可用于肿瘤鉴定的新型DNA甲基化标志物TAGMe-5及其用途的制作方法

本发明属于肿瘤学和表观遗传学领域，更具体地，本发明涉及可用于肿瘤鉴定的新型dna甲基化标志物tagme-5及其用途。

背景技术：

1、恶性肿瘤是一种复杂的疾病，严重威胁人类的生命健康。在遗传和致癌因素的作用下，引起正常细胞遗传物质dna的损伤、突变，并且同时伴随着多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，使得癌细胞不受控制得生长和增殖，侵犯临近正常组织，转移到远端的组织器官。侵袭和转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，也是肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤的转移包括局部侵袭、内渗进入邻近的血管或淋巴管、在循环系统内的生存及运输、从循环系统的管腔外渗到远端组织、在远端组织克隆形成可见的肿瘤。肿瘤的转移是肿瘤细胞、宿主细胞和肿瘤微环境之间一系列复杂的相互作用，相互影响的连续过程，多条通路，多个基因，多种细胞因子参与了整个的侵袭和转移的过程。同时，表观遗传学(epigenomics)因素也与恶性肿瘤的发生、发展或转移等密切相关。

2、表观遗传学(epigenomics)是研究基因在不发生dna序列改变的情况下，基因功能发生的可遗传的变化，并最终导致了表型的变化的一门学科。表观遗传学主要包括dna甲基化(dna methylation)，组蛋白修饰(histone modification)，microrna水平变化等生化过程；dna甲基化是研究较为深入的表观遗传学机制，在包括诊断和治疗在内的肿瘤临床实践中有着重要的应用前景。dna甲基化是指生物体内在dna甲基转移酶(dnamethyltransferase，dmt)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(sam)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。dna甲基化可以发生在腺嘌呤的n-6位、胞嘧啶的n-4位、鸟嘌呤的n-7位或胞嘧啶的c-5位等。但在哺乳动物中dna甲基化主要发生在5’-cpg-3’的c上，生成5-甲基胞嘧啶(5mc)。

3、在基因组中98％以上的cpg二核苷酸散在的分布位于具有转录依赖性的转座潜能的重复序列中。在正常细胞中，这些cpg处于高度甲基化/转录沉默的状态，而在肿瘤细胞中这些cpg发生了广泛的去甲基化，导致重复序列的转录、转座子的活化，基因组的高度不稳定性和原癌基因转录增强。余下的占总量2％左右的cpg密集地分布于较小的区域(cpg岛)。约40-50％的基因启动子区域或其附近存在cpg岛，暗示dna甲基化可能参与该类基因转录调控机制。在肿瘤细胞中，这些原本在正常细胞中处于低甲基化状态的cpg岛会发生高甲基化而导致基因的转录失活。受影响的基因包括dna修复基因，细胞周期控制基因和抗凋亡基因等抑癌基因。因此这种肿瘤细胞dna异常甲基化谱式，已经成为一个新的肿瘤生物标志物研究领域。基因组dna经亚硫酸氢盐处理后，进行pcr(甲基化特异pcr，msp)检测可有效地确定受试dna片段的特定位点的甲基化状态，作为一种定性分析手段，msp可从含10000个正常细胞的复杂临床样品中检出个位数的甲基化异常的肿瘤细胞，只要这两者受试dna特定区域的甲基化状态完全相反。

4、基于dna甲基化分子标志物的肿瘤早筛虽然逐渐获得人们的关注，但真正应用在临床的方案却少之又少，所以有关肿瘤的筛查归于特检项目。另外，现有的肿瘤标志物大多仅针对特定的肿瘤类型，可用于多癌种筛查的标志物几乎没有。因此，寻找可用于诊断、预后和预测癌症发生发展的分子靶标，对于癌症的早期筛查、临床干预、以及指导患者治疗具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可用于肿瘤鉴定的新型dna甲基化标志物tagme-5及其用途。

2、在本发明的第一方面，提供分离的多核苷酸或由其转变而来的多核苷酸在制备鉴定肿瘤的试剂或试剂盒中的用途；其中，所述的多核苷酸包括：(1)seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸tagme-5，或含有其中至少1个修饰的cpg位点的多核苷酸片段，或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中，由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变。

3、在另一实施方式中，所述seq id no:1还包括其序列变体，或同源序列。

4、在另一实施方式中，所述序列变体或同源序列为与所述seq id no:1所示序列相比，具有80％以上、85％以上、90％以上、92％以上、95％以上、96％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上、99.8％以上序列同一性的序列。相应地，也包括由所述序列变体或同源序列转变(非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变)而来的多核苷酸。

5、在另一实施方式中，所述的鉴定包括诊断、检测、筛查或预后评估。

6、在另一实施方式中，所述修饰包括5-甲基化修饰(5mc)、5-羟甲基化修饰(5hmc)、5-醛甲基化修饰(5-fc)或5-羧甲基化修饰(5-cac)。

7、在另一实施方式中，所述由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为seq id no:2所示核苷酸序列的多核苷酸。

8、在另一实施方式中，所述至少1个修饰的cpg位点为seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第1～22号的任一“cpg”或其组合(如2～22个，更具体如3，5，8，10，11，12，15，20个)；较佳地为seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第9～16号的任一cpg位点或其组合、第1～8号“cpg”或其组合、或第17～22号cpg位点或其组合。

9、在另一实施方式中，所述多核苷酸片段为seq id no:1中第277～392位或第247～421位所示核苷酸序列的多核苷酸。

10、在另一实施方式中，所述的肿瘤包括(但不限于)：呼吸系统肿瘤，消化系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，血液系统肿瘤，神经系统肿瘤，头颈部肿瘤，皮肤系统肿瘤，内分泌系统肿瘤或骨骼系统肿瘤。

11、在另一实施方式中，所述肿瘤包括：肺癌，肝癌，前列腺癌，宫颈癌，子宫内膜癌，尿路上皮癌，胆道肿瘤，胃癌，乳腺癌，食管癌，脑胶质瘤，结直肠癌，白血病，胰腺癌，甲状腺癌，黑色素瘤，鼻咽癌，口腔癌，喉癌，骨肉瘤，淋巴瘤，肾细胞癌或卵巢癌。

12、在另一实施方式中，所述的鉴定肿瘤针对肿瘤(包括早期、中期或晚期的肿瘤)或其癌前病变。

13、在另一实施方式中，所述鉴定肿瘤针对的样本包括(但不限于)：组织样本、血液样本、体液样本。

14、在另一实施方式中，所述样本包括(但不限于)：石蜡包埋样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本等。

15、在本发明的另一方面，提供一种制备鉴定肿瘤的试剂的方法，包括：(a)提供分离的多核苷酸或由其转变而来的多核苷酸，包括(1)seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸tagme-5，或含有其中至少1个修饰的cpg位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变；较佳地，所述至少1个修饰的cpg位点为seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第1～22号的任一cpg位点或其组合；较佳地为seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第9～16号的任一cpg位点或其组合、第1～8号cpg位点或其组合、或第17～22号cpg位点或其组合；较佳地，所述多核苷酸片段为seq id no:1中第277～392位或第247～421位所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)以(a)的多核苷酸作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的cpg位点修饰情况的检测试剂。

16、在另一实施方式中，所述鉴定肿瘤的试剂包括但不限于：引物，探针，芯片或试纸。

17、在另一实施方式中，对于所述靶序列，可以制备一组或多组试剂。

18、在另一实施方式中，所述的检测试剂被整合于芯片上。

19、在本发明的另一方面，提供一种特异性检测靶序列的cpg位点修饰情况的试剂或试剂组合，其中所述的靶序列是：(1)seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸tagme-5，或含有其中至少1个修饰的cpg位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变；较佳地，所述的试剂或试剂组合针对包含所述靶序列的基因序列，较佳地，所述的基因序列包括基因panel或基因群组；较佳地，所述的试剂或试剂组合包括：扩增seq id no:1所示核苷酸序列中第277～392位或第247～421位的引物。

20、在另一实施方式中，所述的试剂或试剂组合为：含有seq id no:3中第29-58位序列和seq id no:4中第28-57位序列的引物。

21、在另一实施方式中，所述的试剂或试剂组合为：seq id no:3和seq id no:4序列的引物。

22、在另一实施方式中，所述的试剂或试剂组合为：seq id no:7-16所示任一序列连接seq id no:3中第29-58位序列形成的引物，seq id no:17-26所示任一序列连接seq idno:4中第28-57位序列形成的引物。

23、在另一实施方式中，所述的试剂或试剂组合还包括：seq id no:5和seq id no:6序列的引物。

24、在另一实施方式中，所述的试剂或试剂组合为：seq id no:27和seq id no:28所示序列的引物。

25、在另一实施方式中，所述的试剂或试剂组合为：seq id no:29和seq id no:30所示序列的引物。

26、在本发明的另一方面，提供所述的试剂或试剂组合的用途，用于制备鉴定肿瘤的试剂盒。

27、在本发明的另一方面，提供一种用于进行鉴定肿瘤的试剂盒，其中包括所述的试剂或试剂组合。

28、在另一实施方式中，所述试剂盒中还可包括但不限于：dna纯化试剂，dna提取试剂，bisulfite，pcr扩增试剂。

29、在另一实施方式中，所述的试剂盒中还包括：用于标明检测操作步骤和结果判定标准的说明书。

30、在本发明的另一方面，提供一种分析待测样本的甲基化水平的方法，包括：(i)从待测样本中获取的多核苷酸；和(ii)分析所提取的多核苷酸中靶序列或其片段的cpg位点修饰情况，所述的靶序列是：(1)seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸tagme-5，或含有其中至少1个修饰的cpg位点的多核苷酸片段；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中所述转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变；seq id no:1所示核苷酸序列经转变而来的多核苷酸，对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变。

31、在另一实施方式中，检测所提取的多核苷酸中靶序列的cpg位点修饰情况的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化特异pcr、甲基化敏感限制性内切酶酶切法、甲基化芯片法、qpcr法、数字pcr法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、dna富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、hplc法、massarray，或它们的组合。

32、在另一实施方式中，所述分析所提取的多核苷酸中靶序列的cpg位点修饰情况的方法包括：(i)对所提取的多核苷酸进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用bisulfite处理步骤(i)所述的核酸；和(ii)分析经(i)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。

33、在另一实施方式中，利用bisulfite处理步骤(i)所述的多核苷酸；和(ii)分析经(i)处理的多核苷酸中所述的靶序列的修饰情况。

34、在另一实施方式中，甲基化水平异常是指该多核苷酸cpg中的c发生高度甲基化。

35、在另一实施方式中，其它其他甲基化检测方法及未来新开发的甲基化检测方法也可被应用于本发明中。

36、在另一实施方式中，所述分析甲基化水平的方法不是诊断性的方法，也即其不以直接获得疾病的诊断结果为目的。

37、在另一实施方式中，所述检测样品的甲基化水平的方法为体外方法。

38、在另一实施方式中，所述甲基化敏感限制性内切酶为对其识别位点含有甲基化碱基敏感的限制性内切酶；包括但不限于：hhai，bmgbi，haeii，rrui，taii、bsu15i、hin6i、hpych4iv、nari等其中一或多种的组合。

39、在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸或其转变而来的多核苷酸，所述的多核苷酸包括：(1)seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸tagme-5，或含有其中至少1个修饰的cpg位点的多核苷酸片段；较佳地，所述至少1个修饰的cpg位点为seq id no:1所示核苷酸序列的多核苷酸中选自第9～16号的任一cpg位点或其组合、第1～8号cpg位点或其组合、或第17～22号cpg位点或其组合；较佳地，所述多核苷酸片段为seq id no:1中第277～392位或第247～421位所示核苷酸序列的多核苷酸；或(2)与(1)的多核苷酸或片段在序列上互补的多核苷酸；其中，由分离的多核苷酸转变而来的多核苷酸为对应于(1)或(2)的多核苷酸，其非修饰的胞嘧啶转变为t或u，而其修饰的cpg位点的胞嘧啶c不变。

40、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。