检测三种猪的呼吸道细菌的荧光PCR引物探针组合及冻干试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测，具体涉及检测三种猪的呼吸道细菌的荧光pcr引物探针组合及冻干试剂盒。

背景技术：

1、副猪嗜血杆菌病，又称格拉泽氏病病(glasser's disease)，临床上表现体温升高、关节肿胀、呼吸困难、多发性浆膜炎、关节炎，是导致保育猪死亡的一个主要原因，给养猪业带来巨大的经济损失。副猪嗜血杆菌病由副猪嗜血杆菌(haemophilus parasuis,hps)引起，革兰氏阴性杆菌，有15个以上血清型，其中血清型以4、5、13型最为常见。该菌在培养平板上一般难以分离和培养，菌落小而透明，需要额外添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)。

2、链球菌病是一种人畜共患病，可引起脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎和肺炎，主要表现为发热和严重的毒血症状，而猪链球菌是猪的一种常见细菌病，主要表现为猪的败血性和局灶性淋巴结化脓性病症，在各个日龄段的猪均可发病。猪链球菌共有35个血清型，致病性血清型主要在1-9型，其中较常见的为血清型2型。猪链球菌是一种革兰阳性球菌，菌落细小，呈圆形或卵圆形，直径1～2mm，常呈链状排列，可在血平板上生长形成溶血环。

3、猪传染性胸膜肺炎病是由胸膜肺炎放线杆菌引起猪的一种高度传染性病，以急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎为特征，急性型呈现高死亡率，给集约化养猪业造成巨大的经济损失。我国主要流行的以血清型1、3、7型为主，其次为血清型2、4、5、10型。胸膜肺炎放线杆菌具有多形性，革兰氏阴性菌，在普通培养基上不生长，需添加v因子才能生长，长成圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐的灰白半透明小菌落。

4、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌都是猪的呼吸道疾病，主要由空气传播和接触性传播，它们具有协同致病作用，这样的协同作用可提高呼吸道疾病的发病率并增加疾病的严重程度。临床诊断上，由于三种细菌性疾病均是猪呼吸道疾病综合征的常见重要病原体，且往往是混合感染，单一的检测方法容易耽误最佳诊疗时机且耗时耗力。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测三种猪的呼吸道细菌的荧光pcr引物探针组合及冻干试剂盒，本发明提供了利用生物发酵/转化方式生产香草酸的菌种及方法，并提供了基因改造菌株，从而产生香草醛的方法。

2、本发明提供了引物组，包括如下①～③中至少一项：

3、①、用于扩增副猪嗜血杆菌的引物组，其具有如seq id no:1和seq id no:2所示的核苷酸序列；

4、②、用于扩增猪链球菌的引物组，其具有如seq id no:3和seq id no:4所示的核苷酸序列；

5、③、用于扩增猪胸膜肺炎放线杆菌的引物组，其具有如seq id no:5和seq id no:6所示的核苷酸序列。

6、与其他引物的设计相比，本发明提供的上述引物组能够更好的特异性识别并复制扩增三种病原菌，从而获得更好更准确的检测结果。

7、本发明提供了探针组，包括如下ⅰ～ⅲ中至少一项：

8、ⅰ、用于扩增副猪嗜血杆菌的探针，其具有如seq id no:7所示的核苷酸序列；

9、ⅱ、用于扩增猪链球菌的探针，其具有如seq id no:8所示的核苷酸序列；

10、ⅲ、用于扩增猪胸膜肺炎放线杆菌的探针，其具有如seq id no:9所示的核苷酸序列。

11、与其他探针的设计相比，本发明提供的上述探针组能够更好的特异性识别并复制扩增三种病原菌，从而获得更好更准确的检测结果

12、在一些实施例中，所述探针两端分别修饰荧光报告基团和猝灭基团，所述荧光报告基团包括fam、hex、cy5、joe和rox中的至少一种，所述猝灭基团包括bhq1和bhq2中的至少一种。

13、在一些具体实施例中，所述用于扩增副猪嗜血杆菌的探针的荧光报告基团和猝灭基团分别为hex和bhq1，所述用于扩增猪链球菌的探针的荧光报告基团和猝灭基团分别为cy5和bhq2，所述用于扩增猪胸膜肺炎放线杆菌的探针的荧光报告基团和猝灭基团分别为fam和bhq1。

14、本发明提供了所述的引物组和/或所述的探针组在制备检测呼吸道病原菌的试剂和/或试剂盒中的应用。

15、本发明提供了检测呼吸道病原菌的试剂或试剂盒，其包括所述的引物组和/或所述的探针组。

16、在一些实施例中，其还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂包括d-海藻糖、d-山梨醇和peg20000中的至少一种。

17、在一些具体实施例中，所述冻干保护剂包括400mm d-海藻糖、20mm d-山梨醇和2mm peg20000。

18、在一些实施例中，其还包括pcr反应液。

19、本发明提供了所述的试剂的制备方法，包括如下步骤：

20、取所述的引物组和/探针组、冻干保护剂和pcr反应液混合、冻干后，获得所述的试剂。

21、在一些实施例中，所述冻干包括如下步骤：

22、(1)、预冻阶段：预冻-45℃，4h；

23、(2)、干燥阶段：维持-45℃，抽真空至10pa，6h；

24、(3)、升华阶段：升高温度至20℃，维持10pa，4h。

25、本发明提供了副猪嗜血杆菌、猪链球菌和胸膜肺炎放线杆菌的检测方法，其包括采用所述的试剂或试剂盒对样本进行检测。

26、本发明提供了同时检测副猪嗜血杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌的引物组、探针组及检测试剂和试剂盒。本发明采用三重荧光定量pcr的方法，经过优化的引物探针序列有效提高了检测的灵敏度和特异性，并且本方法将三重荧光定量pcr的试剂制成冻干试剂，冻干前后试剂性能变化小，能够有效地减少人员操作误差提高操作效率，能够稳定保存满足现场一线的使用，为猪的呼吸道传染性疾病的及早及时诊断提供了新的参考方法。

技术特征：

1.引物组，其特征在于，包括如下①～③中至少一项：

2.探针组，其特征在于，包括如下ⅰ～ⅲ中至少一项：

3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述探针两端分别修饰荧光报告基团和猝灭基团，所述荧光报告基团包括fam、hex、cy5、joe和rox中的至少一种，所述猝灭基团包括bhq1和bhq2中的至少一种。

4.权利要求1所述的引物组和/或权利要求2或3所述的探针组在制备检测呼吸道病原菌的试剂和/或试剂盒中的应用。

5.检测呼吸道病原菌的试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的引物组和/或权利要求2或3所述的探针组。

6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，其还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂包括d-海藻糖、d-山梨醇和peg20000中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述冻干保护剂包括400mm d-海藻糖、20mm d-山梨醇和2mm peg20000。

8.根据权利要求5～7任一项所述的试剂或试剂盒，其特征在于，其还包括pcr反应液。

9.权利要求5～8任一项所述的试剂的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述冻干包括如下步骤：

技术总结
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及检测三种猪的呼吸道细菌的荧光PCR引物探针组合及冻干试剂盒。本发明提供了同时检测副猪嗜血杆菌、猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌的引物组、探针组及检测试剂和试剂盒。本发明采用三重荧光定量PCR的方法，经过优化的引物探针序列有效提高了检测的灵敏度和特异性，并且本方法将三重荧光定量PCR的试剂制成冻干试剂，冻干前后试剂性能变化小，能够有效地减少人员操作误差提高操作效率，能够稳定保存满足现场一线的使用，为猪的呼吸道传染性疾病的及早及时诊断提供了新的参考方法。

技术研发人员：牛旻,刘海峰,李亚楠,张娇蕊,郭冠瑛
受保护的技术使用者：河南兴华生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16