一种融合蛋白、质粒及其在HIV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价中的应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其涉及一种融合蛋白、质粒及其在hiv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价中的应用。

背景技术：

1、 获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome, aids)又称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, hiv)引起的全球性重大疾病。联合国在2018年的艾滋病报告中指出，过去的二十年间，hiv已经导致了7000万人感染，大约3500万人死亡。2018年新发感染hiv的人数有170万人，全球每年死于aids相关性疾病的患者仍高达数十万人。hiv有1型和2型两种亚型，其中1型是目前全球流行的主要毒株。

2、 hiv的基因组由两条相同的正链rna组成，全长约9.7 kb。其基因组包裹在一个病毒蛋白壳内，核衣壳外周是来源于宿主细胞膜的磷酸脂质双层和病毒编码的膜蛋白。hiv基因组含有3个结构基因gag、pol和env，其中gag基因序列编码核壳蛋白；env基因序列编码病毒感染细胞所必须的两种糖蛋白，即包膜糖蛋白gp120和gp41；pol基因序列编码病毒复制所必须的酶，即逆转录酶、结合酶和病毒蛋白酶。hiv蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶，仅以同型二聚体的形式活跃。它能够将hiv的gag基因和gag-pol基因表达的多聚蛋白裂解成病毒需要的蛋白。gag区携带病毒结构蛋白，而pol区含有病毒酶(蛋白酶、逆转录酶、rnase h和整合酶)。

3、 hiv蛋白酶在hiv病毒的成熟与复制过程中起到非常关键的作用，抑制该酶会产生无感染力的子代病毒，从而阻止病毒进一步感染。1995年，第一个具有全新作用机制的抗病毒化合物——沙奎那韦获得fda批准，它是一种hiv蛋白酶的拟肽抑制剂。随后出现了针对病毒感染不同步骤的其他病毒蛋白酶抑制剂和化合物。更多的蛋白酶抑制剂药物可以为治疗方案的搭配提供更多的选择。因此，开发针对病毒蛋白酶抑制剂的药效评价系统十分重要。

4、大多数高传染性病毒的细胞抗病毒实验需要在bsl-2+或者更高等级的实验室进行，然而这种实验室的资源相当短缺。目前所应用的体外大规模筛选及药效评价方法按检测原理主要分为两类：（1）竞争结合法：是主要的体外筛选方法，将现有蛋白酶固相化后加入待筛选药物与现有有效的药物竞争性结合固相化蛋白酶。其中待筛药物可带有检测标记如同位素、生物素、荧光物质等，进行检测。它是与现有蛋白酶抑制剂竞争结合位点，因此仅能筛选出已知蛋白酶抑制剂的同类物。对于针对序列不同的不能结合己知蛋白酶抑制剂的蛋白酶及耐药性蛋白酶的药物筛选及评价效果不好。（2）功能测定法：利用含蛋白酶酶切位点短肽的荧光淬灭分子来作为蛋白酶的底物，使用蛋白酶切割该底物后荧光基因与淬灭基团分离发出荧光，因此通过检测荧光强度即可判断所筛药物的活性，但此方法易受小分子化合物干扰出现假阳性问题。同时，许多体外活性良好的抑制剂因为其细胞膜通透性不好，在细胞内没有活性或活性很弱。

5、因此，开发一种简洁、安全、高通量和可重复性的蛋白酶活性以及相关蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台十分必要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种融合蛋白、质粒及其在hiv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价中的应用。

2、为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括hiv荧光报告蛋白及hiv蛋白酶pr，所述hiv荧光报告蛋白及hiv蛋白酶pr由自剪切2a短肽连接；所述hiv荧光报告蛋白是在野生型gfp荧光蛋白序列的特定位点中插入hiv蛋白酶pr的酶切序列得到的重组gfp基因，再将所述重组gfp基因插入真核表达载体后表达产生。

4、进一步地，所述hiv荧光报告蛋白具有与野生型gfp荧光蛋白相同或相近的激发荧光活性。

5、 可以理解地，本发明所述的hiv荧光报告蛋白是由野生型gfp（greenfluorescent protein，绿色荧光蛋白）改造得到，改造后的蛋白不影响gfp荧光蛋白原有的荧光活性。

6、 进一步地，所述蛋白酶pr的酶切序列插入于野生型gfp荧光蛋白的位置包括site15、site20以及site24；其中，site15位于如seq id no.4（madkqkn）所示的氨基酸序列的kq和kn之间；site20位于如seq id no.5（fegdtl）所示的氨基酸序列的eg和dt之间；site24位于如seq id no.6(dkqkngi )所示的氨基酸序列的qk和ng之间。

7、 在一些技术方案中，所述野生型gfp荧光蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示，site15位于gfp氨基酸序列的第158位与第159位氨基酸之间；site20位于gfp氨基酸序列的第117位与第118位氨基酸之间；site24位于gfp氨基酸的第159位与第160位氨基酸之间。

8、进一步地，所述hiv蛋白酶pr的酶切氨基酸序列为rvlaea和/或timmqr。

9、另一方面，本发明提供编码所述hiv荧光报告蛋白的重组基因。

10、本发明还提供一种表达载体，所述表达载体包含编码所述hiv荧光报告蛋白的基因序列及hiv蛋白酶pr的基因序列，所述表达载体共表达所述hiv荧光报告蛋白及蛋白酶pr。

11、进一步地，本发明提供一种质粒，所述质粒包含所述的表达载体，在所述表达载体中，将表达hiv荧光报告蛋白的质粒通过自剪切2a短肽与hiv蛋白酶pr连接。

12、本发明还提供所述的融合蛋白、所述的重组基因、所述的表达载体或所述的质粒在hiv蛋白酶抑制剂活性评估和筛选中的应用。

13、本发明另一方面还提供hiv蛋白酶活性的测定方法，包括以下步骤：

14、在表达hiv荧光报告蛋白的表达载体的质粒中通过2a短肽连接hiv蛋白酶pr，使hiv蛋白酶pr与hiv荧光报告蛋白在细胞中共表达，通过测定共表达体系的荧光信号强度来表征hiv蛋白酶pr的活性，荧光信号强度越低，表示hiv蛋白酶pr的活性越高，二者呈负相关。

15、本发明再一方面还提供hiv蛋白酶活性抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

16、将共表达hiv荧光报告蛋白和hiv蛋白酶pr的表达载体与候选蛋白酶抑制剂在细胞中共孵育作为实验组，同时设置不添加候选蛋白酶抑制剂的阴性对照，根据实验组相对于阴性对照的荧光信号强度的变化来筛选hiv蛋白酶活性抑制剂；

17、所述荧光信号强度的变化为荧光信号强度的提高。

18、本发明还提供用于筛选hiv蛋白酶活性抑制剂的试剂盒，其包括表达hiv荧光报告蛋白和hiv蛋白酶pr的表达载体或表达hiv荧光报告蛋白的质粒。

19、本发明原理如下：hiv荧光报告蛋白在细胞中表达出来后，其具有与野生型gfp荧光蛋白相同或相近的荧光活性。当hiv荧光报告蛋白与hiv蛋白酶pr共表达后，hiv蛋白酶pr会发生自剪切从而将自身释放出来与hiv荧光报告蛋白中的酶切底物发生作用，这会导致hiv荧光报告蛋白的结构被破坏，荧光作用减弱或消失。因此，当体系中不含有hiv蛋白酶pr或抑制剂或加入的候选抑制剂没有抑制效果时，hiv荧光报告蛋白能够正常发出荧光，检测到正常荧光信号强度。当体系hiv荧光报告蛋白与hiv蛋白酶pr共表达后，加入抑制剂或候选抑制剂，如果荧光信号强度提高，即说明抑制剂或候选抑制剂抑制了蛋白酶的活性，导致hiv蛋白酶pr不能与酶切底物发生作用，保留了hiv荧光报告蛋白完整结构，能够发挥荧光作用，表明抑制剂或候选抑制剂对蛋白酶靶点具有抑制效果，荧光强度与抑制效果呈正相关。

20、与现有技术相比，本发明所能达到的技术效果包括：

21、本发明提供的融合蛋白，包括hiv荧光报告蛋白及hiv蛋白酶pr，所述hiv荧光报告蛋白及hiv蛋白酶pr由自剪切2a短肽连接；所述hiv荧光报告蛋白是在野生型gfp荧光蛋白序列的特定位点中插入hiv蛋白酶pr的酶切序列得到的重组gfp基因，再将所述重组gfp基因插入真核表达载体后表达产生。通过在野生型gfp荧光蛋白的基因序列中插入与hiv蛋白酶的酶切底物序列，经表达后得到的hiv荧光报告蛋白具有与野生型gfp荧光蛋白相同或相近的激发荧光活性。进一步地，通过在hiv荧光报告蛋白的质粒上克隆表达hiv蛋白酶，使hiv荧光报告蛋白和hiv蛋白酶pr共表达，得到融合蛋白，可利用其荧光作用进行检测hiv蛋白酶的活性以及hiv蛋白酶抑制剂活性，能够形成hiv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。

22、本发明提供的hiv蛋白酶活性的测定方法和hiv蛋白酶活性抑制剂的筛选方法仅需使用共表达hiv荧光报告蛋白和hiv蛋白酶pr的表达载体，通过观察细胞的荧光信号即可获得定性结果，能够避免使用hiv活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，bsl-1级实验室即可满足实验要求，具有高效、准确、稳定、高通量、可重复的优点。