

典型地，本发明提供通式I化合物、其光学异构体、水合物、溶剂化物、其前药或其药学上可接受的盐。

式中，

R₁和R₂各自独立地选自下组：

(i)H；

(ii)取代或未取代的C₁-C₁₀烷基、取代或未取代的C₂－C₁₀链烯基、取代或未取代的C₂-C₁₀炔基、取代或未取代的C₃-C₁₀环烷基；其中所述的取代为具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀卤代烷基、C₁-C₁₀卤代烷氧基、-OH、-CN、硝基、C₁－C₃羧基、-R₄-R₅基团、－NR₆(R₇)、未取代的苯基、或被C₁-C3烷基或卤素取代的苯基；

(iii)取代或未取代的C₅-C₂₀芳基、取代或未取代的C₃-C₂₀杂芳基、取代或未取代的5-20元杂环基、取代或未取代的C₁₀－C₃₀的稠环基；其中，所述杂芳基或杂环基含有1至3个选自N、O、S的杂原子，并且所述的取代为具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀卤代烷基、C₁-C₁₀卤代烷氧基、-OH、-CN、硝基、－NR₆(R₇)；

其中R₄选自未取代的或卤代的C₁－C₈亚烷基，而R₅选自未取代的或卤代的 C₅－C₂₀芳基；R₆和R₇各自独立地为氢、未取代或卤代的C₁-C₁₀烷基、未取代或卤代的C₂-C₁₀链烯基、未取代或卤代的C₂-C₁₀炔基；

或者，R₁与R₂可以和相连的N原子共同形成含有至少1个氮原子的、取代或未取代的3－8元杂环基，并且所述的3－8元杂环基中共含有1-3个选自N、O、S的杂原子，其中所述的取代为具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀链烯基、C₂-C₁₀炔基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀卤代烷基、C₁-C₁₀卤代烷氧基、-OH、-CN、硝基、-NH₂、C₁－C₃羧基；

以及R₃选自下组：H、取代或未取代的C₁-C₁₀烷基、取代或未取代的C₂－C₁₀链烯基、取代或未取代的C₂-C₁₀炔基、取代或未取代的C₃-C₁₀环烷基；其中所述的取代为具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₀卤代烷基、C₁-C₁₀卤代烷氧基、-OH、-CN、-NH₂。

在另一优选例中，所述的卤素包括F、Cl、或Br。

在另一优选例中，所述的卤素为F或Br。

在另一优选例中，所述化合物具有式Ia所示的结构：

式中，R₁和R₂的定义如上所述。

在本发明所述的化合物有立体异构体存在的情况下，本发明包括化合物的所有立体异构体。

在本发明所述的化合物有互变异构体存在的情况下，本发明包括化合物的所有互变异构体。

本发明还包括所述化合物中的任何一个或多个氢原子被其稳定同位素氘取代而产生的氘代化合物。

本发明的中间体化合物

如本文所用，术语“本发明的中间体化合物”是指化合物2，3，4，5，5a,6，优选下述中间体化合物：

本发明化合物的制备方法

本发明提供了式I化合物的制备方法，本发明中的化合物可以通过多种合成操作容易地制备，这些操作是所属领域技术人员熟练掌握的。这些化合物的示例性制备方法可以包括(但不限于)下文所述的流程。

通常，在本发明的制备方法中，各反应大多在-20℃至160℃(或回流温度)(较佳地，-5℃至100℃，或0-80℃)下，进行一段时间(如0.1-72小时，较 佳地0.5-24小时)。

较佳地，本发明式(I)化合物可以通过以下方案及实施例中所述的示例性方法以及本领域技术人员所用的相关公开文献操作完成。

在具体操作过程中，可以根据需要对方法中的步骤进行扩展或合并。

方案(R₃＝C₁-C₁₀烷基，优选甲基)

其中，R₁和R₂如说明书中所定义。

步骤1中，在碱(如碳酸钾)存在下，在极性溶剂(如DMF、DMSO)中，化合物1与3-甲氧基苯酚在一定温度下(如90℃—100℃)进行亲核取代反应一段时间，形成化合物2。

步骤2中，在碱(如碳酸钾)存在下，在惰性溶剂(如DMSO)中，化合物2与过氧化氢在一定温度下(如20℃—40℃)进行反应一段时间，形成化合物3；

步骤3中，在酸(如盐酸)存在下，在惰性溶剂(如THF)中，化合物3在一定温度下(如40℃—60℃)经过水解反应一段时间，形成化合物4；

步骤4中，在惰性溶剂(如THF)中，化合物4与三光气在一定温度下(如65℃—70℃)进行环合反应一段时间，形成化合物5；

步骤5中，在碱(如N,N-二甲基苯胺)存在下,先将化合物5与三氯氧磷在一定温度下(如90℃—110℃)进行氯代反应一段时间，形成化合物5a，再将化合物5a与氨水室温反应一段时间，形成化合物6；

步骤6中，在惰性溶剂(如四氢呋喃)中，化合物6与式II所示的胺(在一定温度下(如130℃-160℃)进行反应一段时间，形式式I化合物。

本发明公开的式I化合物以及化合物的制备方法、药物组成和治疗方案，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它包含安全有效量范围内的活性成分，以及药学上可接受的载体。

本发明所述的“活性成分”是指本发明所述的通式I化合物、其光学异构体、水合物、溶剂化物、其前药或其药学上可接受的盐。

本发明所述的“活性成分”和药物组合物可用作神经干细胞增殖、分化的调控剂。在另一优选例中，用于制备用于修复神经损伤和治疗神经退行性疾病、以及用于神经干细胞移植治疗神经系统疾病的药物。在另一优选例中，所述神经退行性疾病选自下组：阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌肉萎缩性侧索硬化症。

“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有10-200mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片。

“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

本发明优选实施例的化合物可以作为单独活性药剂给药，也可以与一个或多个其它用于治疗神经退行性疾病的试剂组合使用。本发明优选实施例的化合物与已知的治疗剂组合使用也是有效的，目前已知的化合物和其它治疗神经退行性疾病的治疗剂的组合在优选实施例范围之内。基于药物的特殊性质和所涉及的疾病，本领域普通技术人员能够辨别有效的药剂组合。这种治疗神经退行性疾病的治疗剂包括(但不限于)如下：阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌肉萎缩性侧索硬化症等。优选实施例的化合物与治疗神经退行性疾病的治疗剂同时施用时也有效。

通常，优选实施例的化合物将以治疗有效量、通过具有类似作用的药剂的任意一种可接受的模式施用。优选实施例的化合物(即活性成分)的实际用量根据多个因素确定，如待治疗疾病的严重程度、患者的年龄和相对健康程度、被使用化合物的效力、施用的路径和形式，以及其他因素。该药物可一天施用多次，优选地，每天一次或两次。所有这些因素都在主治医生的考虑范围内。

优选实施例的目的，治疗有效剂量通常可以是对患者一次性施用或分次施用的每日总剂量，例如，每日约0.001至约1000毫克/公斤体重，优选地，每日约1.0至约30毫克/千克体重。单位剂量组合物(Dosage unit composition)可包含其剂量因数以形成每日剂量。剂型的选择取决于各种因素，例如给药模式和药物物质的生物利用度。通常，优选实施例的化合物可作为药物组合物通过以下任意一种路线给药：口服、全身给药(如透皮、鼻内或通过栓剂)、或肠外给药(如肌内、静脉内或皮下)。优选的给药方式为口服，可根据苦的程度调节方便的日剂量。组合物可采取的形式为片剂、丸剂、胶囊、半固体、粉剂、缓释制剂、溶液、悬浮液、酏剂、气雾剂或任何其他适当的组合物。另一种优选的施用优选实施例化合物的方式为吸入。这是一种将治疗剂直接运送给呼吸道的有效方法(参见，如美国专利号5,607,915)。

合适的药学上可接受的载体或赋形剂包括：如处理剂和药物运送改性剂和促进剂，诸如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、单糖、二糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、葡萄糖、羟丙基-B-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡、离子交换树脂等，及其任意两种或多种的组合。液体和半固体的赋 形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括石油、动物油、植物油或合成来源，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。优选的液体载体，特别是用于可注射溶液的载体，包括水、盐水、葡萄糖水性溶液和乙二醇。其它适宜的药学上可接受的赋形剂在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences),Mack Pub.Co.,新泽西(1991)有描述，通过引用纳入本文。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指通式I化合物的非毒性酸或碱土金属盐。这些盐可在最终分离和纯化通式I化合物时原位制得、或分别将合适的有机或无机酸或碱与碱性或酸性官能团反应制得。代表性的盐包括，但不限于：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、环戊烷丙酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘基磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、硫氰酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。此外，含氮的碱性基团可被如下试剂季铵盐化：烷基卤化物，如甲基、乙基、丙基、丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯；长链卤化物如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物如苄基和苯乙基溴化物等。由此得到水溶性或油溶性或可分散产品。可被用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的例子包括如盐酸、硫酸、磷酸的无机酸，和如草酸、马来酸、甲磺酸、琥珀酸、柠檬酸的有机酸。碱加成盐可在最终分离和纯化通式I的化合物时原位制得、或使羧酸部分分别与合适的碱(如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物，碳酸盐或碳酸氢盐)或氨、或有机伯、仲或叔胺反应制得。药学上可接受的盐包括，但不限于，基于碱金属和碱土金属的阳离子，如钠、锂、钾、钙、镁、铝的盐等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括，但不限于：铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。其它代表性的用于形成碱加成盐的有机胺包括二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。

如本文所用，术语“药学上可接受的前药”是指那些优选实施例的化合物的前药，在体内迅速转化为上述通式所示的母体化合物的化合物，例如在血液中水解。在“T.Higuchi和V.Stella，作为新型运送系统的前药(Pro-drugs as Novel Delivery Systems)，A.C.S.15Symposium Series的14卷”和“Edward B.Roche编，药物设计中的生物可逆载体(Bioreversible Carriers in Drug Design)，美国药学协会和Pergamon出版社，1987年”中提供了完整的讨论，这两者都引入本文作为参考。

神经干细胞标志性蛋白Nestin

本发明还提供了式I化合物在调控Nestin表达方面的应用。

Nestin是神经干细胞的标志性蛋白，与神经干细胞的增殖、分化密切相关。Nestin的上调和下调均能影响神经干细胞的增殖和分化。

在本发明中，大部分的化合物对Nestin的表达具有上调作用，只有少数化合物(如yhhu-3791和yhhu-3792)对Nestin的表达具有下调作用。

本发明的主要优点包括：

(1)提供一种结构新颖的通式I化合物；

(2)本发明的化合物可以作为高效的神经干细胞增殖、分化的调控剂；

(3)合成方法温和，操作简单易行，收率较高，易于衍生化，适合工业放大量生产；

(4)能够用于修复神经损伤、治疗神经退行性疾病、以及用于神经干细胞移植治疗神经系统疾病。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

制备实施例

实施例1化合物2的制备：

将化合物1(5g,28.1mmol)、3-甲氧基苯酚(3.39mL,30.9mmol)和碳酸钾(7.74g,56.1mmol)置于DMF(50mL)中搅拌，并升温至95℃，反应12小时，反应完全。将DMF蒸干后，加入水(80mL)稀释，并以乙酸乙酯(80mL×3)萃取。收集有机层后，蒸干，并以乙醚洗涤，所得固体即为化合物15.7g。产率：72％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ2.28(s,3H),3.80(s,3H),6.59(d,J＝8.53Hz,1H),6.62-6.69(m,2H),6.72-6.82(m,1H),7.26-7.33(m,1H),7.42(t,J＝8.39Hz,1H),7.67(br.s.,1H),8.10(d,J＝8.25Hz,1H).

实施例2化合物3的制备

将化合物2(5g,17.7mmol)、碳酸钾(0.37g,2.64mmol)加至25mL DMSO中搅拌。冰浴下，向该混合液中逐滴滴加过氧化氢水溶液(30％,4mL,35.4mL)，并在室温下反应过夜，即反应完全。加入水(80mL)稀释，并以乙酸乙酯(100mL×3)萃取。收集有机层，并以饱和亚硫酸钠水溶液(80mL)洗涤。蒸干有机层， 得化合物35.2g。固体，产率：98％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ2.21(s,3H),3.78(s,3H),5.89(br.s.,1H),6.73(ddd,J＝9.15,1.44,1.24Hz,1H),7.23-7.31(m,2H),7.35(t,J＝8.39Hz,1H),7.61(br.s.,1H),8.44(d,J＝8.53Hz,1H),11.77(br.s.,1H).

实施例3化合物4的制备

将3(5g,16.6mmol)溶于四氢呋喃(20mL)和盐酸水溶液(3N,20mL)的混合溶液中，50℃下搅拌6小时，反应完全。加入60mL水稀释，并用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至9，以二氯甲烷(80mL×3)萃取。收集有机层并蒸干，得到化合物43.4g。固体，产率：85％。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.78(s,3H),5.63(br.s.,1H),6.02-6.18(m,3H),6.42(dd,J＝8.25,1.10Hz,1H),6.55-6.66(m,2H),6.67-6.75(m,1H),7.04(t,J＝8.11Hz,1H),7.20-7.29(m,2H),7.49(br.s.,1H).

实施例4化合物5的制备

冰浴下，将三光气(2.8g,9.29mmol)的无水四氢呋喃溶液(10mL)滴加至4(3g,11.6mmol)的无水四氢呋喃溶液(20mL)中，并升温至70℃，搅拌24小时，反应完全。待冷却至室温后，加入水(20mL)中止反应。过滤后，以乙酸乙酯(10mL)洗涤固体，得化合物52.5g。产率：77％。固体，¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ3.71(s,3H),6.44(dd,J＝8.06,2.20Hz,1H),6.50(t,J＝2.35Hz,1H),6.56(d,J＝7.62Hz,1H),6.67(dd,J＝7.92,2.05Hz,1H),6.92(d,J＝7.62Hz,1H),7.22(t,J＝8.21Hz,1H),7.52(t,J＝8.06Hz,1H),11.01(s,1H),11.14(s,1H).

实施例5化合物6的制备

将5(2g,7.04mmol)加至三氯氧磷(8mL)中。冰浴下，再将N,N-二甲基苯胺(0.45mL,3.87mmol)缓慢滴加至该溶液中。升温至95℃，并搅拌18小时，反应完全。蒸干三氯氧磷后，加入冰水(50mL)稀释，固体析出，过滤收集，即得相应的2,4-二氯喹唑啉衍生物5a，粉末状固体，ESI-MS：321.01[M+H]⁺。

将该中间体(5a)溶于四氢呋喃(15mL)中，冰浴下，向该溶液中滴加氨水溶液(15mL)。室温下搅拌5小时，反应完全。加入水(50mL)稀释，以二氯甲烷(50mL×3)萃取。收集有机层并蒸干，经过柱层析纯化，即得目标产物61.4g。产率：68％。固体，¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ3.82(s,3H),6.24(br.s.,1H),6.66-6.71(m,2H),6.72-6.76(m,1H),6.84(ddd,J＝8.41,2.45,0.88Hz,1H),7.36(t,J＝8.22Hz,1H),7.44(dd,J＝8.31,1.08Hz,1H),7.55(t,J＝8.22Hz,1H),7.64(br.s.,1H).

实施例6化合物yhhu-3469的制备

将化合物6(80mg,0.265mmol)加至四氢呋喃(1.5mL)中，再滴加正丁胺(0.05mL,0.530mmol)至该溶液中。微波反应器中加热至150℃并反应40分钟，反应完全。加入水(30mL)稀释，并以乙酸乙酯(30mL×3)萃取。收集有机层并蒸干，经柱层析纯化，得目标产物yhhu-346956mg。产率：62％。浅黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ0.93(t,J＝7.29Hz,3H),1.34-1.48(m,2H),1.50-1.65(m,2H),3.40-3.50(m,2H),3.77(s,3H),5.12(br.s.,1H),6.32(d,J＝7.98Hz,1H),6.63-6.71(m,2H),6.75(dd,J＝8.25,2.20Hz,1H),7.13(d,J＝8.25Hz,1H),7.26-7.29(m,1H),7.29-7.34(m,1H).

实施例7化合物yhhu-3470的制备

制备方法同实施例6。产率：51％。浅黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.20(t,J＝6.42Hz,6H),3.61-3.75(m,4H),3.79(s,3H),6.29(d,J＝7.70Hz,1H),6.62-6.79(m,3H),7.14(d,J＝8.43Hz,1H),7.23-7.35(m,2H).

实施例8化合物yhhu-3493的制备

制备方法同实施例6。产率：75％。白色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.89-2.02(m,4H),3.64(t,J＝6.60Hz,4H),3.79(s,3H),6.31(d,J＝8.07Hz,1H),6.63-6.72(m,2H),6.75(dd,J＝8.62,1.65Hz,1H),7.14-7.22(m,1H),7.27-7.35(m,2H).

实施例9化合物yhhu-3472的制备

制备方法同实施例6。产率：71％。浅黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.54-1.72(m,6H),3.78(s,3H),3.81-3.88(m,4H),6.31(d,J＝8.07Hz,1H),6.62-6.72(m,2H),6.72-6.78(m,1H),7.14(d,J＝8.43Hz,1H),7.23-7.34(m,2H).

实施例10化合物yhhu-3473的制备

制备方法同实施例6。产率：68％。浅黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.45-1.55(m,2H),1.90-2.05(m,2H),3.21-3.36(m,2H),3.79(s,3H),3.93(td,J＝8.87,5.09Hz,1H),4.56(ddd,J＝13.62,4.81,4.68Hz,2H),6.34(d,J＝7.70Hz,1H),6.63-6.73(m,2H),6.76(dd,J＝9.21,1.51Hz,1H),7.14(d,J＝9.63Hz,1H),7.29(s,1H),7.31-7.36(m,1H).

实施例11化合物yhhu-3474的制备

制备方法同实施例6。产率：62％。白色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ1.65-1.75(m,2H),1.84-1.92(m,2H),3.79(s,3H),3.81-3.95(m,4H),3.98-4.06(m,1H),6.34(d,J＝7.98Hz,1H),6.64-6.72(m,2H),6.76(dd,J＝8.39,2.34Hz,1H),7.15(d,J＝8.25Hz,1H),7.29(s,1H),7.31-7.36(m,1H).

实施例12化合物yhhu-3471的制备

制备方法同实施例6。产率：68％。白色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.73-3.79(m,4H),3.80(s,3H),3.87(t,J＝4.40Hz,4H),6.36(d,J＝8.07Hz,1H),6.65-6.73(m,2H),6.77(dd,J＝8.25,2.38Hz,1H),7.15(d,J＝8.80Hz,1H),7.27-7.32(m,1H),7.32-7.38(m,1H).

实施例13化合物yhhu-3492的制备

制备方法同实施例6。产率：60％。黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.79(s,3H),4.71(d,J＝5.87Hz,2H),5.43(br.s.,1H),6.36(d,J＝8.07Hz,1H),6.66-6.75(m,2H),6.78(dd,J＝8.25,2.38Hz,1H),7.16(d,J＝8.43Hz,1H),7.23-7.26(m,1H),7.27-7.42(m,7H).

实施例14化合物yhhu-3491的制备

将化合物6(80mg,0.265mmol)加至四氢呋喃(1.5mL)中，滴加苯胺(0.05mL,0.530mmol)，再滴加盐酸溶液(0.02mL)至该溶液中。微波反应器中加热至120℃并反应40分钟，反应完全。加入水(30mL)稀释，并以乙酸乙酯(30mL×3)萃取。收集有机层并蒸干，经柱层析纯化，得目标产物yhhu-349154mg。产率：57％。黄色固体，m.p.70-71℃，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.80(s,3H),6.44(d,J＝8.07Hz,1H),6.67-6.76(m,2H),6.79(d,J＝7.33Hz,1H),7.00(t,J＝7.33Hz,1H),7.31(t,J＝8.07Hz,4H),7.39 (t,J＝8.25Hz,1H),7.72(d,J＝8.43Hz,2H).

实施例15化合物yhhu-3477的制备

制备方法同实施例14。产率：68％。浅黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ2.33(s,3H),3.81(s,3H),6.42(d,J＝7.70Hz,1H),6.66-6.76(m,2H),6.80(dd,J＝8.43,2.57Hz,1H),7.01(t,J＝7.52Hz,1H),7.15-7.25(m,2H),7.33(t,J＝8.25Hz,1H),7.39(t,J＝8.25Hz,1H),7.61(br.s.,1H),8.05(d,J＝8.06Hz,1H).

实施例16化合物yhhu-3487的制备

制备方法同实施例14。产率：61％。黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),3.90(s,3H),6.44(d,J＝8.07Hz,1H),6.66-6.76(m,2H),6.79(d,J＝8.43Hz,1H),6.85-7.06(m,3H),7.28-7.36(m,2H),7.36-7.45(m,1H),7.55(br.s.,1H),8.76(d,J＝8.07Hz,1H).

实施例17化合物yhhu-3481的制备

制备方法同实施例14。产率：49％。黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.48(d,J＝7.70Hz,1H),6.68-6.77(m,2H),6.77-6.91(m,2H),7.28-7.39(m,3H),7.39-7.46(m,1H),7.54(dd,J＝8.07,1.47Hz,1H),8.80(d,J＝6.97Hz,1H).

实施例18化合物yhhu-3478的制备

制备方法同实施例14。产率：43％。黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.47(d,J＝8.07Hz,1H),6.66-6.77(m,2H),6.80(dd,J＝8.43,1.83Hz,1H),6.88-6.97(m,1H),7.01-7.20(m,3H),7.27-7.36(m,2H),7.42(t,J＝8.25Hz,1H),8.71-8.81(m,1H).

实施例19化合物yhhu-3476的制备

制备方法同实施例14。产率：59％。浅黄色固体，¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ2.37(s,3H),3.81(s,3H),6.44(dd,J＝7.96,1.01Hz,1H),6.71(t,J＝2.29Hz,1H),6.72-6.76(m,1H),6.80(dd,J＝8.42,2.38Hz,1H),6.85(d,J＝7.50Hz,1H),7.04(br.s.,1H),7.22(t,J＝7.78Hz,1H),7.29(d,J＝1.10Hz,1H),7.33(t,J＝8.23Hz,1H),7.41(t,J＝8.14Hz,1H),7.49(s,1H),7.58(d,J＝8.05Hz,1H).

实施例20化合物yhhu-3488的制备

制备方法同实施例14。产率：52％。深红色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.80(s,3H),3.84(s,3H),6.44(d,J＝8.07Hz,1H),6.57(d,J＝8.07Hz,1H),6.68-6.77(m,2H),6.80(d,J＝7.70Hz,1H),7.16(t,J＝7.52Hz,1H),7.20-7.31(m,3H),7.32(s,1H), 7.40(t,J＝8.07Hz,1H),7.61(br.s.,1H).

实施例21化合物yhhu-3479的制备

制备方法同实施例14。产率：46％。浅黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.46(d,J＝7.70Hz,1H),6.62-6.77(m,3H),6.77-6.85(m,1H),7.16-7.25(m,3H),7.27-7.36(m,2H),7.42(t,J＝8.25Hz,1H),7.91(d,J＝12.10Hz,1H).

实施例22化合物yhhu-3482的制备

制备方法同实施例14。产率：53％。浅黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.46(d,J＝8.07Hz,1H),6.67-6.76(m,2H),6.76-6.83(m,1H),7.07-7.18(m,2H),7.26-7.36(m,2H),7.41(t,J＝8.07Hz,2H),7.52(d,J＝7.70Hz,1H),8.10(s,1H).

实施例23化合物yhhu-3485的制备

制备方法同实施例14。产率：49％。浅黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.47(d,J＝7.70Hz,1H),6.67-6.77(m,2H),6.80(d,J＝8.43Hz,1H),7.19-7.46(m,5H),7.50(br.s.,1H),7.81(d,J＝8.07Hz,1H),8.18(br.s.,1H).

实施例24化合物yhhu-3475的制备

制备方法同实施例14。产率：65％。白色固体，m.p.133-134℃，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ2.32(s,3H),3.80(s,3H),6.42(d,J＝6.97Hz,1H),6.66-6.75(m,2H),6.79(d,J＝8.43Hz,1H),7.04(br.s.,1H),7.13(d,J＝8.43Hz,2H),7.20-7.26(m,1H),7.32(t,J＝8.25Hz,1H),7.38(t,J＝8.07Hz,1H),7.58(d,J＝8.43Hz,2H).

实施例25化合物yhhu-3791的制备

制备方法同实施例14。产率：50％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.63(d,J＝8.8Hz,2H),7.39(t,J＝8.4Hz,1H),7.36(d,J＝8.8Hz,2H),7.32(t,J＝8.0Hz,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,1H),7.18(brs,1H),6.80(ddd,J＝8.4,2.4,0.8Hz,1H),6.74(ddd,J＝8.4,2.4,0.8Hz,1H),6.71(t,J＝2.4Hz,1H),6.42(dd,J＝8.0,0.8Hz,1H),5.88(brs,1H),3.81(s,3H),1.32(s,9H).

实施例26化合物yhhu-3792的制备

制备方法同实施例14。产率：60％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.60(brs,1H),7.63(brs,1H),7.56(d,J＝8.8Hz,2H),7.41(t,J＝8.4Hz,1H),7.34(t,J＝8.4Hz,1H),7.23(d,J＝8.4Hz,1H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),6.82(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.72(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.44(d,J＝8.0Hz,1H),6.69(m,1H),3.81(s,3H),6.40(brs,1H),2.86(m,1H),1.21(d,J＝6.8Hz,6H).

实施例27化合物yhhu-3489的制备

制备方法同实施例14。产率：55％。白色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.80(s,6H),6.41(d,J＝8.07Hz,1H),6.68-6.75(m,2H),6.79(dd,J＝8.43,2.20Hz,1H),6.89(m,2H),7.23(d,J＝7.70Hz,1H),7.32(t,J＝8.07Hz,1H),7.38(t,J＝8.25Hz,1H),7.59(m,2H).

实施例28化合物yhhu-3480的制备

制备方法同实施例14。产率：58％。黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.80(s,3H),6.43(d,J＝8.07Hz,1H),6.67-6.76(m,2H),6.80(d,J＝8.43Hz,1H),6.99(t,J＝8.07Hz,2H),7.20-7.28(m,1H),7.32(t,J＝8.25Hz,1H),7.39(t,J＝8.07Hz,1H),7.64(dd,J＝8.07,5.13Hz,2H).

实施例29化合物yhhu-3483的制备

制备方法同实施例14。产率：50％。白色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.46(d,J＝7.70Hz,1H),6.68-6.77(m,2H),6.80(d,J＝8.43Hz,1H),7.21(br.s.,1H),7.27-7.37(m,2H),7.37-7.46(m,3H),7.64(d,J＝8.43Hz,2H).

实施例30化合物yhhu-3486的制备

制备方法同实施例14。产率：56％。浅黄色固体，¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.81(s,3H),6.49(d,J＝8.07Hz,1H),6.69-6.77(m,2H),6.80(d,J＝8.43Hz,1H),7.27-7.38(m,3H),7.44(t,J＝8.07Hz,1H),7.56(m,2H),7.86(m,2H).

测试实施例本发明的2-取代氨基-4-氨基-5-(3-甲氧基苯氧基)-喹唑啉类化合物对神经干细胞增殖分化的影响

试验方法：

骨髓基质细胞双报告基因筛选方法

此筛选体系中需转染两种质粒，PGL4质粒和pRL-CMV质粒。其中PGL4质粒载体带有萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,FL)序列，该序列上游插入了大鼠中枢神经系统特异的Nestin部分启动子基因序列。巢蛋白(Nestin)是神经干细胞中特异表达的中间丝蛋白，当rMSCs往神经方向分化时将启动Nestin表达，将启动下游萤火虫荧光素酶表达，它的表达量与神经方向分化的能力正相关。pRL-CMV质粒带有海肾荧光素酶(renillaluciferase,RL)序列，转染后的细胞即可表达该酶，作为转染阳性细胞的本底对照。通过统计FL和RL的比值，筛选出影响Nestin表达的化合物。

取经原代培养后传至第3代的大鼠骨髓基质细胞(rMSCs)，用胰酶消化后，离心重悬计数，转染上述两种质粒，用αMEM+10％FBS培液稀释成1×10⁵/mL细胞密度，均匀种入96孔板，每孔100μL，培养过夜。将10mM的化合物储备液，用培养基稀释成10μM的工作浓度全换液。阳性对照用20％FBS+αMEM的培养液 将β-巯基乙醇配制成1mM换液，空白对照为αMEM培养基全换液。培养24hr后，阳性对照换成200μM的BHA(Butylated hydroxyanisole,丁基羟基茴香醚)，继续培养5hr，检测FL和RL读值。通过比较Relative Luciferase＝RFL/RRL值，获得影响神经干细胞Nestin表达的候选化合物。

神经干细胞分化实验

孕13～14天的SD大鼠用10％水合氯醛麻醉后取胚胎，放至预冷D-Hanks缓冲液中取出胚胎脑，解剖显微镜下去除干净脑膜并分离出海马区域，将海马组织剪成1～2mm³小块，用37℃预热的DMEM/F12+1％N2+2％B27细胞培液吹打多次，得到细胞悬液，经细胞筛过滤细胞悬液得到单细胞，以5×10⁵个的细胞密度种于培养皿，加入含EGF(20ng/mL),bFGF(20ng/mL)的细胞培养液，置于二氧化碳培养箱中以5％CO₂、95％饱和湿空气培养，隔天半换液，培养6天，离心(1000g，2分钟)收集神经球，经Accutase消化为离散细胞后进行传代。

1)神经球的贴壁分化：取P1代大小较均一的神经球离心(1000g，2分钟)，种于预铺了PDL的细胞培养皿中，设置空白对照组及各浓度的化合物组处理48hr～72hr进行后续实验。

2)离散细胞的贴壁分化：取P1代大小较均一的神经球离心(1000g，2分钟)，用Accutase消化成离散细胞，再次离心后将离散细胞均匀地种于预铺了PDL的细胞培养皿中，设置空白对照组及各浓度的化合物组处理3天或7天进行后续实验。

BrdU掺入实验

5-Bromo-2-deoxyUridine(BrdU),中文名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列，替代胸腺嘧啶。利用BrdU抗体，通过免疫细胞化学染色的方法，可检测增殖细胞。本实验用培养7天的神经干细胞球，经Accutase消化成离散细胞后，用含BrdU的DMEM/F12+1％N2+2％B27培液稀释成5×10⁵个的细胞密度种于预铺了PDL的24孔板中，培养3天或7天后进行免疫荧光染色。

细胞免疫荧光染色

细胞经PBS洗涤2次，加入4％多聚甲醛固定20分钟后，用PBS洗涤3次，每次5分钟，用含0.1％的TritonX-100的PBS液通透5～10分钟后，PBS洗涤3次，每次5分钟，10％胎牛血清室温孵育1小时封闭，后用封闭液配制的一抗溶液孵育过夜。再用PBS洗3次，每次5分钟，相应二抗室温孵育1小时，PBS洗涤3次，每次5分钟，封片。对于BrdU免疫荧光染色，细胞经固定后，还需用2N的HCl室温处理30分钟，使DNA变性，再用0.1mol/L的四硼酸钠中和15分钟，然后进行后续实验。

蛋白免疫印迹法(Western Blot)

细胞经预冷的PBS洗2次后加入RIPA裂解液(Tris-HCl 50mM，pH7.4，NaCl 150mM，EDTA 1mM，Na-deoxycholate 0.25％，NP-401％，PMSF 1mM，Na₃VO₄1mM，NaF 1mM，Aprotinin 10μg/mL，Leupeptin 5μg/mL，Pepstatin 5μg/mL)，冰上裂解30分钟。用细胞刮将裂解物刮下，收集裂解液至离心管，15000g，4℃离心15分钟。吸取上清，取部分用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，在剩下的蛋白上清中加入4×样品缓冲液，沸水浴5分钟后收集蛋白样品。样品经SDS/PAGE电泳分离后转移到PVDF膜上。5％脱脂奶粉室温封闭1小时后，用稀释的一抗4℃ 孵育过夜。次日，样品条带用TBST洗三遍，每次10分钟。室温孵育二抗1～1.5小时，样品条带用TBST洗三遍，孵育ECL显色后，用ImageQuant LAS 4000成像仪器显影拍照。

测试实施例1本发明的2-取代氨基-4-氨基-5-(3-甲氧基苯氧基)-喹唑啉类化合物对SD大鼠骨髓基质细胞中nestin表达具有调控作用

筛选结果：

筛选结果见图1。结果显示，化合物Yhhu-3469、Yhhu-3479、Yhhu-3491、Yhhu-3492、Yhhu-4282、Yhhu-3472、Yhhu-3476、Yhhu-3477、Yhhu-3478、Yhhu-3481、Yhhu-3482、Yhhu-3487、Yhhu-3493使Nestin的表达显著升高；化合物Yhhu-3791、Yhhu-3792使Nestin的表达显著降低。

筛选的验证：

采用免疫荧光染色方法，检测上述筛选出的小分子化合物对骨髓基质细胞中神经干细胞标志性蛋白Nestin的表达情况(图2)。

结果表明,Yhhu-3478、Yhhu-3487、Yhhu-3493化合物均使Nestin阳性细胞数增加。

测试实施例2本发明的2-取代氨基-4-氨基-5-(3-甲氧基苯氧基)-喹唑啉类化合物对神经干细胞分化的具有促进作用

2.1化合物Yhhu-3477、Yhhu-3481可促进神经干细胞向神经元分化

化合物Yhhu-3477、Yhhu-3481以1μM的浓度作用于神经干细胞球和离散神经干细胞，用免疫荧光染色的方法和Western blot，检测神经元特异标记蛋白Tuj-1(图3和图4)。

统计结果表明,Yhhu-3477、Yhhu-3481化合物可以使Tuj-1表达量显著增加，分化的神经元比例显著增加。

2.2化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792可以对神经干细胞向神经元和星状胶质细胞分化具有促进作用

将Yhhu-3791和Yhhu-3792化合物作用于神经干细胞球，用免疫荧光染色的方法检测神经元特异标记蛋白Tuj-1和星状胶质细胞标记蛋白GFAP的表达情况，结果显示：化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792可以使Tuj-1和GFAP的表达水平增加(图5)。

结果表明，Yhhu-3791和Yhhu-3792具有促进神经干细胞向神经元和星状胶质细胞分化的作用。

测试实施例3本发明的2-取代氨基-4-氨基-5-(3-甲氧基苯氧基)-喹唑啉类化合物对神经干细胞增殖具有促进作用，且与Notch信号通路有关。

本实施例研究了Nestin下调化合物(如Yhhu-3791和Yhhu-3792)对神经干细胞增殖的影响。

3.1化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792促进神经干细胞的增殖

结果如图6所示。免疫荧光染色结果显示，化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792在1μM浓度时可以使神经干细胞球增大。结果表明，化合物Yhhu-3791和Yhhu-3792对神经干细胞有增殖的作用。

结果如图7所示。利用BrdU掺入的方法，结果显示，化合物Yhhu-3792可以使细胞BrdU阳性率显著增加。结果表明，化合物Yhhu-3792对神经干细胞增殖具有促进作用。

3.2化合物Yhhu-3792可以促进神经元及星状胶质细胞数增加

结果如图8所示。通过BrdU与特异性标记蛋白免疫荧光共标的方法可以确定增殖细胞的类型，结果表明，Yhhu-3792化合物可以促进神经元(BrdU⁺/Tuj-1⁺)及星状胶质细胞(BrdU⁺/GFAP⁺)数量的增加。

3.3Notch信号通路参与了Yhhu-3792化合物促近神经干细胞增殖的作用

Notch信号通路与神经干细胞增殖密切相关，利用Western blot检测Yhhu-3792化合物对Notch信号通路的作用。

结果如图9和图10所示。结果显示，化合物Yhhu-3792能够增加Notch-1受体表达量以及细胞核内的Notch受体活化形式NICD的表达量。结果表明，Notch信号通路参与了Yhhu-3792化合物促神经干细胞增殖的作用。

结果如图11所示。SHH信号通路与神经干细胞增殖密切相关,通过Westernblot检测Yhhu-3792化合物对SHH信号通路的作用。结果显示，SHH信号通路相关受体Patched表达量无明显变化。结果表明，化合物Yhhu-3792对SHH信号通路无明显影响。

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