本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种用于生产左旋多巴发酵过程中的微量元素和发酵方法。
背景技术：
左旋多巴又名3,4-二羟基苯丙氨酸，为白色结晶性粉末，无臭无味，在乙醇、氯仿和丙酮中不溶，在稀酸中易溶，作为一种重要的生物活性物质，左旋多巴是神经递质多巴胺的前体，可以通过血脑屏障，进入脑循环而到达中枢神经系统，在中枢神经脱羧酶的作用下，转化为多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加达到治疗帕金森疾病。其结构式如下：
左旋多巴是治疗老年帕金森病的首选和最有效药物，除此之外，左旋多巴还具有治疗弱视和心力衰竭的作用，虽然在长时间的使用以后会有一些副作用，但是四十余年过去了，目前仍然没有更好的替代药物出现。目前市面上左旋多巴的制备多是植物提取或化学合成。如专利201310700220.0中公开的左旋多巴制备是以农产品猫豆为原料提取制备左旋多巴。但是上述两种方法均无法保证原料来源，产量远远满足不了市场需求。随着分子生物学及生物技术的迅速发展，利用生物合成左旋多巴已经成为一种很有竞争力、前途光明的方法。
在现有左旋多巴生产技术的发酵过程中，随着营养物质的消耗和代谢副产物的积累，菌体生长到稳定期的后期会出现菌体活力下降，生物量增加不明显的现象。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种用于左旋多巴发酵过程中的微量元素和发酵方法，以解决左旋多巴发酵过程后期菌体活力下降，生物量增加不明显的问题。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种一种用于左旋多巴发酵过程中的微量元素，包括以下重量份的组分：znso4·7h2o0.01～0.1份,柠檬酸铁铵0.02～0.08份，mnso4·5h2o0.01～0.05份,h3bo30.05～0.13份,fecl30.03～0.09份。
本发明还提供了一种用于左旋多巴发酵过程中的微量元素液，每升微量元素液中包括以下成分：znso4·7h2o1～10g,柠檬酸铁铵2～8g，mnso4·5h2o1～5g,h3bo35～13g,fecl33～9g。
本发明的另外一个目的是提供一种生产左旋多巴的发酵方法，包括如下步骤：
(1)将重组大肠杆菌种子液接种于发酵培养基中进行发酵，控制发酵的ph为6.0～9.0，发酵温度为34～38℃，发酵do≥30％；
(2)当发酵液的od600为25～30时，向发酵液中加入诱导剂进行低温诱导蛋白表达；当发酵液的od600达到30～60时，在所述发酵液中加入上述微量元素液，所述微量元素液加入量为所述发酵液体积的0.5～1％；
(3)当发酵罐内od不增加时停止发酵，收集菌体，提取菌体中的左旋多巴。
其中，所述发酵培养基的配方为：每升发酵培养基中包括酵母膏5～14g，蛋白胨7～13g，十二水磷酸氢二钠10～18g，硫酸钠5～10g，氯化钠0.1～1.5g，氯化铵1～6g，三水磷酸氢二钾7～16g，柠檬酸0.1～1g，七水硫酸镁0.1～1g，甘油1～10ml。
优选的，所述步骤(1)后还包括补料步骤：当所述发酵培养基的do和ph值同时上升时，开始补料，维持发酵液的do在20％～40％。
其中，所述补料的补料培养基配方为：每升补料培养基中含有酵母膏10～50g，蛋白胨20～60g，甘油200～600g。
优选的，所述种子液的接种量为发酵液体积的1％～5％。
优选的，所述步骤(2)中，所述诱导剂为iptg，所述低温诱导蛋白表达的发酵温度为15～25℃。
进一步优选的，所述诱导剂的浓度为30～70mg/ml，所述诱导剂加入量为所述发酵液体积的0.05～0.15％。
优选的，所述步骤(1)中，发酵在发酵罐中进行，所述发酵罐的转速为100～300rpm，通气量为0.5～1.5vvm，压力为0.01～1mpa。
现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过在发酵后期添加微量元素液，补充了微生物生长所需要微量离子和酶合成所需要的辅酶离子，使菌体后期的生长活性得到延续，最终发酵周期在20h左右，菌体od600在80以上，菌体湿重大于100g/l。
具体实施方式
本发明提供了用于左旋多巴发酵过程中的微量元素，包括以下重量份的组分：znso4·7h2o0.01～0.1份,柠檬酸铁铵0.02～0.08份，mnso4·5h2o0.01～0.05份,h3bo30.05～0.13份,fecl30.03～0.09份。优选所述微量元素包括znso4·7h2o0.03～0.08份,柠檬酸铁铵0.04～0.06份，mnso4·5h2o0.02～0.04份,h3bo30.08～0.11份,fecl30.05～0.08份。本发明对上述微量元素中所用的成分来源没有特殊限制，采用本领域中的常用物质即可，也可以采用市售商品。
本发明还包括由上述微量元素制备的微量元素液。每升微量元素液中包括以下成分：znso4·7h2o1～10g,柠檬酸铁铵2～8g，mnso4·5h2o1～5g,h3bo35～13g,fecl33～9g。优选每升微量元素液中包括znso4·7h2o3～7g,柠檬酸铁铵4～7g，mnso4·5h2o2～5g,h3bo37～10g,fecl34～8g。本发明对微量元素液的配制方法没有特殊限定，采用本领域的常规配制方法进行制备即可。
znso4·7h2o参与构成含硫氨基酸，同时作为菌体胞内酶的辅酶的活性基团；fe2+、fe3+是构成细胞色素氧化酶、过氧化物酶等酶的组成成分，是微生物有氧氧化必不可少的元素；硼离子作为刺激因子，可刺激菌体的高活性代谢。在发酵后期添加上述微量元素液，能够补充微生物生长所需要的微量离子和酶合成所需要的辅酶离子，使菌体后期的生长活性得到延续，有利于提高菌体活力和蛋白生产量。
本发明还提供了一种生产左旋多巴的发酵方法，包括如下步骤：
(1)将重组大肠杆菌种子液接种于发酵培养基中进行发酵，控制发酵的ph为6.0～9.0，发酵温度为34～38℃，发酵do≥30％；
(2)当发酵液的od600为25～30时，向发酵液中加入诱导剂进行低温诱导蛋白表达；当发酵液的od600达到30～60时，在所述发酵液中加入上述微量元素液，所述微量元素液加入量为所述发酵液体积的0.5～1％；
(3)当发酵罐内od不增加时停止发酵，收集菌体，提取菌体中的左旋多巴。
本发明对重组大肠杆菌的种子液来源没有特殊限制，优选将重组大肠杆菌菌种进行分离纯化后，在种子培养基中对菌种进行培养，制备重组大肠杆菌的种子液。
本发明对重组大肠杆菌的菌种来源没有特殊限定，可以采用本领域技术人员熟知的能够生产左旋多巴的重组大肠杆菌。在本发明具体实施例中采用的是基因工程菌e.colim15，对菌种来源没有限制。
本发明对重组大肠杆菌的分离纯化方法没有特殊限制，采用本领域的常规分离纯化方法即可。本发明具体实施例中对重组大肠杆菌采用平板划线法进行分离纯化。本发明中，重组大肠杆菌的平板培养基配方(g/l)优选为：酵母提取物2～8g、蛋白胨4～11g、氯化钠5～12g、琼脂粉14～23g。在无菌环境下用接种环取一环划平板，37℃恒温培养12～16h，获得分布均匀的平板单菌落。用灭菌接种针从平板挑取重组大肠杆菌单菌落接种至液体培养基中，培养基成分同平板培养基，在34～38℃，150～400rpm培养12～16h，得到活化后的重组大肠杆菌。
将活化后的重组大肠杆菌进行种子培养，获得种子液。种子扩大培养的过程可以采用本领域的常规操作进行培养，如摇瓶或种子罐进行逐级扩大培养。在本发明具体实施例中，优选采用摇瓶种子培养。在本发明中，种子培养基配方(g/l)优选为：酵母提取物15～36g、蛋白胨7～18g、磷酸二氢钾1.5～4.5g、三水磷酸氢二钾12～17g、甘油3～9ml。配方直接采用碳氮源和磷酸缓冲液进行搭配培养，可满足菌体种子扩大培养的所需的基本营养元素，使菌体快速适应，配方简单，效果好。将上述活化的重组大肠杆菌以2％～5％的接种量从试管中移取1～3ml菌液接种至灭菌的摇瓶种子培养基内，在34～38℃，150～400rpm下培养4～5h，得到重组大肠杆菌种子液。经革兰氏染色检查，菌体形态为饱满的短杆状。
将得到的重组大肠杆菌种子液接种于发酵培养基中进行发酵。本发明中，发酵培养基的配方(g/l)优选为：酵母膏5～14g，蛋白胨7～13g，十二水磷酸氢二钠10～18g，硫酸钠5～10g，氯化钠0.1～1.5g，氯化铵1～6g，三水磷酸氢二钾7～16g，柠檬酸0.1～1g，七水硫酸镁0.1～1g，甘油1～10ml。优选种子液的接种量为发酵培养基重量的1％～5％，进一步优选为2％～4％。控制发酵过程中发酵液的ph为6.0～9.0，进一步为7.0～8.0；发酵温度为34～38℃，进一步为35～37℃。本发明中，优选发酵在发酵罐中进行。本发明对发酵罐的结构和种类没有特殊限制，可以采用本领域中的常规发酵罐。通过调节发酵罐的转速、通气量及罐压控制发酵do≥30％。优选发酵罐的转速为100～300rpm，进一步优选为150～260rpm；发酵罐的通气量为0.5～1.5vvm，进一步优选为0.8～1.3vvm；发酵罐的罐压为0.01～1mpa，进一步优选为0.1～0.8mpa。在发酵过程中，发酵培养基中的营养成分如氮源和碳源能够满足重组大肠杆菌的生长需求，发酵液的do和ph值稳定的保持在上述范围内。
若培养过程中出现发酵液的do和ph值同时上升，说明发酵液中的营养成分不能够满足重组大肠杆菌的生长需求，此时则需要对发酵液进行补料。在本发明中，优选补料培养基配方(g/l)为：酵母膏10～50g、蛋白胨20～60g、甘油200～600g，进一步优选为酵母膏20～40g、蛋白胨30～50g、甘油300～500g。此补料培养基满足了菌体在基础料消耗殆尽对营养物质的需求，尤其是碳氮源，碳氮源配比适宜，菌体量继续快速增长。控制补料培养基的补料速度以保证菌体生长。优选补料时维持发酵液的do在20％～40％，进一步优选为24～36％。
发酵过程中，对发酵液的od600进行定期监测，以明确发酵状态。本发明具体实施例中，优选每一小时监测一次。当发酵液的od600为25～30时，在发酵液中加入诱导剂进行低温诱导蛋白表达。本发明对诱导剂的种类和用量没有特殊的限制，采用本领域的常规诱导剂及应用量即可。在本发明具体实施例中，采用异丙基硫代半乳糖苷(iptg)作为低温诱导的诱导剂。诱导剂的浓度优选为10～80mg/ml，进一步优选为30～70mg/ml。所述诱导剂加入的量为发酵液体积的0.03～0.2％，进一步的为0.05～0.15％。其他培养条件不变。
本发明在低温诱导发酵过程中，当发酵液的od600达到20～80，优选为40～70时，在发酵液中加入本发明的微量元素液。本发明中，所述微量元素液的配方(g/l)为：znso4·7h2o1～10g,柠檬酸铁铵2～8g，mnso4·5h2o1～5g,h3bo35～13g,fecl33～9g。。优选所述微量元素液加入的体积为所述发酵液体积的0.1～2％，进一步优选为0.5～1％。本发明所述微量元素液在加入前，进行过滤除菌。本发明优选采用0.22μm的滤膜对为微量元素液进行过滤。本发明对微量元素液的除菌方式没有特殊限定，采用本领域常规的灭菌方式进行除菌即可。
当发酵液的od不再增加时，结束发酵，放罐。放罐前将发酵温度降至5～15℃，停止补料，发酵液的ph和do回升，维持30～60min。使发酵过程中的积累的代谢副产物消耗殆尽。放罐后，收集发酵液中的菌体。本发明中，将发酵罐中的发酵液在4℃低温下进行离心，收集菌体。本发明对从菌体中提取左旋多巴的方法没有特殊限定，可以采用本领域技术人员熟知的提取方法。
采用本发明的发酵方法，能够使发酵周期在20h左右，发酵后菌体od600在80以上，菌体湿重大于100g/l。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
微量元素液按照下列配方进行配制：
微量元素液的配方(g/l)：每升微量元素液中含有znso4·7h2o8g,柠檬酸铁铵5g，mnso4·5h2o3g,h3bo39g,fecl35g。
实施例2
微量元素液按照下列配方进行配制：
微量元素液的配方(g/l)：每升微量元素液中含有znso4·7h2o10g,柠檬酸铁铵8g，mnso4·5h2o5g,h3bo313g,fecl39g。
实施例3
微量元素液按照下列配方进行配制：
微量元素液的配方(g/l)：每升微量元素液中含有znso4·7h2o3g,柠檬酸铁铵4g，mnso4·5h2o2g,h3bo37g,fecl34g。
实施例4
采用实施例1的微量元素液进行左旋多巴发酵培养，步骤如下：
按照下列配方配制发酵培养基：
发酵培养基配方(g/l)：酵母膏10g、蛋白胨10g、十二水磷酸氢二钠15g、硫酸钠7g、氯化钠1.0g、氯化铵4g、三水磷酸氢二钾10g、柠檬酸0.5g、七水硫酸镁0.5g、甘油5ml。
将配制好的发酵培养基注入发酵罐中，并接种基因工程菌e.colim15种子液，接种量为5％(v/v)。控制发酵液的ph为7.0，发酵温度为35℃。调节发酵罐的转速为200rpm，通气量为1.0vvm，罐压为0.5mpa，控制发酵液的do≥30％。
当发酵液的od600为30时，将发酵温度降至20℃，加入发酵液体积0.15％的诱导剂iptg继续培养；iptg的浓度为20mg/ml。当发酵液的od600达到50时，在所述发酵液中加入0.8％(v/v)微量元素液。
当发酵液的od不增加时放罐，总发酵周期为21h。发酵结束时菌液od600为85，湿重为110g/l。
低温4℃下离心收集菌体，提取菌体中的左旋多巴。
实施例5
采用实施例1的微量元素液进行左旋多巴发酵培养，步骤如下：
按照下列配方配制发酵培养基：
发酵培养基配方(g/l)：酵母膏5g、蛋白胨7g、十二水磷酸氢二钠10g、硫酸钠5g、氯化钠0.2g、氯化铵1g、三水磷酸氢二钾7g、柠檬酸0.2g、七水硫酸镁0.1g、甘油2ml。
将配制好的发酵培养基注入发酵罐中，并接种基因工程菌e.colim15种子液，接种量为3％(v/v)。控制发酵液的ph为8.0，发酵温度为38℃。调节发酵罐的转速为100rpm，通气量为0.6vvm，罐压为0.1mpa，控制发酵液的do≥30％。
发酵过程中，当发酵液的do和ph值同时上升时，向发酵罐中进行补料，控制补料速度保证菌体生长。维持发酵液do在20％～40％。其中补料培养基按照下列配方进行配制：
补料培养基配方(g/l)：酵母膏30g、蛋白胨35g、甘油400g。
当发酵液的od600为25时，将发酵温度降至20℃，加入发酵液体积0.05％的诱导剂iptg继续培养；iptg的浓度为70mg/ml。当发酵液的od600达到50时，在所述发酵液中加入0.5％(v/v)微量元素液。
当发酵液的od不增加时放罐，总发酵周期为20h。发酵结束时菌液od600为90，湿重为115g/l。
低温4℃下离心收集菌体，提取菌体中的左旋多巴。
实施例6
采用实施例1的微量元素液进行左旋多巴发酵培养，步骤如下：
按照下列配方配制发酵培养基：
发酵培养基配方(g/l)：酵母膏14g、蛋白胨13g、十二水磷酸氢二钠18g、硫酸钠10g、氯化钠1.5g、氯化铵6g、三水磷酸氢二钾46g、柠檬酸1g、七水硫酸镁1g、甘油10ml。
将配制好的发酵培养基注入发酵罐中，并接种基因工程菌e.colim15种子液，接种量为1％(v/v)。控制发酵液的ph为6.0，发酵温度为34℃。调节发酵罐的转速为300rpm，通气量为1.5vvm，罐压为1mpa，控制发酵液的do≥30％。
发酵过程中，当发酵液的do和ph值同时上升时，向发酵罐中进行补料，控制补料速度保证菌体生长。维持发酵液do在20％～40％。其中补料培养基按照如下配方进行配制：
补料培养基配方(g/l)：酵母膏50g、蛋白胨60g、甘油600g。
当发酵液的od600为27时，将发酵温度降至20℃，加入发酵液体积0.1％的诱导剂iptg继续培养；iptg的浓度为50mg/ml。当发酵液的od600达到50时，在所述发酵液中加入1％(v/v)微量元素液。
当发酵液的od不增加时放罐，总发酵周期为18h。发酵结束时菌液od600为110，湿重为140g/l。
低温4℃下离心收集菌体，提取菌体中的左旋多巴。
实施例7
采用实施例2的微量元素液进行左旋多巴发酵培养，步骤同实施例6。
发酵结束时，总发酵周期为20h，菌液od600为100，湿重为130g/l。
对比例1
发酵方法中除在发酵后期没有添加微量元素液外，其余方法与实施例4相同。发酵结束后，发酵周期为20h，发酵液od600为50，菌体湿重为65g/l。
对比例2
发酵方法中除在发酵后期没有添加微量元素液外，其余方法与实施例5相同。发酵结束后，发酵周期为20h，发酵液od600为70，菌体湿重为90g/l。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。