本发明公开了一种苯甲酰胺类hedgehog抑制剂及其制备方法和应用，属于医药化工技术领域。
背景技术：
hedgehog信号通路是一个经典的控制胚胎发育的信号转导途径，在胚胎发育和胚胎形成后细胞的生长和分化过程中都起着重要的作用。大量的证据表明，hedgehog信号通路的异常激活与肿瘤发生有关，例如基底细胞癌(bccs)、成神经管细胞瘤和一些实体肿瘤；此外，研究还发现hedgehog信号与癌症干细胞存在某些关联。因此，hedgehog信号通路已经成为抗癌药物发现的有希望的靶点。
目前，人们已经开发出许多靶向hedgehog信号通路中关键组件蛋白smoothened的小分子抑制剂，其中一些抑制剂已经上市或处于临床研究阶段，包括vismodegib(gdc-0449)，sonidegib(nvp-lde-225)，taladegib(ly-2940680)，bms-833923(xl-139)。小分子抑制剂vismodegib(gdc-0449)已经于2012年被fda批准用于转移基底细胞癌(bccs)的治疗；由novartis开发的sonidegib(nvp-lde-225)于2015年被批准上市。
gdc-0449在治疗癌症的过程中产生了一定得耐药性，例如smoothened受体d473h突变，因此需要开发新型的具有良好抑制活性的hedgehog抑制剂。
技术实现要素：
发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种苯甲酰胺类hedgehog抑制剂及其制备方法和应用。
技术方案：本发明提供了一种苯甲酰胺类hedgehog抑制剂，所述抑制剂具有下述通式(i)所示的结构：
其中：
本发明还提供了所述苯甲酰胺类hedgehog抑制剂的制备方法，反应过程如下：
由化合物
优选，由化合物a制备化合物d的反应过程如下：
优选，由化合物a-1制备化合物d的反应过程如下：
本发明中，优选的化合物具有下述化合物的结构：
上述优选化合物制备过程如下：
首先，由化合物d上的氨基与
本发明最后还提供了所述的苯甲酰胺类hedgehog抑制剂在制备hedgehog信号通路抑制药物中的应用。
所述的苯甲酰胺类hedgehog抑制剂在制备治疗hedgehog信号通路相关肿瘤药物中的应用。所述hedgehog信号通路相关肿瘤为基底细胞癌(bccs)、成神经管细胞瘤、乳腺癌、结肠癌或肺癌等。
本发明的苯甲酰胺类hedgehog抑制剂，能够较好的进入smoothened蛋白弯曲的结合腔内，特异性地靶向smoothened受体，同时能够有效避免smoothened受体突变所引起的耐药性，因此其对smoothened蛋白具有良好的相互作用，能够有效抑制hedgehog信号通路，治疗hedgehog信号通路异常激活的相关癌症。
发明所述的化合物通过体外gli荧光素酶报告分析和体外抑制乳腺癌mcf-7细胞毒性实验，显示所述的化合物具有良好的hedgehog信号通路和乳腺癌mcf-7细胞抑制活性，可进一步研制开发为新型的hedgehog信号通路抑制剂和抗肿瘤药物。
技术效果：相对于现有技术，本发明提供了一种新型的苯甲酰胺类化合物，其能够特异性地靶向hedgehog信号通路中smoothened受体蛋白，有效避免smoothened受体突变所引起的耐药性，从而能有效抑制hedgehog信号通路，以及有效治疗hedgehog信号通路相关肿瘤，如基底细胞癌(bccs)、成神经管细胞瘤、乳腺癌、结肠癌或肺癌等。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
本发明中，所采用的药效学试验方法，是本领域技术人员所熟知的方法；所采用的所有原料是本领域技术人员可通过市购的途径所获得的。
实施例1：合成目标化合物1，4-氟-n-甲基-n-(1-(4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)氮杂萘-1-基)哌啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
首先，合成中间体d，反应过程如下：
1)合成中间体b：1-苄基-n-甲基哌啶-4-胺
将原料n-苄基哌啶酮(a，2.00g，10.57mmol，1.0eq.)溶解在30ml的甲醇中，向溶液中滴加4滴冰乙酸，搅拌均匀后加入0.79g(11.63mmol，1.1eq.)的甲胺盐酸盐，室温(25℃)下反应2h；将反应移入冰水浴中，待反应温度降至0℃后，分批加入1.33g(21.14mmol，2.0eq.)的氰基硼氢化钠，分批加入时间控制在10min左右；搅拌均匀后将反应移出冰水浴，室温下反应16h。反应结束后，将反应混合物倒入到饱和碳酸氢钠溶液中，用二氯甲烷萃取三次，合并有机层，加入无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产品，柱层析纯化(洗脱液为二氯甲烷/2mnh3的甲醇溶液，体积比为20:1)得到无色油状纯产物b(1.88g，产率为87％)。
产物b的检测数据如下：
1hnmr(500mz,cdcl3)δ7.30-7.28(m,4h),7.25-7.21(m,1h),3.49(s,2h),2.83(d,j＝11.8hz,2h),2.41(s,3h),2.36-2.31(m,1h),2.02(t,j＝11.5hz,2h),1.84(d,j＝12.4hz,2h),1.40-1.33(m,3h)ppm；
mscalcdforc13h20n2[m+h]+:205.1705；found:205.1751。
2)合成中间体c：n-(1-苄基-4-哌啶基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
将化合物b(1.50g，7.34mmol，1.0eq.)溶解在30ml的二氯甲烷中，向溶液中加入2ml(14.43mmol，2.0eq.)的三乙胺，搅拌均匀后滴加1.66g(7.34mmol，1.0eq.)的4-氟-2-(三氟甲基)苯甲酰氯，室温下反应6h；反应结束后，减压浓缩得到粗产品，柱层析纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比为20:1)得到无色油状纯产物c(2.72g，产率为94％)。
产物c的检测数据如下：
1hnmr(300mz,cdcl3)δ7.43-7.38(m,1h),7.32-7.22(m,7h),4.65-4.54(m,1h),3.40(s,2h),3.10-2.83(m,2h),2.65(s,3h),2.16(s,2h),1.93-1.58(m,4h)ppm；
mscalcdforc21h22f4n2o[m+h]+:395.1747；found:395.1808。
3)合成中间体d：4-氟-n-甲基-n-(4-哌啶基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
将化合物c(1.50g，3.81mmol，1.0eq.)溶解在30ml甲醇中，氮气保护下向溶液中加入200mg的pd/c和2.40g(38.05mmol，10.0eq.)的甲酸铵，反应在50℃温度下回流12h；反应结束后冷却至室温，过滤掉pd/c，浓缩滤液除去甲醇，加入二氯甲烷溶解残留物，过滤掉甲酸铵，再浓缩滤液得到粗产品，柱层析纯化(洗脱液为二氯甲烷/2mnh3的甲醇溶液，体积比为20:1)得到白色固体d(1.05g，产率为91％)。
产物d的检测数据如下：
mp:113℃；
1hnmr(300mz,cdcl3)δ7.44-7.39(m,1h),7.32-7.29(m,2h),4.73-4.63(m,1h),3.21-3.05(m,2h),2.66(s,3h),2.41-2.27(m,2h),1.79-1.68(m,5h)ppm；
mscalcdforc14h16f4n2o[m+h]+:305.1277；found:305.1239。
中间体4还可以通过下面这条路线得到：
合成中间体c-1：叔丁基4-(4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺基)哌啶-1-甲酸酯
将原料叔丁基4-(甲氨基)哌啶-1-甲酸酯(a-1，2.00g，9.33mmol，1.0eq.)溶解在30ml的二氯甲烷中，向溶液中加入2ml(14.43mmol，1.5eq.)的三乙胺，搅拌均匀后滴加2.11g(9.33mmol，1.0eq.)的4-氟-2-(三氟甲基)苯甲酰氯，室温下反应6h；反应结束后，减压浓缩得到粗产品，柱层析纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比为20:1)得到无色油状目标化合物c-1(3.32g，产率为88％)。
合成中间体d：4-氟-n-甲基-n-(4-哌啶基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
将化合物c-1(3.00g，7.42mmol，1.0eq.)溶解在30ml二氯甲烷中，加入过量的2mhcl的乙醚溶液(10ml，20.00mmol，2.7eq.)，搅拌均匀后在室温(25℃)下反应6h；反应结束后抽滤得到其盐酸盐，用二氯甲烷洗涤三次，将固体溶解于氢氧化钠溶液中用二氯甲烷萃取三次，减压浓缩得到白色固体d(2.05g，产率为91％)
4)合成中间体d-5：n-(1-(4-氯-1-酞嗪基)-4-哌啶基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
将化合物d(0.50g，1.64mmol，1.0eq.)溶解在30ml的1-甲基吡咯烷中，向溶液中加入0.45g(3.29mmol，2.0eq.)的碳酸钾和0.36g(1.81mmol，1.1eq.)的1,4-二氯酞嗪，搅拌均匀后反应在80℃下回流12h；反应结束后冷却至室温，将反应混合物倒入到水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产品，柱层析纯化(洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，体积比为1:1)得到白色固体d-5(0.56g，73％)。
产物d-5的检测数据如下：
mp:86℃；
1hnmr(300mz,cdcl3)δ8.22-8.19(m,1h),8.07-7.99(m,1h),7.92-7.89(m,2h),7.46-7.34(m,3h),4.93-4.85(m,1h),4.16-3.89(m,2h),3.50-3.19(m,2h),2.77(s,3h),2.26-2.04(m,2h),1.97-1.72(m,2h)ppm；
mscalcdforc22h19clf4n4o[m+h]+:467.1262；found:467.1289。
5)合成目标化合物1：4-氟-n-甲基-n-(1-(4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)氮杂萘-1-基)哌啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
将化合物d-5(0.20g，0.43mmol，1.0eq.)溶解在18ml甲苯、6ml乙醇、6ml水组成的混合溶液中，向溶液中加入0.09g(0.86mmol，2.0eq.)的碳酸钠和0.10g(0.47mmol，1.1eq.)的1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊硼烷-2-基)-1h-吡唑，用氮气脱气20min后加入60mg的四(三苯基膦)钯，再用氮气脱气10min，搅拌均匀后反应在74℃下回流12h；反应结束后冷却至室温，加入二氯甲烷稀释，用浓盐水洗有机相三次，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产品，柱层析纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比为30:1)得到黄色泡沫状的目标化合物1(1.93g，产率为88％)。
目标化合物1的检测数据如下：
1hnmr(300mz,cdcl3)δ8.29-8.24(m,1h),8.12-8.04(m,1h),8.02-7.97(m,2h),7.85-7.82(m,2h),7.47-7.31(m,3h),4.94-4.86(m,1h),4.13-3.91(m,2h),4.03(s,3h),3.47-3.33(m,2h),2.76(s,3h),2.28-2.04(m,2h),1.96-1.70(m,2h)ppm；
mscalcdforc26h24f4n6o[m+h]+513.2026；found:513.2065.
目标化合物2和3的合成方法同目标化合物1。
实施例2：合成目标化合物4，n-(1-(4,5-二甲基-6-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)哒嗪-3-基)哌啶-4-基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
1)中间体d的合成同实施例1，合成中间体d-6：n-(1-(6-氯-4,5-二甲基-3-哒嗪基)-4-哌啶基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
将化合物d(0.50g，1.64mmol，1.0eq.)溶解在30ml的n-甲基吡咯烷酮中，向溶液中加入0.45g(3.29mmol，2.0eq.)的碳酸钾和0.32g(1.81mmol，1.1eq.)的3,6-二氯-4,5-二甲基哒嗪，搅拌均匀后反应在110℃下回流12h；反应结束后冷却至室温，将反应混合物倒入到水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产品，柱层析纯化(洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，体积比为1:1)得到白色固体d-6(0.57g，78％)。
中间体d-6的检测数据如下：
mscalcdforc20h21clf4n4o[m+h]+445.1418；found:445.1438.
2)合成目标化合物4：n-(1-(4,5-二甲基-6-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)哒嗪-3-基)哌啶-4-基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
将化合物d-6(0.20g，0.45mmol，1.0eq.)溶解在18ml甲苯、6ml乙醇、6ml水组成的混合溶液中，向溶液中加入0.10g(0.90mmol，2.0eq.)的碳酸钠和0.10g(0.49mmol，1.1eq.)的1-甲基-1h-吡唑-5-硼酸频那醇酯，用氮气脱气20min后加入60mg的四(三苯基膦)钯，再用氮气脱气10min，搅拌均匀后反应在74℃下回流12h；反应结束后冷却至室温，加入二氯甲烷稀释，用浓盐水洗有机相三次，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产品，柱层析纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比为30:1)得到粉红透明固体4(0.20g，产率为89％)。
目标化合物4的检测数据如下：
1hnmr(300mz,cdcl3)δ7.57-7.55(m,1h),7.47-7.40(m,1h),7.38-7.31(m,2h),6.36-6.34(m,1h),4.89-4.79(m,1h),3.92(s,3h),3.82-3.52(m,2h),3.40-3.22(m,2h),2.72(s,3h),2.30(s,3h),2.22(s,3h),2.09-2.00(m,2h),1.94-1.92(m,2h)ppm；
mscalcdforc24h26f4n6o[m+h]+491.2182；found:491.2236.
目标化合物5的合成方法同目标化合物4。
实施例3：合成目标化合物6，4-氟-n-甲基-n-(1-(4-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)喹唑啉-2-基)哌啶-4-基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
1)中间体d的合成同实施例1和2，合成中间体d-7：n-(1-(4-氯-2-喹唑啉基)-4-哌啶基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
将化合物d(0.50g，1.64mmol，1.0eq.)溶解在30ml的t-buoh中，向溶液中加入1ml(7.21mmol，4.4eq.)的三乙胺和0.36g(1.81mmol，1.1eq.)的2,4-二氯喹唑啉，搅拌均匀后室温(25℃)下反应12h；用二氯甲烷稀释，减压浓缩得到粗产品，柱层析纯化(洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，体积比为1:1)得到白色固体d-7(0.62g，81％)。
中间体d-7的检测数据如下：
mscalcdforc22h19clf4n4o[m+h]+467.1262；found:467.1269.
2)合成目标化合物6：n-(1-(4,5-二甲基-6-(1-甲基-1h-吡唑-5-基)哒嗪-3-基)哌啶-4-基)-4-氟-n-甲基-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
将化合物d-7(0.20g，0.43mmol，1.0eq.)溶解在18ml甲苯、6ml乙醇、6ml水组成的混合溶液中，向溶液中加入0.09g(0.86mmol，2.0eq.)的碳酸钠和0.10g(0.47mmol，1.1eq.)的1-甲基-1h-吡唑-5-硼酸频哪酯，用氮气脱气20min后加入60mg的四(三苯基膦)钯，再用氮气脱气10min，搅拌均匀后反应在74℃下回流12h；反应结束后冷却至室温，加入二氯甲烷稀释，用浓盐水洗有机相三次，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产品，柱层析纯化(洗脱液为二氯甲烷/甲醇，体积比为30:1)得到白色粉末状目标化合物6(0.19g，产率为87％)。
目标化合物6的检测数据如下：
1hnmr(300mz,cdcl3)δ7.95-7.82(m,2h),7.79-7.73(m,1h),7.53(dd,j＝1.8and1.8hz,1h),7.50-7.42(m,2h),7.40-7.30(m,2h),7.09(dd,j＝2.1and1.8hz,1h),5.03-4.92(m,1h),4.70-4.37(m,2h),4.46(s,3h),3.55-3.32(m,2h),2.72(s,3h),2.26-1.85(m,2h),1.77-1.63(m,2h)ppm；
mscalcdforc26h24f4n6o[m+h]+513.2026；found:513.2059.
目标化合物7-20的合成方法同目标化合物6，其中在制备中间体d-8和d-9时分别同时生成中间体d-10和d-11。
实施例4：体外hedgehog信号通路抑制活性测试
体外gli荧光素酶报告分析：
1、将nih3t3细胞在含有10％fbs和1％青霉素-链霉素溶液的dmem培养基中培养到足够数量后，用lipo2000试剂将gli-fireflyluciferasereporter和tk-renillaluciferasereporter载体转染至nih3t3细胞中。
2、将转染有gli-fireflyluciferasereporter和tk-renillaluciferasereporter载体的nih3t3细胞接种到96孔板中(每孔1×104个细胞，80μl培养基)，在5％co2、37℃下孵育过夜；
3、孵育后，向每孔中加入10μl的鼠源重组shh-n(在dmem培养基中，浓度为2.5μg/ml)和10μl的不同浓度的待测药物(5个浓度，在dmem培养基中，含量为5-1000nm)使最终浓度达到8％fbs、0.25μg/ml的shh-n和0.5-100nm的待测化合物(5个复孔)，继续培养48个小时；
4、设置对照组，即细胞分别在含有和不含0.25μg/mlshh-n的0.1％dmso的培养基中培养，作为0％和100％的抑制活性对照；
5、培养完成后用pbs洗涤，利用双荧光素酶报告检测试剂盒检测gli荧光素酶活性，并作为判断hedgehog信号抑制活性的指标。
实施例5：体外乳腺癌mcf-7细胞增殖抑制活性测试
cck-8检测细胞毒性实验：1、将生长到一定浓度的mcf-7细胞消化后离心收集，用完全培养基制备成细胞悬液；并用细胞计数板计数，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度约为5×104/ml；
2、将上述调整好的细胞悬液接种到96孔板中，每孔约100μl，设5个复孔(n＝5)；
3、将上述接种mcf-7细胞的96孔板置于37℃的5％co2培养箱内孵育4h，至单层细胞铺满孔底；
4、用移液枪吸出96孔板中的培养基，向每孔中加入100μl用dmso溶解的并用完全培养基系列稀释的不同浓度梯度的待测药物，每个待测药物均设5个浓度；同时设置调零孔(培养基和cck-8)和对照孔(培养基、mcf-7细胞、相同浓度的药物溶解介质和cck-8)；
5、将加入待测药物的96孔板置于37℃的5％co2培养箱内孵育16h；
6、向孵育后的96孔板中分别加入10μlcck-8，加完后轻轻敲击96孔板使试剂混合均匀；
7、将加入cck-8的96孔板置于37℃的5％co2培养箱内孵育4h；
8、利用酶标仪测定450nm吸光度(od值)，检测波长为450-490nm，参比波长为600-650nm。
结果表明(如表1所示)，本发明所述的化合物显示出较好的hedgehog信号通路和乳腺癌mcf-7细胞抑制活性，其中目标化合物4和19对hedgehog信号通路和乳腺癌mcf-7细胞均具有较好的抑制活性，它们的ic50值与先导化合物ly-2940680相当甚至小于先导化合物。本发明的化合物可进一步研制开发为新型的hedgehog信号通路抑制剂和抗肿瘤药物。
表1本发明化合物的hedgehog信号通路和乳腺癌mcf-7细胞的体外抑制活性结果