一种分泌性能提高的碱性果胶酶突变体的制作方法
本发明涉及一种分泌性能提高的碱性果胶酶突变体，属于酶工程领域。
背景技术：
果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶分布广泛，在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业应用史。根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶PGL。其中酸性果胶酶主要应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。PGL应用主要应用于纺织、食品、造纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应条件温和等优点。然而目前对PGL进行分子改造研究较少，进行商品化的PGL也很少。
目前对碱性果胶酶研究比较深入的菌株主要是毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。综合比较可表达碱性果胶酶的不同宿主，毕赤酵母虽然表达蛋白易于纯化，产量高，但发酵周期长、过程复杂、低温诱导耗能高；枯草芽孢杆菌不易表达或表达酶活低等缺点。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种分泌性提高的碱性果胶酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供携带所述基因或突变体的载体或细胞系。
本发明的第四个目的是提供一种提高碱性果胶酶分泌能力的方法，是将SEQ ID NO.3所示序列的双亲短肽AEAEAKAKAEAEAKAK突变为ADADARARADADARAR。
本发明的第五个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主，pET-22b(+)为载体，表达SEQ ID NO.1所示的碱性果胶酶突变体。
本发明的第六个目的是提供一种产碱性果胶酶的方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，200～220rpm，30～37℃发酵24～72h。
在本发明的一种实施方式中，所述接种是按体积以3～5％的比例接种种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为TB培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程中加入终浓度为0.02～0.06mmol/L IPTG进行诱导。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是以按体积比3～5％的接种量接入TB培养基中，37℃，200r·min-1培养至菌体浓度OD600＝0.4～0.6，加入终浓度0.04～0.06mM IPTG进行诱导，28～30℃下诱导36～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵具体是：以按体积比3％的接种量接入TB培养基中，37℃，200r·min-1培养至菌体浓度OD600＝0.6，加入终浓度0.04mM IPTG进行诱导，30℃下诱导48h。
本发明还提供所述突变体及所述基因工程菌在食品、环境、纺织、造纸领域制备碱性果胶酶中的应用。
有益效果：本发明的碱性果胶酶突变体分泌效率显著提高，相对于现有的碱性果胶酶或碱性果胶酶突变体PGL-S1而言，本发明的突变体PGL-ADR的胞外酶活达919.88±82.64U/mL，相比于PGL-S1提高了1.7倍(三次重复实验平均值)，且纯化后比酶活达448.36U/mg，熔解温度为69℃，热力学稳定性也有明显提高。本发明的碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。
附图说明
图1为碱性果胶酶及碱性果胶酶突变体的酶活测定结果。
具体实施方式
培养基：
种子培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，葡萄糖2g/L。
发酵培养基：蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油10g/L、KH2PO42.32g/L、K2HPO416.43g/L。
碱性果胶酶酶活测定：
采用分光光度法测定。单位酶活定义：单位时间裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸所用的酶量。酶活测定条件为：酶活力检测：发酵液8000rpm离心10min，胞外PGL即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。PGL反应体系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol·L-1，0.44mmol·L-1的CaCl2，pH9.4)2mL，待测样品20μL，无活性的酶液为空白对照。PGL反应条件为：将反应体系置于45℃下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol·L-1)终止反应，在235nm处测定吸光度值。
实施例1：突变菌株的获得
采用PCR扩增或者化学合成的方法，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的碱性果胶酶基因，然后将基因连接到pET-22b(+)，再转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，筛选，获得正确的转化子。
实施例2：突变株的验证
种子培养：将重组菌E.coli BL21(DE3)从平板上挑取并接种于LB培养基中(100μg·mL-1氨苄青霉素，2％葡萄糖)，装液量为20mL/250mL。37℃，200r·min-1摇床上振荡培养10h。
摇瓶发酵：将培养10h的种子液以3％(V/V)的接种量接入发酵培养基TB(100μg·mL-1氨苄青霉素)中，装液量为20mL/250mL，37℃，200r·min-1培养至菌体浓度OD600＝0.6，加入终浓度0.04mM IPTG进行诱导，30℃下诱导48h。
以未突变的碱性果胶酶作为对照，将重组菌与对照按上述方法培养、发酵，将发酵结束的重组菌发酵液8000r/min离心20min，取上清液，测定上清液酶活，出发PGL-S1的胞外酶活为537.75±3.76U/mL，而突变体PGL-ADR胞外酶活为919.88±82.64U/mL。
实施例3：碱性果胶酶的纯化
将重组菌发酵液8000r/min离心20min，取上清液，加硫酸铵进行梯度盐析，低温离心收集30～50％硫酸铵沉淀部分，将盐析沉淀的酶溶解在甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液(pH7.5)中，用20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液透析处理24h。离心所得上清液经阳离子交换层析进行进一步分离纯化及脱盐处理。将纯化后的碱性果胶酶稀释，按照上述方法测定酶活，用BSA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，结果显示，突变体PGL-ADR比酶活为448.36±4.73U/mg。
实施例4：碱性果胶酶及其突变体熔解温度的测定
蛋白质熔解温度指蛋白质溶液在逐渐加热到临界温度以上时，蛋白质的构象从天然态到变性状态有一个显著地转变，这个转变的中点温度成为蛋白质的熔解温度(melting temperature)，蛋白质的Tm值越高，说明蛋白质的热力学稳定性越高。将按照实施例3的步骤纯化获得的纯酶调整到相同蛋白浓度0.4mg/mL，以20mM的pH7.5的甘氨酸-NaOH缓冲液为空白对照，用差示热量扫描仪((TA,Waters,USA))进行蛋白质熔解温度测定，结果显示，熔解温度由原来的64.89提高到69℃。
实施例5不同双亲短肽对碱性果胶酶酶活及热稳定性的影响
采用表1所示的其它自组装双亲短肽(SEQ ID NO.5～8所示序列，分别表示为S1v1，S1v2，S1v3和S1v4)按照实施例1-2相同策略通过PT-linker与碱性果胶酶N端连接，构建碱性果胶酶突变体。
表1自组装双亲短肽序列表
采用实施例1、2相同策略构建重组大肠杆菌并进行培养、发酵，对发酵结束后的碱性果胶酶胞外酶活进行测定，如图1所示，出发菌株PGL-S1胞外粗酶液酶活为537.85±3.37U/mL，S1v1，S1v2，S1v3和S1v4胞外酶活分别为165.88±4.27，2.03±0.31U/mL，3.2±0.002U/mL和3.3±0.07U/mL，说明上述双亲短肽不能有效提高碱性果胶酶的分泌效率。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种分泌性能提高的碱性果胶酶突变体
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Asn Ala Asn Ala Arg Ala Arg Pro Thr Pro Pro Thr Thr Pro Thr Pro
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Gln Thr Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala Tyr Ser Thr Gly Thr
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Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Leu Asn Val Tyr Thr Val Ser Asn
65 70 75 80
Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Glu Thr Asn Thr Thr Pro
85 90 95
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Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp Pro Glu Tyr Asp Leu
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Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr Trp Gly Lys Lys Glu
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Pro Ser Gly Thr Gln Glu Glu Ala Arg Ala Arg Ser Gln Lys Asn Gln
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Ser Gly Thr Asn Ala Lys Val Val Gly Gly Asn Phe Gln Ile Lys Ser
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Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln Asp Ala Tyr Asp Tyr
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Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser Gly Asn Trp Asn Ser
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Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr His Ile Trp Ile Asp
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His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp Ser Thr Ser Pro Lys
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Tyr Tyr Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly Gln Thr Asp Ala Ser
260 265 270
Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn Tyr Tyr His Asp His
275 280 285
Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser Lys Thr Ser Asp Asp
290 295 300
Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg Tyr Lys Asn Ile Val
305 310 315 320
Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val His Val Tyr Asn Asn
325 330 335
Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Ser Tyr Pro Phe Ser Tyr Ala
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355 360 365
Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile Ser Val Phe Ser Gly
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ggcacgacag gcgggtcaaa agcatcgtcc ttaaatgtgt ataccgtcag caacagaaac 240
cagcttgtct cggcattagg gaaggaaacg aacacaacgc caaaaatcat ttatatcaag 300
ggaacgattg acatgaacgt agatgacaat ctgaagccgc ttggtctaaa tgactataaa 360
gatccggagt atgatttgga caaatatttg aaagcctatg atcctagcac atggggcaaa 420
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