编码瘦素的核酸分子、组合物及应用的制作方法

本发明涉及制药，尤其是涉及编码瘦素的核酸分子、组合物及应用。

背景技术：

1、这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然的构成现有技术。

2、瘦素(leptin)是一种由脂肪细胞分泌的激素，对于调节体重和能量平衡起着重要的作用。它由leptin基因编码，主要通过血液循环传递信号到大脑中的下丘脑，特别是到饱腹中枢和体重调节中枢。瘦素的主要功能是抑制食欲和促进能量消耗。当脂肪细胞中的脂肪含量增加时，它们会释放更多的瘦素进入血液中。瘦素通过与下丘脑中的瘦素受体(lep-r)结合，传递信号，抑制食欲中枢，减少饥饿感，并提高能量消耗。此外，瘦素还参与调节生殖功能、免疫系统、骨骼形成等多个生理过程。

3、瘦素缺乏症的临床表现有极度肥胖、食欲亢进、生长迟缓、早熟、代谢紊乱、甲状腺功能降低、血脂异常等。瘦素缺乏症发病率比较低，据统计全球大约有不到1000例已知的瘦素缺乏症患者。

4、瘦素替代疗法是目前唯一的治疗瘦素缺乏症的方法，旨在通过补充外源性的瘦素来恢复正常的瘦素水平和代谢平衡。有研究文献表明，瘦素替代疗法对先天性瘦素缺乏及其相关的代谢类疾病，如脂肪营养不良、下丘脑闭经有显著效果；对体重减轻有辅助效果。目前市面上仅有一种瘦素替代药物，即metreleptin，它主要用于治疗由于单基因瘦素缺乏综合征(例如儿童早期发病的常染色体显性遗传性瘦素缺乏综合征)引起的严重瘦素缺乏。metreleptin是一种重组甲硫基人瘦素，难以生产并且具有短的半衰期，使用方法为每天皮下注射一次。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一种编码瘦素的核酸分子，采用该核酸分子制备得到的核酸分子药物，以期能够补充瘦素，弥补目前瘦素替代疗法药物的空白。

2、为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、在一些实施方案中，本发明提供编码瘦素的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括(a)～(b)任一种：

4、(a)具有seq id no.10～21任一条所示的编码瘦素的核苷酸序列的mrna分子；

5、(b)在(a)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，具有编码瘦素功能且与原核苷酸序列具有相同gc碱基对百分比含量和/或cai值的由(a)衍生的mrna分子。

6、在一些实施方案中，所述mrna分子的gc碱基对百分比含量为50％～70％，所述mrna分子的cai值为0.7～0.97。

7、在一些实施方案中，所述mrna分子的gc碱基对百分比含量为50％～60％，所述mrna分子的cai值为0.7～0.8。

8、在一些实施方案中，所述核酸分子包括(a)～(b)任一种：

9、(a)具有seq id no.12～21任一条所示的编码瘦素的核苷酸序列的mrna分子；

10、(b)在(a)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，具有编码瘦素功能且与原核苷酸序列具有相同gc碱基对百分比含量和/或cai值的由(a)衍生的mrna分子。

11、在一些实施方案中，所述核酸分子包括(a)～(b)任一种：

12、(a)具有seq id no.12～16任一条所示的编码瘦素的核苷酸序列的mrna分子；

13、(b)在(a)限定的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸，具有编码瘦素功能且与原核苷酸序列具有相同gc碱基对百分比含量和/或cai值的由(a)衍生的mrna分子。

14、在一些实施方案中，所述mrna分子还包括utr序列、5’帽子和poly(a)尾序列。

15、在一些实施方案中，所述5’帽子包括7-甲基-鸟苷-5’-三磷酸-5’-腺苷、鸟苷-5’-三磷酸-5’-腺苷、7-甲基-鸟苷-5’-三磷酸-5’-鸟苷、鸟苷-5’-三磷酸-5’-鸟苷和m7g(5’)(2’-omea)pg中的一种或几种。

16、在一些实施方案中，所述5’帽子为m7g(5’)(2’-omea)pg。

17、在一些实施方案中，所述poly(a)尾序列包含数量为60～120的碱基a。

18、在一些实施方案中，所述poly(a)尾序列包含数量为100的碱基a。

19、在一些实施方案中，所述utr序列包括5’utr序列和3’utr序列。

20、在一些实施方案中，所述5’utr序列具有seq id no.1～4所示的核苷酸序列。

21、在一些实施方案中，所述5’utr序列具有seq id no.1所示的核苷酸序列。

22、在一些实施方案中，所述3’utr序列具有seq id no.5～8所示的核苷酸序列。

23、在一些实施方案中，所述3’utr序列具有seq id no.5所示的核苷酸序列。

24、在一些实施方案中，所述mrna分子中的一个或多个尿苷用修饰核苷进行置换。

25、在一些实施方案中，所述修饰核苷为假尿苷(ψ)、n1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5u)(m5u)。

26、在一些实施方案中，所述修饰核苷为n1-甲基-假尿苷(m1ψ)。

27、在一些实施方案中，本发明提供一种组合物，所述组合物包括前述实施方式所述核酸分子和包裹前述实施方式所述核酸分子的脂质纳米颗粒。

28、在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒组成包括dlin-mc3-dma、dscp、胆固醇和peg-dmg。

29、在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒按照摩尔份数计包括，20～50份的dlin-mc3-dma、5～20份的dscp、20～50份的胆固醇和1～5份的peg-dmg。

30、在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒按照摩尔份数计包括50份的dlin-mc3-dma、10份的dscp、38.5份的胆固醇和1.5份peg-dmg。

31、在一些实施方案中，本发明提供一种制备前述实施方式所述组合物的制备方法，所述制备方法包括：

32、(a)将编码瘦素的rna溶解于缓冲液，将浓度调整为0.05mg/ml～0.5mg/ml，得到水相；

33、(b)将dlin-mc3-dma、dscp、胆固醇和peg-dmg溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至5mg/ml～7mg/ml，得到有机相；

34、(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1：3的体积比混合，除去乙醇后浓缩至体系中的mrna的浓度为50μg/ml～1000μg/ml，得到所述组合物，所述组合物包括包裹前述实施方式所述核酸分子的脂质纳米颗粒。

35、在一些实施方案中，本发明提供一种前述实施方式所述核酸分子或前述实施方式所述组合物在制备瘦素替代疗法rna药物中的应用。

36、在一些实施方案中，所述rna药物的用途为补充瘦素。

37、在一些实施方案中，所述rna药物的用途为减轻瘦素缺乏症引起的体重增加。

38、在一些实施方案中，所述rna药物的用途为降低瘦素缺乏症患者的食量。

39、在一些实施方案中，所述rna药物的用途为降低瘦素缺乏症引起血糖升高。

40、本发明所述核酸分子或所述组合物与施用重组瘦素相比，具有给药周期长的优势：传统的施用重组瘦素需要每日给药一次或两次，本发明所述核酸分子或所述组合物可以每三天一次或每周一次给药。另外，本发明瘦素mrna经过碱基修饰(一个或多个尿苷用修饰核苷进行置换)，免疫原性低。