用于治疗阿尔茨海默病的组合物和方法与流程

50:1546-1555)。
随后，从遗传显性染色体
17
相关的额颞痴呆合并帕金森综合征
(ftdp-17)
中鉴定了
tau
基因中的突变
(foster
等人
,(1997)ann neurol 41:706-715
；
hutton
等人
,(1998)nature393:702-705
；
poorkaj
等人
,(1998)ann neurol 43:815-825
；
spillantini
等人
,(1998)proc natl acad sci u s a 95:7737-7741)。
9.tau
是一种微管相关蛋白，其结合至微管并促进微管组装
。tau
与微管的结合促进了微管聚合
(cleveland
等人
,(1977)j mol biol 116:227-247
；
weingarten
等人
,(1975)proc natl acad sci u s a 72:1858-1862)。
对
tau
序列的分析揭示，
tau
具有四个微管结合基序，其位于蛋白的c端末端的4个重复区域中，具有由较不保守的
13-14
个氨基酸分隔的保守的
18
个氨基酸长的结合元件
(lee
等人
,(2001)neurosci 24:1121-1159)。
在成人大脑中，通过选择性剪接产生长度范围为
325
至
441
个氨基酸的六种
tau
同种型
(goedert
等人
,(1988)proc natl acad sci u s a 85:4051-4055)。
10.tau
在中枢神经系统
(cns)
中大量表达，并主要位于轴突中，而
tau
在外周神经系统
(pns)
的轴突中以较低水平表达
。
在
cns
星形胶质细胞和少突胶质细胞中仅观察到低水平的表达
(cleveland
等人
,(1977)j mol biol 116:227-247
；
binder
等人
,(1985)j cell biol 101:1371-1378
；
lopresti
等人
,(1995)proc natl acad sci u s a 92:10369-10373)。
11.tau
是在正常条件下固有地无序且高度可溶的蛋白
(jeganathan
等人
,(2008)biochemistry47:10526-10539)
，而其通过异常修饰
(
诸如过度磷酸化
)
转变为不溶
(kopeikina
等人
,(2012)transl neurosci 3:223-233)。
过度磷酸化的
tau
蛋白可导致成对的螺旋纤丝
(phf)
和直纤丝的缠结的自组装，其涉及
ad、
额颞痴呆
(ftd)
和其它
tau
蛋白病的发病机理
。tau
蛋白的成对螺旋纤丝
(phf)
和过度磷酸化是
ad
和几种其它神经退行性
tau
蛋白病
(
包括
ftdp-17
和进行性核上性麻痹
(psp))
中两种最公认的分子特征
(lee
等人
,(2001)neurosci 24:1121-1159)。
12.tau
蛋白病是一组神经退行性障碍，其具有共同的病理特征
——
形成由纤丝状的过度磷酸化的
tau
蛋白构成的不溶性神经内聚集体
(lee
等人
,(2001)neurosci 24:1121-1159
；
delacourte,(2001)adv exp med biol 487:5-19)。
13.尽管它们的临床表现不同，但这些神经退行性障碍具有共同的病理特征：形成由纤丝状的过度磷酸化的
tau
蛋白构成的不溶性神经内聚集体
(lee
等人
,(2001)neurosci 24:1121-1159
；
delacourte,(2001)adv exp med biol 487:5-19)
，表明
tau
功能障碍是这些神经退行性疾病的促成因素
(lee
等人
,(2001)neurosci 24:1121-1159)。tau
基因中的一些突变导致形成由过度磷酸化的
tau
蛋白构成的纤丝
(crowther&goedert,(2000)j struct biol 130:271-279)。
14.热休克
70kda
蛋白
(
在本文中称为“hsp70”)
在多种物种的细胞中构成普遍存在的一类伴侣蛋白
(tavaria
等人
,(1996)cell stress chaperones 1:23-28)。hsp70
需要被称为辅伴侣蛋白的辅助蛋白，诸如j结构域蛋白和核苷酸交换因子
(nef)(hartl
等人
,(2009)nat struct mol biol 16:574-581)
以发挥作用
。
在折叠蛋白的
hsp70
伴侣蛋白机制的当前模型中，
hsp70
在
atp-和
adp-结合状态之间循环，并且j结构域蛋白结合到需要折叠或再折叠的另一蛋白
(
称为“客户蛋白”)
上，与
hsp70
的
atp
结合形式
(hsp70-atp)
相互作用
(young(2010)biochem cell biol 88:291-300
；
mayer,(2010)mol cell 39:321-331)。j
结构域蛋白-客户复合物与
hsp70-atp
的结合刺激
atp
水解，这导致了
hsp70
蛋白的构象变化，闭合螺
旋盖，并由此稳定客户蛋白与
hsp70-adp
之间的相互作用，以及引起j结构域蛋白的释放，其随后自由结合至另一客户蛋白
。
15.因此，根据该模型，j结构域蛋白通过充当桥，并促进多种客户蛋白的捕获和递送至
hsp70
机制中以促进正确折叠或再折叠而在
hsp70
机制中起到关键作用
(kampinga&craig(2010)nat rev mol cell biol 11:579-592)。j
结构域家族在原核生物
(dnaj
蛋白
)
至真核生物
(hsp40
蛋白家族
)
的物种范围中广泛保守
。j
结构域
(
大约
60-80aa)
由四个螺旋构成：
i、ii、iii
和
iv。
螺旋
ii
和
iii
经由含有“hpd
基序”的柔性环连接，该基序在j结构域中高度保守，并被认为对活性是至关重要的，因为
hpd
序列内的突变消除了j结构域功能
(tsai&douglas,(1996)j biol chem 271:9347-9354)。
16.鉴于以上提供的关于蛋白构象病
(
诸如
ad)
的背景，似乎清楚的是，降低错误折叠的蛋白的水平可以用作治疗
、
预防或以其它方式改善这些破坏性障碍的症状的手段，并且招募细胞的修复蛋白错误折叠的固有能力将是合乎逻辑的选择
。
17.发明概述本发明人已经开发了一类新的融合蛋白以招募细胞的固有
hsp70
介导的伴侣机制，从而特异性地减少
tau
介导的蛋白聚集
。
与本发明人使用包含
hsp40
蛋白
(
也称为j蛋白
)(
一种与
hsp70
相互作用以增强蛋白分泌与表达的辅伴侣蛋白
)
片段的融合蛋白的在先研究不同，本研究使用含有j结构域的融合蛋白用于减少突变
tau
蛋白聚集引起的蛋白聚集和细胞毒性的目的
。
在这种背景下，本发明人已做出了引人关注的发现，即j结构域功能所需的元件与j结构域在增强蛋白表达和分泌中的用途完全不同，这证明了本融合蛋白的作用模式的独特机制
。
本文中描述的融合蛋白包含j结构域和对
tau
具有亲和力的结构域
。
融合蛋白中
tau
结合结构域的存在导致突变
tau
蛋白的聚集的特异性降低
。
18.e1.
因此，在第一方面，本文中公开了一种分离的融合蛋白，其包含j蛋白的j结构域和
tau
结合结构域
。
19.e2.e1
的融合蛋白，其中j蛋白的j结构域是真核来源的
。
20.e3.e1-e2
任一项的融合蛋白，其中j蛋白的j结构域是人源的
。
21.e4.e1-e3
任一项的融合蛋白，其中j蛋白的j结构域是胞质定位的
。
22.e5.e1-e4
任一项的融合蛋白，其中j蛋白的j结构域选自
seq id no:1-48。
23.e6.e1-e5
任一项的融合蛋白，其中j结构域包含选自
seq id no:5、6、10、24
和
31
的序列
。
24.e7.e1-e6
任一项的融合蛋白，其中j结构域包含
seq id no:5
的序列
。
25.e8.e1-e6
任一项的融合蛋白，其中j结构域包含
seq id no:6
的序列
。
26.e9.e1-e6
任一项的融合蛋白，其中j结构域包含
seq id no:10
的序列
。
27.e10.e1-e6
任一项的融合蛋白，其中j结构域包含
seq id no:24
的序列
。
28.e11.e1-e6
任一项的融合蛋白，其中j结构域包含
seq id no:31
的序列
。
29.e12.e1-e11
任一项的融合蛋白，其中当使用
elisa
测定测量时，
tau
结合结构域具有1μm以下，例如
300nm
以下
、100nm
以下
、30nm
以下
、10nm
以下的对
tau
的
kd。
30.e13.e1-e12
任一项的融合蛋白，其中
tau
结合结构域包含选自
seq id no:49-54
的序列
。
31.e14.e1-e13
任一项的融合蛋白，其中
tau
结合结构域包含
seq id no:49
的序列
。
32.e15.e1-e13
任一项的融合蛋白，其中
tau
结合结构域包含
seq id no:50
的序列
。
33.e16.e1-e13
任一项的融合蛋白，其中
tau
结合结构域包含
seq id no:51
的序列
。
34.e17.e1-e13
任一项的融合蛋白，其中
tau
结合结构域包含
seq id no:52
的序列
。
35.e18.e1-e13
任一项的融合蛋白，其中
tau
结合结构域包含
seq id no:53
的序列
。
36.e19.e1-e13
任一项的融合蛋白，其中
tau
结合结构域包含
seq id no:54
的序列
。
37.e20.e1-e19
任一项的融合蛋白，其包含多个
tau
结合结构域
。
38.e21.e1-e20
任一项的融合蛋白，其由两个
tau
结合结构域组成
。
39.e22.e1-e21
任一项的融合蛋白，其由三个
tau
结合结构域组成
。
40.e23.e1-e22
任一项的融合蛋白，其包含以下构建体之一：
a.dnaj-x-t
，
b.dnaj-x-t-x-t
，
c.dnaj-x-t-x-t-x-t
，
d.t-x-dnaj
，
e.t-x-t-x-dnaj
，
f.t-x-t-x-t-x-dnaj
，
g.t-x-dnaj-x-t
，
h.t-x-dnaj-x-t-x-t
，
i.t-x-dnaj-x-t-x-t-x-t
，
j.t-x-t-x-dnaj-x-t
，
k.t-x-t-x-dnaj-x-t-x-t
，
l.t-x-t-x-dnaj-x-t-x-t-x-t
，
m.t-x-t-x-t-x-dnaj-x-t
，
n.t-x-t-x-t-x-dnaj-x-t-x-t
，和
o.t-x-t-x-t-x-dnaj-x-t-x-t-x-t
，其中，
t
是
tau
结合结构域，
dnaj
是j蛋白的j结构域，且
x
是任选的接头
。
41.e24.e1-e23
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域序列和
seq id no:49
的
tau
结合结构域序列
。
42.e25.e1-e23
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域序列和
seq id no:50
的
tau
结合结构域序列
。
43.e26.e1-e23
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域序列和
seq id no:51
的
tau
结合结构域序列
。
44.e27.e1-e23
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域序列和
seq id no:52
的
tau
结合结构域序列
。
45.e28.e1-e23
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域序列和
seq id no:53
的
tau
结合结构域序列
。
46.e29.e1-e23
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域序列和
seq id no:54
的
tau
结合结构域序列
。
47.e30.e1-e29
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含选自
seq id no:83-88
和
95-101
的序列
。
48.e31.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:83
的序列
。
49.e32.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:84
的序列
。
50.e33.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:85
的序列
。
51.e34.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:86
的序列
。
52.e35.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:87
的序列
。
53.e36.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:88
的序列
。
54.e37.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:95
的序列
。
55.e38.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:96
的序列
。
56.e39.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:97
的序列
。
57.e40.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:98
的序列
。
58.e41.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:99
的序列
。
59.e42.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:100
的序列
。
60.e43.e1-e30
任一项的融合蛋白，其中融合蛋白包含
seq id no:101
的序列
。
61.e44.e1-e43
任一项的融合蛋白，其进一步包含靶向试剂
。
62.e45.e1-e44
任一项的融合蛋白，其进一步包含表位
。
63.e46.e45
的融合蛋白，其中表位是选自
seq id no:66-72
的多肽
。
64.e47.e1-e46
任一项的融合蛋白，其进一步包含细胞穿透剂
。
65.e48.e47
的融合蛋白，其中细胞穿透剂包含选自
seq id no:73-76
的肽序列
。
66.e49.e1-e48
任一项的融合蛋白，其进一步包含信号序列
。
67.e50.e49
的融合蛋白，其中信号序列包含选自
seq id no:77-79
的肽序列
。
68.e51.e1-e50
任一项的融合蛋白，其能够减少
tau
蛋白在细胞中的聚集
。
69.e52.e1-e51
任一项的融合蛋白，其能够减少
tau
介导的细胞毒性
。
70.e53.
编码
e1-e52
任一项的融合蛋白的核酸序列
。
71.e54.e53
的核酸序列，其中所述核酸是
dna。
72.e55.e54
任一项的核酸序列，其中所述核酸是
rna。
73.e56.e53-e55
任一项的核酸序列，其中所述核酸包含至少一种修饰的核酸
。
74.e57.
包含
e53-e56
任一项的核酸序列的载体
。
75.e58.e57
的载体，其中载体选自腺相关病毒
(aav)、
腺病毒
、
慢病毒
、
逆转录病毒
、
疱疹病毒
、
痘病毒
(
牛痘或粘液瘤
)、
副粘病毒
(
麻疹
、rsv
或新城疫病毒
)、
杆状病毒
、
呼肠孤病毒
、
甲病毒和黄病毒
。
76.e59.
包含衣壳和
e57
或
e58
的载体的病毒颗粒
。
77.e60.e59
的病毒颗粒，其中衣壳选自
aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav rh10、aav11、aav12、
假型
aav、
恒河猴来源的
aav、aavrh8、aavrh10
和
aav-djan aav
衣壳突变体
、aav
杂合血清型
、
亲器官
aav、
亲心脏
aav
和亲心脏
aavm41
突变体
。
78.e61.
药物组合物，其包含选自
e1-e52
任一项的融合蛋白
、
表达
e1-e52
的融合蛋白的细胞
、e53-e56
任一项的核酸
、e57-e58
任一项的载体
、e59-e60
任一项的病毒颗粒的药剂，
以及药学上可接受的载体或赋形剂
。
79.e62.
降低
tau
蛋白在细胞中的毒性的方法，其包括使所述细胞与
e1-e52
任一项的融合蛋白
、
表达
e1-e52
的融合蛋白的细胞
、e53-e56
任一项的核酸
、e57-e58
任一项的载体
、e59-e60
任一项的病毒颗粒和
e61
的药物组合物接触
。
80.e63.e62
的方法，其中细胞在受试者中
。
81.e64.e62-e63
任一项的方法，其中受试者是人
。
82.e65.e62-e64
任一项的方法，其中细胞是中枢神经系统的细胞
。
83.e66.e62-e65
任一项的方法，其中受试者鉴定为患有
tau
蛋白病
。
84.e67.e66
的方法，其中
tau
疾病选自阿尔茨海默病
(ad)、
帕金森病
(pd)、
原发性年龄相关性
tau
蛋白病
(part)、
慢性创伤性脑病
(cte)、
进行性核上性麻痹
(psp)、
皮质基底节变性
(cbd)、
与染色体
17
相关的额颞痴呆与帕金森综合征
(ftdp-17)、lytico-bodig
病
、
神经节神经胶质瘤和神经节细胞瘤
、
脑膜血管瘤病
、
脑炎后帕金森综合征
、
亚急性硬化性全脑炎
(sspe)、
铅毒性脑病
、
结节性硬化症
、
泛酸激酶相关神经退行性变和脂褐质沉积症
。
85.e68.e66
或
e67
的方法，其中
tau
蛋白病是阿尔茨海默病
(ad)。
86.e69.e62-e68
任一项的方法，其中与对照细胞相比，细胞中聚集的
tau
蛋白的量减少
。
87.e70.
在有需要的受试者中治疗
、
预防
tau
疾病或延缓
tau
疾病进展的方法，该方法包括施用有效量的一种或多种药剂，所述药剂选自
e1-e52
任一项的融合蛋白
、
表达
e1-e52
的融合蛋白的细胞
、e53-e56
任一项的核酸
、e57-e58
任一项的载体
、e59-e60
任一项的病毒颗粒和
e61
的药物组合物
。
88.e71.e70
的方法，其中
tau
疾病选自阿尔茨海默病
(ad)、
帕金森病
(pd)、
原发性年龄相关性
tau
蛋白病
(part)、
慢性创伤性脑病
(cte)、
进行性核上性麻痹
(psp)、
皮质基底节变性
(cbd)、
与染色体
17
相关的额颞痴呆与帕金森综合征
(ftdp-17)、lytico-bodig
病
、
神经节神经胶质瘤和神经节细胞瘤
、
脑膜血管瘤病
、
脑炎后帕金森综合征
、
亚急性硬化性全脑炎
(sspe)、
铅毒性脑病
、
结节性硬化症
、
泛酸激酶相关神经退行性变和脂褐质沉积症
。
89.e72.e70
或
e71
的方法，其中
tau
蛋白病是阿尔茨海默病
(ad)。
90.e73.e1-e52
任一项的融合蛋白
、
表达
e1-e52
的融合蛋白的细胞
、e53-e56
任一项的核酸
、e57-e58
任一项的载体
、e59-e60
任一项的病毒颗粒和
e61
的药物组合物中的一种或多种在受试者中预防
tau
疾病或延缓
tau
疾病进展的用途
。
91.e74.e1-e52
任一项的融合蛋白
、
表达
e1-e52
的融合蛋白的细胞
、e53-e56
任一项的核酸
、e57-e58
任一项的载体
、e59-e60
任一项的病毒颗粒和
e61
的药物组合物中的一种或多种在可用于在受试者中治疗
、
预防
tau
蛋白病或延缓
tau
蛋白病进展的药物的制备中的用途
。
附图描述
92.图
1a
显示了代表性人j结构域序列的
clustal omega
序列比对
。
高度保守的
hpd
结构域显示在突出显示的框中
。
93.图
1b
显示了代表性人j结构域序列的
clustal omega
序列比对
。
94.图2显示了一些说明性融合蛋白构建体，其包含j结构域和
tau
结合结构域
。
95.图3显示了细胞提取物的蛋白印迹分析，其展现了野生型
tau 0n4r(
泳道
2-6)
或突
变体
(p243s)tau(
泳道
7-11)
的表达，其各自包含
v5
表位，并还共表达各种融合蛋白构建体
jb1-tbp
构建体
1(
泳道3和
8)
；
jb1-scfv(tau)
构建体
4(
泳道4和
9)
；
jb1-scfv(mw7)
构建体
5(
泳道5和
10)
；和
jb1-happ1
构建体
6(
泳道6和
11)。
上图显示了用抗
v5
抗体探测的
tau
蛋白水平，而下图显示了用抗
ptau(ser396)
抗体探测的磷酸化
tau
水平
。
96.图4显示了细胞提取物的免疫印迹分析，其展现了野生型
tau 0n4r(
泳道2，3，7和
8)
或突变体
(p243s)tau(
泳道4，5，9，
10)
的单独表达或共表达含有
flag
表位的
jb1-scfv(tau)(
泳道3，5，8和
10)。
上图用识别
tau 2n4r
中
thr231
处的磷酸化
tau(
泳道
1-5)
或
ser396
处的磷酸化
tau(
泳道
6-10)
的抗体探测
。
下图用抗
flag
抗体探测以检测j结构域融合蛋白
(
在这种情况下，
jb1-scfv(tau)
构建体，或构建体
4)。
97.图5显示了细胞提取物的免疫印迹分析，其展现了野生型
tau 0n4r(
泳道
2-5)
或突变体
(p243s)tau(
泳道
6-9)
的单独表达
(
泳道1和
6)
或共表达构建体
4[jb1-scfv(tau)(
泳道4和
8)]
，构建体
8[
与
jb1-scfv(tau)
相同的对照构建体，不同之处在于在j结构域的保守
hpd
基序内的
p33q
突变
(
泳道5和
9)]
以及仅
scfv(tau)[
不含j结构域的构建体
4(
泳道3和
7)]。
[0098]
图6显示了细胞提取物的免疫印迹，其展现了野生型
(
泳道
2-6)
或突变体
(p243s)tau(
泳道
7-11)
的单独表达
(
泳道2和
7)、
共表达构建体
6(jb1-happ1
，泳道3和
8)、
构建体
1(jb1-tbp1
，泳道4和
9)、
构建体
14(jb1-tbp2
，泳道5和
10)
或构建体
11(jb1-qbp1
，泳道6和
11)。
[0099]
图7显示了细胞提取物的免疫印迹，其展现了野生型
(
泳道
1-3)
或截短的
tau3r(
泳道
4-6)
和共表达构建体
1(jb1-tbp1
，泳道2和
5)
或构建体
7(
在保守j结构域
hpd
基序内含有
p33q
突变的
jb1-tbp1
，泳道3和
6)
的野生型
tau
或截短的
tau3r
的表达
。
[0100]
图8显示了如使用
ldh
测定所测得的，表达构建体
1(jb1-tbp1)
对
tau
介导的细胞毒性的影响
。
[0101]
定义如在说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个
/
种
(a)”、“一个
/
种
(an)”和“该
/
所述”包括复数指代物，除非上下文另行清楚地指明
。
例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物
。
[0102]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指的是任何长度的氨基酸的聚合物
。
聚合物可以是直链或支链的，其可包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断
。
该术语还涵盖已经通过例如二硫键形成
、
糖基化
、
脂化
、
乙酰化
、
磷酸化或任何其它修饰
(
诸如与标记组件缀合
)
来修饰的氨基酸聚合物
。
[0103]
如本文中使用的术语“氨基酸”是指天然和
/
或非天然或合成的氨基酸，包括但不限于d或
l
光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物
。
标准的单字母或三字母代码用于指示氨基酸
。
[0104]“宿主细胞”包括可以是或已经是本发明的载体的接受者的单个细胞或细胞培养物
。
宿主细胞包括单个宿主细胞的子代
。
由于天然
、
偶然或故意的突变，子代不一定与原始亲本细胞完全相同
(
在形态学或总
dna
互补序列
(complement)
的基因组学方面
)。
宿主细胞包括用本发明的载体体内转染的细胞
。
[0105]“分离的”当用于描述本文中公开的各种多肽时是指已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和
/
或回收的多肽
。
其天然环境的污染组分是通常会干扰多肽的诊断或治疗用
途的材料，并可包括酶
、
激素和其它蛋白或非蛋白溶质
。
如对本领域技术人员显而易见的那样，非天然存在的多核苷酸
、
肽
、
多肽
、
蛋白
、
抗体或其片段不需要“分离”以将其与其天然存在的对应物区分
。
此外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸
、
肽
、
多肽
、
蛋白
、
抗体或其片段与其天然存在的对应物的区别在于，每体积的浓度或分子数量通常大于其天然存在的对应物
。
通常，通过重组手段制得并在宿主细胞中表达的多肽被认为是“分离的”。
[0106]“分离的”多核苷酸或编码多肽的核酸或编码其它多肽的核酸是经鉴定并与至少一种污染物核酸分子分离的核酸分子，所述污染物核酸分子通常在编码多肽的核酸的天然来源中与所述核酸分子相关联
。
分离的编码多肽的核酸分子不同于其在自然界中发现的形式或环境
。
因此，分离的编码多肽的核酸分子区别于存在于天然细胞中的特定的编码多肽的核酸分子
。
但是，分离的编码多肽的核酸分子包括通常表达该多肽的细胞中所含有的编码多肽的核酸分子，其中例如核酸分子在不同于天然细胞的染色体或染色体外位置
。
[0107]
术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用
。
它们是指任何长度的核苷酸
(
脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸
)
的聚合形式，或其类似物
。
多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能
。
以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区
、
由连锁分析限定的基因座
(loci)(
基因座
(locus))、
外显子
、
内含子
、
信使
rna(mrna)、
转运
rna、
核糖体
rna、
核酶
、cdna、
重组多核苷酸
、
支链多核苷酸
、
质粒
、
载体
、
任何序列的分离
dna、
任何序列的分离
rna、
核酸探针和引物
。
多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物
。
如果存在的话，可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰
。
核苷酸的序列可以被非核苷酸组件中断
。
多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组件缀合
。
[0108]
如本文中定义的术语“tau
障碍”、“tau
疾病”、“tau
蛋白病”或“tau
介导的疾病”是指与细胞内
tau
聚集体，特别是
tau
突变蛋白的聚集体的形成相关的障碍
。tau
障碍的实例包括但不限于阿尔茨海默病
(ad)、
帕金森病
(pd)、
原发性年龄相关性
tau
蛋白病
(part)、
慢性创伤性脑病
(cte)、
进行性核上性麻痹
(psp)、
皮质基底节变性
(cbd)、
与染色体
17
相关的额颞痴呆与帕金森综合征
(ftdp-17)、lytico-bodig
病
、
神经节神经胶质瘤和神经节细胞瘤
、
脑膜血管瘤病
、
脑炎后帕金森综合征
、
亚急性硬化性全脑炎
(sspe)、
铅毒性脑病
、
结节性硬化症
、
泛酸激酶相关神经退行性变和脂褐质沉积症
。
[0109]“载体”是核酸分子，优选在合适的宿主中自我复制，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和
/
或在宿主细胞之间转移
。
该术语包括主要用于将
dna
或
rna
插入细胞的载体
、
主要用于复制
dna
或
rna
的载体的复制物
、
以及用于转录和
/
或翻译
dna
或
rna
的表达载体
。
还包括提供超过一种上述功能的载体
。“表达载体”是多核苷酸，当引入合适的宿主细胞时其可以被转录和翻译成多肽
。“表达系统”通常是指包含表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可用于产生所需表达产物
。
[0110]
术语“可操作地连接”是指所述组分的并置，其中组分处于允许其以它们预期的方式发挥作用的关系下
。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式连接
。“可操作地连接的”序列可包括与目标基因邻接的表达控制序列和以反式作用或在一定距离处作用以控制目标基因的表达控制序列二者
。
术语“表达控制序列”是指影响与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列
。
表达控制序列包括适当的转录起始
、
终止
、
启动子和增强子序列；有效的
rna
加工信号，诸如剪
接和多聚腺苷酸化信号；稳定细胞质
mrna
的序列；增强翻译效率的序列
(
诸如
kozak
共有序列
)
；增强蛋白稳定性的序列；以及当需要时增强蛋白分泌的序列
。
此类控制序列的性质取决于宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子
、
核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，通常，此类控制序列包括启动子和转录终止序列
。
术语“控制序列”意在包括其存在对于表达和加工必不可少的组件，并且还可包括其存在是有利的另外的组件，例如前导序列和融合配偶体序列
。
除非另行说明，本文中将编码本发明的融合蛋白的核酸分子插入表达载体的描述或陈述是指在将含有插入的核酸分子的表达载体引入相容宿主细胞或生物体的相容细胞时，插入的核酸也已在载体内可操作地连接至表达编码的融合蛋白所需的功能性启动子和其它转录和翻译控制元件
。
[0111]“重组的”当应用于多核苷酸时是指多核苷酸是体外克隆
、
限制和
/
或连接步骤和其它程序的各种组合的产物，所述组合产生可以潜在地在宿主细胞中表达的构建体
。
[0112]
术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换使用
。
它们是指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，所述开放阅读框能够在转录和翻译后编码特定的蛋白
。
基因或基因片段可以是基因组或
cdna
，只要多核苷酸含有至少一个开放阅读框，其可以覆盖整个编码区或其区段
。“融合基因”是由至少两个连接在一起的异源多核苷酸构成的基因
。
[0113]
术语“疾病”和“障碍”可互换使用以指示根据本领域可接受的医学标准和实践鉴定的病理状态
。
[0114]
本文中使用的术语“有效量”是指治疗的量，其足以减轻或改善疾病或其一种或多种症状的严重程度和
/
或持续时间；阻止有害或病理状态的发展；引起病理状态的消退；预防与病理状态相关的一种或多种症状的复发
、
发展
、
发作或进展；检测障碍；或增强或改善治疗
(
例如施用另一种预防或治疗剂
)
的预防或治疗效果
。
[0115]
本文中使用的术语“j
结构域”是指保留促进
hsp70
及其同源物的固有
atp
酶催化活性的能力的片段
。
已经确定了多种j蛋白的j结构域
(
参见例如
kampinga
等人
,(2010)nat.rev.,11:579-592
；
hennessy
等人
,(2005)protein science,14:1697-1709
，其各自通过引用全文并入本文
)
并且其通过许多标志来表征：其特征在于四个
α-螺旋
(i、ii、iii、iv)
，并且通常在螺旋
ii
和
iii
之间具有组氨酸
、
脯氨酸和天冬氨酸的高度保守的三肽序列基序
(
称为“hpd
基序”)。
通常，j蛋白的j结构域的长度为五十至七十个氨基酸，并且j结构域与
hsp70-atp
伴侣蛋白的相互作用
(
结合
)
位点据信是从螺旋
ii
内延伸的区域，并且
hpd
基序对于刺激
hsp70 atp
酶活性是必需的
。
本文中使用的术语“j
结构域”是指包括天然j结构域序列及其功能性变体，所述功能性变体保留了促进
hsp70
固有
atp
酶活性的能力，这可以采用本领域中公知的方法来量度
(
参见例如
horne
等人
,(2010)j.biol.chem.,285,21679-21688
，其通过引用全文并入本文
)。
在表1中提供了人j结构域的非限制性列表
。
[0116]
发明详述本发明人发现，将某些细胞与含有j蛋白的j结构域和
tau
结合结构域的融合蛋白构建体接触具有预料不到的减少过度磷酸化
tau
蛋白的效果
。
过度磷酸化的
tau
蛋白据信引起多种毁灭性疾病，包括但不限于阿尔茨海默病
(ad)、
帕金森病
(pd)、
原发性年龄相关性
tau
蛋白病
(part)、
慢性创伤性脑病
(cte)、
进行性核上性麻痹
(psp)、
皮质基底节变性
(cbd)、
与染色体
17
相关的额颞痴呆与帕金森综合征
(ftdp-17)、lytico-bodig
病
、
神经节神经胶质瘤和神经节细胞瘤
、
脑膜血管瘤病
、
脑炎后帕金森综合征
、
亚急性硬化性全脑炎
(sspe)、
铅毒性脑病
、
结节性硬化症
、
泛酸激酶相关神经退行性变和脂褐质沉积症
。
因此，在本文中提供了例如在有需要的受试者中治疗
tau
相关障碍的有用组合物和方法
。
[0117]
为了克服与基于伴侣蛋白的疗法相关联的问题，我们研究了是否能设计具有高特异性的人工伴侣蛋白
。
我们设计了一系列融合蛋白构建体，其包含
hsp70
结合
/
激活的效应结构域
(j
结构域序列
)
和赋予对
tau
蛋白的特异性的结构域
。
所得到的融合蛋白用于促进
hsp70
及其同源物的固有
atp
酶催化活性，导致增加的蛋白折叠
、
减少的聚集和
/
或促进的清除
。
[0118]
i.
融合蛋白构建体
a.
可用于本发明的j结构域已经确定了多种j蛋白的j结构域
。
参见例如
kampinga
等人
,nat.rev.,11:579-592(2010)
；
hennessy
等人
,protein science,14:1697-1709(2005)。
可用于制备本发明的融合蛋白的j结构域具有主要促进
hsp70 atp
酶活性的j结构域的关键限定特征
。
因此，可用于本发明的分离的j结构域包含多肽结构域，其特征在于四个
α-螺旋
(i、ii、iii、iv)
，并且通常在螺旋
ii
和
iii
之间具有组氨酸
、
脯氨酸和天冬氨酸的高度保守的三肽序列
(
称为“hpd
基序”)。
通常，j蛋白的j结构域的长度为五十至七十个氨基酸，并且j结构域与
hsp70-atp
伴侣蛋白的相互作用
(
结合
)
位点据信是从螺旋
ii
内延伸的区域，并且
hpd
基序对原始活性是必不可少的
。
代表性的j结构域包括但不限于
dnajb1、dnajb2、dnajb6、dnajc6
的j结构域
、sv40
的大
t
抗原的j结构域和哺乳动物半胱氨酸链蛋白
(csp-α
)
的j结构域
。
在表1中提供了这些和可用于本发明的融合蛋白的其它j结构域的氨基酸序列
。
保守的
hpd
基序以粗体突出显示
。
表
1.
代表性人j结构域序列
b.tau
结合结构域融合蛋白还包含至少一个
tau
结合结构域
。tau
结合结构域可以是单链多肽，或与j结构域连接以形成融合蛋白的多聚体多肽
。
[0120]
理想的是，
tau
结合结构域具有足够的亲和力以便能够在
tau
蛋白在细胞内以病理水平存在时结合
tau
蛋白
。
因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含
tau
结合结构域，当在
96
孔微量滴定板上通过
elisa
测试时所述
tau
结合结构域具有例如2μm以下
、1
μm以下
、500nm
以下
、300nm
以下
、100nm
以下
、30nm
以下的对
tau
的
kd。
在另一实施方案中，融合蛋白包含
tau
结合结构域，当在
96
孔微量滴定板上通过
elisa
测试时，所述
tau
结合结构域具有例如2μm以下
、1
μm以下
、500nm
以下
、300nm
以下
、100nm
以下
、30nm
以下的对
tau
的聚集形式的
kd。
在又一
实施方案中，
tau
结合结构域对
tau
的聚集形式具有选择性；例如，当与对
tau
的可溶性形式的亲和力相比时，
tau
结合结构域具有至少两倍以上
、
至少3倍以上
、
至少4倍以上
、
至少5倍以上
、
至少
10
倍以上
、
至少
30
倍以上
、
至少
100
倍以上的对
tau
的聚集形式的亲和力
。
[0121]
tau
结合结构域先前已被鉴定和表征
(
参见例如美国专利号
7,605,133
，
wo 2019/161386
，
abe
等人
,(2007)bmc bioinformatics,8:451
，其各自通过引用并入本文
)。
因此，在另一实施方案中，融合蛋白包含
tau
结合结构域，其选自
seq id no:49-52(
参见例如表
2)。
在一个特定实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:49
的
tau
结合结构域
。
[0122]
在另一实施方案中，融合蛋白还考虑使用与j结构域化学缀合的
tau
结合结构域
。tau
结合结构域可直接缀合到j结构域上
。
备选地，其可以通过接头缀合到j结构域上
。
例如，存在大量本领域技术人员已知并可用于将
tau
结合结构域交联到j结构域上，或将靶向结构域交联到包含
tau
结合结构域和j结构域的融合蛋白上的化学交联剂
。
例如，一些交联剂是异双功能交联剂，其可用于以逐步方式连接分子
。
异双功能交联剂提供了设计用于缀合蛋白的更特异性的偶联方法的能力，由此减少了不想要的副反应
(
诸如同蛋白聚合物
(homo-protein polymer))
的发生
。
多种异双功能交联剂在本领域中是已知的，包括
4-(n-马来酰亚胺甲基
)
环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯
(smcc)、
间马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯
(mbs)
；
(4-碘乙酰基
)
氨基苯甲酸
n-琥珀酰亚胺酯
(siab)、4-(
对马来酰亚胺基苯基
)
丁酸琥珀酰亚胺酯
(smpb)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基
)
碳二亚胺盐酸盐
(edc)
；
4-琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代
)
甲苯
(smpt)、3-(2-吡啶基二硫代
)
丙酸
n-琥珀酰亚胺酯
(spdp)、6-[3-(2-吡啶基二硫代
)
丙酸酯
]
己酸琥珀酰亚胺酯
(lc-spdp)。
具有
n-羟基琥珀酰亚胺部分的交联剂可以作为通常具有更大的水溶性的
n-羟基磺基琥珀酰亚胺类似物获得
。
此外，可以合成在连接链中具有二硫桥的交联剂代替烷基衍生物，以减少体内接头裂解的量
。
除了异双功能交联剂外，还存在许多其它交联剂，包括同双功能和光反应性交联剂
。
辛二酸二琥珀酰亚胺基酯
(dss)、
双马来酰亚胺基己烷
(bmh)
和庚二亚氨酸二甲酯
.2hcl
是可用的同双功能交联剂的实例，并且双-[b-(4-叠氮水杨酰胺基
)
乙基
]
二硫化物
(based)
和
6-(4
’‑
叠氮基-2
’‑
硝基苯基氨基
)
己酸
n-琥珀酰亚胺酯
(sanpah)
是用于本公开的有用光反应性交联剂的实例
。
关于蛋白偶联技术的最新综述，参见
means
等人
,(1990)bioconj.chem.1:2-12
，其通过引入并入本文
。
[0123]
表2：
tau
结合结构域的实例
c.
任选的接头本文中描述的融合蛋白可任选含有一个或多个接头
。
接头可以是肽的或非肽的
。
接头的目的尤其是在蛋白内提供功能结构域之间
(
例如j结构域与
tau
结合结构域之间，
tau
结合结构域的串联排列之间，j结构域和
tau
结合结构域以及任选的靶向试剂之间，或j结构域和
tau
结合结构域以及任选的检测结构域或表位之间
)
的适当距离，以使每个结构域发挥最佳功能
。
显然，接头优选不干扰根据本发明的融合蛋白的j结构域
、
靶蛋白结合结构域的相应功能
。
选择接头
(
如果存在于本发明的融合蛋白中
)
以减弱靶蛋白
(tau
蛋白
)
引起的细胞毒性，并且如果直接连接实现所需效果的话，则可以省略接头
。
本发明的融合蛋白中存在的接头可包含一个或多个由表达载体克隆位点中或其周围的核酸区段上存在的核苷酸序列编码的氨基酸，编码本文中描述的蛋白结构域或整个融合蛋白的核酸区段框内插入到所述表达载体克隆位点中
。
在一个实施方案中，肽接头的长度为1个氨基酸至
20
个氨基酸
。
在另一实施方案中，肽接头的长度为2个氨基酸至
15
个氨基酸
。
在另一实施方案中，肽接头的长度为2个氨基酸至
10
个氨基酸
。
[0124]
选择一个或多个多肽接头以产生根据本发明的融合蛋白在本领域技术人员的知识和技术范围内
。
参见例如
arai
等人
,protein eng.,14(8):529-532(2001)
；
crasto
等人
,protein eng.,13(5):309-314(2000)
；
george
等人
,protein eng.,15(11):871-879(2003)
；
robinson
等人
,proc.natl.acad.sci.usa,95:5929-5934(1998)
，其各自通过引用全文并入本文
。
可用于制备根据本发明的融合蛋白的两个或更多个氨基酸的接头的实例包括但不限于下表3中提供的那些
。
[0125]
表3：接头序列
seq id no:
长度序列
552sr564gtgs575glesr584ggsg594gggs
605diaaa619diaaalesr6215ggggsggggsggggs6311aeaaakeaaak6415sgggsggggsggggs6525diggggsggggsggggsggggsaaad.
靶向试剂本文中公开的融合蛋白可进一步包含靶向部分
。
本文中使用的术语“靶向部分”和“靶向试剂”可互换使用，并且是指与融合蛋白相关的物质，其增强融合蛋白在细胞中或在受试者的身体中的结合
、
转运
、
累积
、
停留时间
、
生物利用度或改变其生物活性或治疗效果
。
靶向部分可以在组织
、
细胞和
/
或亚细胞水平具有功能性
。
靶向部分可以引导融合蛋白定位至特定细胞
、
组织或器官，例如，在向受试者施用融合蛋白之后
。
在一个实施方案中，靶向部分位于融合蛋白的n端
。
在另一实施方案中，靶向部分位于融合蛋白的c端
。
在另一实施方案中，靶向部分位于融合蛋白的n端与c端之间
。
在另一实施方案中，靶向部分经由化学缀合连接到融合蛋白上
。
[0126]
靶向部分可以包括但不限于有机或无机分子
、
肽
、
肽模拟物
、
蛋白
、
抗体或其片段
、
生长因子
、
酶
、
凝集素
、
抗原或免疫原
、
病毒或其组件
、
病毒载体
、
受体
、
受体配体
、
毒素
、
多核苷酸
、
寡核苷酸或适体
、
核苷酸
、
碳水化合物
、
糖
、
脂质
、
糖脂
、
核蛋白
、
糖蛋白
、
脂蛋白
、
类固醇
、
激素
、
化学引诱物
、
细胞因子
、
趋化因子
、
药物或小分子等
。
[0127]
在本发明的一个示例性实施方案中，靶向部分增强平台或其相关配体和
/
或活性剂在靶细胞或组织
(
例如
cns
和
/
或
pns
的神经元细胞
)
中的结合
、
转运
、
累积
、
停留时间
、
生物利用度或改变其生物活性或治疗效果
。
由此，靶向部分可对与
cns
相关的细胞受体具有特异性，或以其它方式与增强的经由血脑屏障
(bbb)
向
cns
的递送相关
。
因此，如上所述的配体可以是配体和靶向部分二者
。
[0128]
在一些实施方案中，靶向部分可以是细胞穿透肽，例如如美国专利号
10,111,965
中所述，其通过引用全文并入本文
。
在另一实施方案中，靶向部分可以是抗体或其抗原结合片段或单链衍生物，例如如美国序列号
16/131,591
中所述，其通过引用全文并入本文
。
[0129]
靶向部分可通过直接或间接结合至核心来偶联到用于靶向细胞递送的平台上
。
例如，在其中核心包含纳米颗粒的实施方案中，靶向部分与纳米颗粒的缀合可以利用用于将
peg
栓系到纳米颗粒上的类似官能团
。
由此，靶向部分可以通过靶向部分的官能化直接结合到纳米颗粒上
。
备选地，如上所述，靶向部分可以通过靶向部分与官能化
peg
的缀合而间接结合到纳米颗粒上
。
靶向部分可以通过共价
、
非共价或静电相互作用的方式连接到核心上
。
在一个实施方案中，靶向部分是肽
。
在一个特定实施方案中，靶向部分是共价连接到融合蛋白的n端的肽
。e.
表位
[0130]
在某些实施方案中，本发明的融合蛋白含有任选的表位或标签，其可以赋予融合蛋白另外的性质
。
本文中使用的术语“表位”和“标签”可互换使用，指的是通常连接到融合蛋白的n端或c端末端的长度通常为
300
个氨基酸以下的氨基酸序列
。
在一个实施方案中，本发明的融合蛋白进一步包含用于促进纯化的表位
。
在下表4中提供的可用于纯化的此类表
位的实例包括人
igg1 fc
序列
(seq id no:66)、flag
表位
(dykddddk
，
seq id no:67)、his6
表位
(seq id no:68)、c-myc(seq id no:69)、ha(seq id no:70)、v5
表位
(seq id no:71)
或谷胱甘肽-s-转移酶
(seq id no:72)。
在另一实施方案中，本发明的融合蛋白进一步包含在施用于受试者
(
例如人
)
时用于提高融合蛋白的半衰期的表位
。
可用于提高半衰期的此类表位的实例包括人
fc
序列
。
因此，在一个特定实施方案中，除j结构域和
tau
结合结构域外，融合蛋白包含人
fc
表位
。
表位位于融合蛋白的c端末端处
。
[0131]
表4：表位的代表性实例：表位的代表性实例
f.
细胞穿透肽在另一些实施方案中，本文中描述的融合蛋白可进一步包含细胞穿透肽
。
已知细胞穿透肽携带缀合的运载物
(
无论是小分子
、
肽
、
蛋白还是核酸
)
进入细胞
。
本发明的融合蛋白中的细胞穿透肽的非限制性实例包括但不限于聚阳离子肽，例如
hiv tat
肽
49-57、
聚精氨酸和穿透素
(penetratin)pantan(43-58)、
两亲性肽，例如
pep-1、
疏水肽，例如
c405y
等
。
参见下表
5。
[0132]
表5：细胞穿透肽的实例
seq id no:
序列
73rkkrrqrrr74rqikwfqnrrmkwkk75ketwwetwwtewsqpkkkrkv76csippevkfnkpfvyli
因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含细胞穿透肽和融合蛋白，其中细胞穿透肽选自
seq id no:73-76
，并且融合蛋白选自
seq id no:83-88
和
95-101。
在另一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:73
的细胞穿透肽，并且融合蛋白选自
seq id no:83-88
和
95-101。
在另一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:74
的细胞穿透肽，并且融合蛋白选自
seq id no:83-88
和
95-101。
在又一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:75
的细胞穿透肽，并且融合蛋白选自
seq id no:83-88
和
95-101。
在再一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:76
的
细胞穿透肽，并且融合蛋白选自
seq id no:83-88
和
95-101。
表达具有细胞穿透肽的融合蛋白构建体的细胞可以施用于受试者，例如人受试者
(
例如患有
tau
障碍或处于患有
tau
障碍的风险的患者
)。
由细胞分泌融合蛋白，其有助于减少含有
tau
的蛋白聚集和
/
或相关的细胞毒性
。g.j
结构域和
tau
结合结构域的排列
[0133]
本文中描述的融合蛋白可以以多种方式排列
。
在一个实施方案中，
tau
结合结构域连接到j结构域的c端侧
。
在另一实施方案中，
tau
结合结构域连接到j结构域的n端侧
。
任一构型的
tau
结合结构域与j结构域可任选地经由上述接头分开
。
[0134]
在一些实施方案中，j结构域可以连接到多个
tau
结合结构域上，例如两个
tau
结合结构域
、
三个
tau
结合结构域
、
四个
tau
结合结构域或更多
。
多个
tau
结合结构域可以连接到j结构域的n端侧
。
在又一实施方案中，多个
tau
结合结构域可以连接在j结构域的n端侧和c端侧上
。
多个
tau
结合结构域的每一个可以是相同的
tau
结合结构域
。
在另一实施方案中，融合蛋白中的多个
tau
结合结构域的每一个可以是不同的
tau
结合结构域
(
即不同的序列
)。
[0135]
在一些实施方案中，融合蛋白可包含选自以下的结构：
a.dnaj-x-t
，
b.dnaj-x-t-x-t
，
c.dnaj-x-t-x-t-x-t
，
d.t-x-dnaj
，
e.t-x-t-x-dnaj
，
f.t-x-t-x-t-x-dnaj
，
g.t-x-dnaj-x-t
，
h.t-x-dnaj-x-t-x-t
，
i.t-x-dnaj-x-t-x-t-x-t
，
j.t-x-t-x-dnaj-x-t
，
k.t-x-t-x-dnaj-x-t-x-t
，
l.t-x-t-x-dnaj-x-t-x-t-x-t
，
m.t-x-t-x-t-x-dnaj-x-t
，
n.t-x-t-x-t-x-dnaj-x-t-x-t
，和
o.t-x-t-x-t-x-dnaj-x-t-x-t-x-t
，其中，
t
是
tau
结合结构域，
dnaj
是j蛋白的j结构域，且
x
是任选的接头
。
[0136]
在一个实施方案中，融合蛋白包含选自
seq id no:5、6、10、24
和
31
的j结构域
。
在一个特定实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域
。
[0137]
在另一实施方案中，
tau
结合结构域选自
seq id no:49-54。
在一个特定实施方案中，
tau
结合结构域是
seq id no:49。
[0138]
在又一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域，和
seq id no:49
的
tau
结合结构域
。
在另一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域，和
seq idno:49
的
tau
结合结构域的至少两个拷贝
。
在另一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域，和
seq id no:50
的
tau
结合结构域
。
在另一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域，和
seq id no:51
的
tau
结合结构域
。
在再一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域，和
seq id no:52
的
tau
结合结构域
。
在另一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域，和
seq id no:53
的
tau
结合结构域
。
在再一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:5
的j结构域，和
seq id no:54
的
tau
结合结构域
。
[0139]
包含j结构域和
tau
结合结构域的融合蛋白构建体的非限制性实例示意性描绘在图2中，并且也显示在下表6中
。
在另一实施方案中，特定的融合蛋白构建体选自
seq id no:83-88
和
95-101。
[0140]
表6：融合蛋白构建体和对照构建体
ii.
编码融合蛋白构建体的核酸本发明的另一方面提供了包含多核苷酸序列的分离的核酸，所述多核苷酸序列选自
(a)
编码前述实施方案任一项的融合蛋白的多核苷酸，或
(b)(a)
的多核苷酸的互补序列
。
本发明提供了编码包含j结构域和
tau
结合结构域的融合蛋白的分离的核酸，以及与编码融合蛋白的此类核酸分子互补的序列
(
包括其同源变体
)。
在另一方面，本发明包括产生编码本文中公开的融合蛋白的核酸和与编码融合蛋白的核酸分子互补的序列
(
包括其同源变体
)
的方法
。
根据本发明的这一方面的核酸可以是前信使
rna(
前
mrna)、
信使
rna(mrna)、rna、
基因组
dna (gdna)、pcr
扩增的
dna、
互补
dna(cdna)、
合成
dna
或重组
dna。
[0141]
在再一方面，公开了一种生产融合蛋白的方法，其包括
(a)
合成和
/
或组装编码融合蛋白的核苷酸，
(b)
将编码基因并入适于宿主细胞的表达载体中，
(c)
用表达载体转化合适的宿主细胞，和
(d)
在引起或允许融合蛋白在转化的宿主细胞中表达的条件下培养宿主细胞，由此生产生物活性融合蛋白，其通过本领域已知的标准蛋白纯化方法作为分离的融合蛋白回收
。
分子生物学中的标准重组技术用于制造本发明的多核苷酸和表达载体
。
[0142]
根据本发明，编码本文中公开的融合蛋白的核酸序列
(
或其互补序列
)
用于产生指导融合蛋白在合适的宿主细胞中表达的重组
dna
分子
。
几种克隆策略适于实施本发明，其中许多用于产生包含编码本发明的融合蛋白的基因或其互补序列的构建体
。
在一些实施方案中，克隆策略用于产生编码本发明的融合蛋白的基因或它们的互补序列
。
[0143]
在某些实施方案中，编码一种或多种融合蛋白的核酸是
rna
分子，并且可以是前信使
rna(
前
mrna)、
信使
rna(mrna)、rna、
基因组
dna(gdna)、pcr
扩增的
dna、
互补
dna(cdna)、
合成
dna
或重组
dna。
[0144]
在各种实施方案中，核酸是引入细胞以便瞬时表达所需多肽的
mrna。
本文中使用的“瞬时”是指非整合转基因表达数小时
、
数天或数周的时间，其中表达时间小于多核苷酸在细胞中整合到基因组中或包含在稳定质粒复制子中的情况下的表达时间
。
[0145]
在特定实施方案中，编码多肽的
mrna
是体外转录的
mrna。
本文中使用的“体外转录的
rna”是指已经在体外合成的
rna
，优选
mrna。
通常，体外转录的
rna
由体外转录载体产生
。
体外转录载体包含用于产生体外转录的
rna
的模板
。
[0146]
在特定实施方案中，
mrna
可进一步包含5’
帽或修饰的5’
帽和
/
或3’
多聚
(a)
序列
。
本文中使用的5’
帽
(
也称为
rna
帽
、rna 7-甲基鸟苷帽或
rna m7g
帽
)
是修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在转录开始后不久被添加到真核信使
rna
的“前端”或5’
末端
。5’帽包含连接至第一转
录核苷酸并被核糖体识别并保护免受
rna
酶影响的末端基团
。
可以修饰加帽部分以调节
mrna
的功能，诸如其稳定性或翻译效率
。
在一个特定实施方案中，
mrna
包含大约
50
至大约
5000
个腺嘌呤的多聚
(a)
尾序列
。
在一个实施方案中，
mrna
包含大约
100
至大约
1000
个碱基
、
大约
200
至大约
500
个碱基
、
或大约
300
至大约
400
个碱基的多聚
(a)
序列
。
在一个实施方案中，
mrna
包含大约
65
个碱基
、
大约
100
个碱基
、
大约
200
个碱基
、
大约
300
个碱基
、
大约
400
个碱基
、
大约
500
个碱基
、
大约
600
个碱基
、
大约
700
个碱基
、
大约
800
个碱基
、
大约
900
个碱基
、
或大约
1000
个以上的碱基的多聚
(a)
序列
。
多聚
(a)
序列可以化学或酶促修饰以调节
mrna
功能，诸如定位
、
稳定性或翻译效率
。
[0147]
本文中使用的术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指展现出与参考多核苷酸序列的实质序列相似性的多核苷酸，或在下文中定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸
。
这些术语包括其中与参考多核苷酸相比已经添加或缺失或用不同核苷酸置换一个或多个核苷酸的多核苷酸
。
在这方面，本领域中公知的是可对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变
、
添加
、
缺失和取代，由此改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活性
。
[0148]
iii.
包含编码融合蛋白的核酸的载体还提供了包含根据本发明的核酸的载体
。
此类载体优选包含另外的核酸序列，诸如编码磷酸酶的核酸序列的转录
/
翻译所必需的元件
(
例如启动子和
/
或终止子序列
)。
所述载体还可包含编码选择标记
(
例如抗生素
)
的核酸序列，以选择或维持用所述载体转化的宿主细胞
。
术语“载体”在本文中用于指能够转移或转运另一核酸分子的核酸分子
。
转移的核酸通常连接到载体核酸分子上，例如插入到载体核酸分子中
。
载体可以包括引导细胞中的自主复制的序列，或可包括足以允许整合到宿主细胞
dna
中的序列
。
在特定实施方案中，非病毒载体用于将一种或多种本文中设想的多核苷酸递送至受影响的细胞
(
例如神经元细胞
)。
在一个实施方案中，载体含有体外合成或合成制备的
mrna
，所述
mrna
编码包含j结构域和
tau
结合结构域的融合蛋白
。
非病毒载体的说明性实例包括但不限于
mrna、
质粒
(
例如
dna
质粒或
rna
质粒
)、
转座子
、
粘粒和细菌人工染色体
。
本文中使用的术语“核酸盒”或“表达盒”是指载体内的遗传序列，其可以表达
rna
，以及随后的多肽
。
在一个实施方案中，核酸盒含有目标基因，例如目标多核苷酸
。
在另一实施方案中，核酸盒含有一个或多个表达控制序列，例如启动子
、
增强子
、
多聚
(a)
序列和目标基因，例如目标多核苷酸
。
载体可包含
1、2、3、4、5、6、7、8、9
或
10
个以上的核酸盒
。
核酸盒在载体中在位置和顺序上取向，使得盒中的核酸可转录成
rna
，并在必要时翻译成蛋白或多肽，经历转化细胞中活性所需的适当的翻译后修饰，并通过靶向适当的细胞内区室或分泌到细胞外区室中而易位到适于生物活性的区室
。
优选地，盒具有适合于容易地插入载体中的3’
和5’
末端，例如，其在每个末端具有限制性内切核酸酶位点
。
可以将盒取出并作为单个单元插入质粒或病毒载体
。
[0149]
载体的说明性实例包括但不限于质粒
、
自主复制序列和可转座元件，例如
piggybac、sleeping beauty、mosl、tcl/mariner、tol2、mini-tol2、tc3、mua、himar i、frog prince
及其衍生物
。
载体的另外的说明性实例包括但不限于质粒
、
噬菌粒
、
粘粒
、
人工染色体诸如酵母人工染色体
(yac)、
细菌人工染色体
(bac)
或
pl
衍生的人工染色体
(pac)、
噬菌体诸如
λ
噬菌体或
m13
噬菌体
、
以及动物病毒
。
可用作载体的病毒的说明性实例包括但不限于逆转录病毒
(
包括慢病毒
)、
腺病毒
、
腺相关病毒
、
疱疹病毒
(
例如单纯疱疹病毒
)、
痘病毒
、
杆状病毒
、
乳头瘤病毒和乳多空病毒
(
例如
sv40)。
表达载体的说明性实例包括但不限于用于
在哺乳动物细胞中表达的
pclneo
载体
(promega)
；用于在哺乳动物细胞中进行慢病毒介导的基因转移和表达的
plenti4/v 5-dest
tm
、plenti6/v 5-dest
tm
和
plenti6.2/v 5-gw/lacz(invitrogen)。
在特定实施方案中，本文中公开的多肽的编码序列可以连接到此类表达载体中以便在哺乳动物细胞中表达多肽
。
[0150]
在特定实施方案中，载体是游离型载体或保持在染色体外的载体
。
本文中使用的术语“游离型”是指能够复制而不整合到宿主染色体
dna
中并且不从分裂的宿主细胞中逐渐丢失的载体，也意味着所述载体在染色体外或游离地复制
。
[0151]
适用于特定实施方案的示例性遍在表达控制序列包括基因启动子，但不限于巨细胞病毒
(cmv)
立即早期启动子
、
病毒猴病毒
40(sv40)
启动子
(
例如早期或晚期
)、
莫洛尼氏鼠白血病病毒
(momlv)ltr
启动子
、
劳斯肉瘤病毒
(rsv)ltr、
单纯疱疹病毒
(hsv)(
胸苷激酶
)
启动子
、
来自牛痘病毒的
h5、p7.5
和
pl l
启动子
、
延长因子
1-α
(efla)
启动子
、
早期生长反应因子
1(egr1)、
铁蛋白
h(ferh)、
铁蛋白
l(ferl)、
甘油醛
3-磷酸脱氢酶
(gapdh)、
真核生物翻译起始因子
4a1(eif4a1)、
热休克
70kda
蛋白
5(hspa5)、
热休克蛋白
90kda
β
,
成员
1(hsp90b1)、
热休克蛋白
70kda(hsp70)、b-驱动蛋白
(b-kin)、
人
rosa 26
基因座
(irions
等人
,nature biotechnology 25,1477
–
1482(2007))、
泛素c启动子
(ubc)、
磷酸甘油酸激酶-1(pgk)
启动子
、
巨细胞病毒增强子
/
鸡
b-肌动蛋白
(cag)
启动子
、b-肌动蛋白启动子和骨髓增殖性肉瘤病毒增强子
、
负控制区域的缺失
、dl587rev
引物结合位点取代的
(mnd)u3
启动子
(haas
等人
,journal of virology.2003
；
77(l7):9439-9450)。
[0152]
载体可包含用于多种位点特异性重组酶中任一种的一个或多个重组位点
。
应当理解的是，位点特异性重组酶的靶位点是除了载体
(
例如逆转录病毒载体或慢病毒载体
)
整合所需的任何位点之外的位点
。
本文中使用的术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”(ssr)
是指重组酶识别和结合的特定核酸序列
。
[0153]
例如，
cre
重组酶的一个重组位点是
loxp
，它是一个
34
个碱基对的序列，包含在8个碱基对的核心序列侧翼的两个
13
个碱基对的反向重复序列
(
充当重组酶结合位点
)(
参见
sauer,b.,current opinion in biotechnology 5:521-527(1994)
的图
1)。
适于
flp
重组酶的识别位点包括但不限于：
frt(mcleod
等人
,1996)、fi、f2、f3(schlake
和
bode,1994)、fyfs(schlake
和
bode,1994)、frt(le)(senecoff
等人
,1988)
和
frt(re)(senecoff
等人
,1988)。
[0154]
识别序列的其它实例是
attb、attp、attl
和
attr
序列，其被重组酶i整合酶
(
例如
phi-c3l)
识别
。pc3l ssr
仅介导异型位点
attb(
长度为
34bp)
与
attp(
长度为
39bp)
之间的重组
(groth
等人
,2000)。attb
和
attp(
分别对于细菌和噬菌体基因组上的噬菌体整合酶的附着位点而命名
)
均含有可能被
φ
031
同型二聚体结合的不完美反向重复序列
(groth
等人
,2000)。
产物位点
attl
和
attr
对进一步的
tpqa 1
介导的重组为有效惰性的
(belteki
等人
,2003)
，这使得反应不可逆
。
对于催化插入，已经发现携带
attb
的
dna
插入基因组
attp
位点比
attp
位点插入基因组
attb
位点更容易
(thyagarajan
等人
,2001
；
belteki
等人
,2003)。
由此，典型的策略通过同源重组将携带
attp
的“停泊位点”定位到确定的基因座中，随后使其与携带
attb
的输入序列配对以便插入
。
[0155]
本文中使用的“内部核糖体进入位点”或“ires”是指促进内部核糖体直接进入顺反子
(
蛋白编码区
)
的起始密码子
(
诸如
atg)
，由此导致基因的非帽依赖性翻译的元件
。
参见例如
jackson
等人
,1990.trends biochem sci 15(12):477-83)
以及
jackson
和
kaminski.1995.rna 1(10):985-1000。
在特定实施方案中，载体包括编码一种或多种多肽的一种或多种目标多核苷酸
。
在特定实施方案中，为了实现多种多肽中每一种的有效翻译，多核苷酸序列可被一个或多个
ires
序列或编码自切割多肽的多核苷酸序列分隔
。
在一个实施方案中，本文中设想的多核苷酸中使用的
ires
是
emcv ires。
[0156]
本文中使用的术语“kozak
序列”是指极大促进
mrna
与核糖体的小亚基的初始结合并提高翻译的短核苷酸序列
(kozak,1986.cell.44(2):283-92
，和
kozak,1987.nucleic acids res.15(20):8125-48)。
在特定实施方案中，载体包含具有共有
kozak
序列并编码包含j结构域和
tau
结合结构域的融合蛋白的多核苷酸
。
引导异源核酸转录物的有效终止和多聚腺苷酸化的元件提高异源基因表达
。
转录终止信号通常在多聚腺苷酸化信号的下游发现
。
在特定实施方案中，载体包含在编码要表达的多肽的多核苷酸的3’
的多聚腺苷酸化序列
。
[0157]
iv.
递送在特定实施方案中，通过非病毒或病毒载体将一种或多种编码包含j结构域和
tau
结合结构域的融合蛋白的多核苷酸引入细胞
。
在特定实施方案中设想的多核苷酸的非病毒递送的说明性方法包括但不限于：电穿孔
、
声穿孔
、
脂转染
、
显微注射
、
生物弹道技术
、
病毒体
、
脂质体
、
免疫脂质体
、
纳米颗粒
、
聚阳离子或脂质核酸缀合物
、
裸
dna、
人工病毒体
、deae-葡聚糖介导的转移
、
基因枪和热休克
。
[0158]
适用于设想的特定实施方案的多核苷酸递送系统的说明性实例包括但不限于由
amaxa biosystems、maxcyte,inc.、btx molecular delivery systems
和
copernicus therapeutics inc.
提供的那些
。
脂转染试剂是市售的
(
例如
transfectam
tm
和
lipofectin
tm
)。
适于多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质已经描述在文献中
。
参见例如
liu
等人
,(2003)gene therapy.10:180-187
；和
balazs
等人
,(20w)journal of drug delivery.2011:1-12。
在特定实施方案中还设想了基于抗体靶向的
、
细菌衍生的无生命纳米细胞的递送
。
[0159]
在特定实施方案中设想的包含多核苷酸的病毒载体可以通过施用于个体患者来体内递送，通常通过全身施用
(
例如静脉内
、
腹膜内
、
肌内
、
皮下或颅内输注
)、
通过鞘内注射
、
脑室内注射或局部施用，如下文所述
。
备选地，载体可以离体递送至细胞，诸如移植自个体患者的细胞
(
例如动员的外周血
、
淋巴细胞
、
骨髓穿刺液
、
组织活检等
)
或通用供体造血干细胞，随后将细胞再植入患者体内
。
[0160]
在一个实施方案中，将包含编码本文中公开的融合蛋白的多核苷酸的病毒载体直接施用于生物体以便进行体内细胞转导
。
[0161]
适当包装和配制的病毒载体可以经由鞘内递送递送到
cns
中
。
例如，腺相关病毒载体可以使用美国序列号
15/771,481
中描述的方法递送，其通过引用全文并入本文
。
[0162]
备选地，可以施用裸
dna。
施用通过通常用于将分子引入与血液或组织细胞的最终接触的任何途径，包括但不限于注射
、
输注
、
局部施用和电穿孔
。
施用此类核酸的合适方法是本领域技术人员可获得的和公知的，并且尽管可以使用超过一种途径来施用特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应
。
[0163]
适用于本文中设想的特定实施方案的病毒载体系统的说明性实例包括但不限于腺相关病毒
(aav)、
逆转录病毒
、
单纯疱疹病毒
、
腺病毒和牛痘病毒载体
。
[0164]
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的重组腺相关病毒
(raav)
转导细胞，将一种或多种编码包含j结构域和
tau
结合结构域的融合蛋白的多核苷酸引入细胞，例如神经元细胞
。aav
是一种小的
(
～
26nm)
复制缺陷的
、
主要为游离型的无包膜病毒
。aav
能感染分裂细胞和非分裂细胞二者，并可将其基因组并入到宿主细胞的基因组中
。
重组
aav(raav)
通常至少由转基因及其调节序列，以及5’
和3’
aav
反向末端重复序列
(itr)
构成
。itr
序列的长度为大约
145bp。
在特定实施方案中，
raav
包含从
aav 1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav rh10
或
aav10
中分离的
itr
和衣壳序列
。
[0165]
在一些实施方案中，使用嵌合
raav
；
itr
序列分离自一种
aav
血清型，而衣壳序列分离自不同的
aav
血清型
。
例如，具有来源于
aav2
的
itr
序列和来源于
aav6
的衣壳序列的
raav
被称为
aav2/aav6。
在特定实施方案中，
raav
载体可包含来自
aav2
的
itr
，和来自
aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav rh10
或
aav10
中任一种的衣壳蛋白
。
在一个优选实施方案中，
raav
包含来源于
aav2
的
itr
序列和来源于
aav6
的衣壳序列
。
在一个优选实施方案中，
raav
包含来源于
aav2
的
itr
序列和来源于
aav2
的衣壳序列
。
[0166]
在一些实施方案中，工程化和选择方法可应用于
aav
衣壳以使它们更可能转导目标细胞
。
[0167]
raav
载体的构建
、
其生产和纯化已公开在例如美国专利号
9,169,494
；
9,169,492
；
9,012,224
；
8,889,641
；
8,809,058
；和
8,784,799
中，其各自通过引用全文并入本文
。
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的逆转录病毒
(
例如慢病毒
)
转导细胞，将一种或多种编码本文中公开的融合蛋白的多核苷酸引入神经元细胞或神经元干细胞
。
本文中使用的术语“逆转录病毒”是指将其基因组
rna
逆转录为线性双链
dna
拷贝并随后将其基因组
dna
共价整合到宿主基因组中的
rna
病毒
。
适用于特定实施方案的说明性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼氏鼠白血病病毒
(m-mulv)、
莫洛尼氏鼠肉瘤病毒
(momsv)、
哈维鼠肉瘤病毒
(hamusv)、
鼠乳腺肿瘤病毒
(mumtv)、
长臂猿白血病病毒
(galv)、
猫白血病病毒
(flv)、
泡沫病毒
、
弗云德鼠白血病病毒
、
鼠干细胞病毒
(mscv)
和劳斯肉瘤病毒
(rsv)
以及慢病毒
。
本文中使用的术语“慢病毒”是指复杂逆转录病毒的群组
(
或属
)。
说明性的慢病毒包括但不限于：
hiv(
人免疫缺陷病毒；包括
hiv 1
型和
hiv 2
型
)
；维斯那-梅迪病毒
(vmv)
；山羊关节炎-脑炎病毒
(caev)
；马传染性贫血病毒
(eiav)
；猫免疫缺陷病毒
(fiv)
；牛免疫缺陷病毒
(biv)
；和猴免疫缺陷病毒
(siv)。
在一个实施方案中，基于
hiv
的载体主链
(
即
hiv
顺式作用序列元件
)
是优选的
。
[0168]
慢病毒载体优选含有因修饰
ltr
而产生的几种安全性增强
。“自失活”(sin)
载体是指复制缺陷型载体，例如其中右
(3’)ltr
增强子-启动子区
(
称为
u3
区
)
已被修饰
(
例如通过缺失或取代
)
以防止病毒转录超过病毒复制的第一轮
。
通过用异源启动子置换5’
ltr
的
u3
区以便在病毒颗粒生产期间驱动病毒基因组的转录，提供了另外的安全性增强
。
可以使用的异源启动子的实例包括例如病毒猴病毒
40(sv40)(
例如早期或晚期
)、
巨细胞病毒
(cmv)(
例如立即早期
)、
莫洛尼氏鼠白血病病毒
(momlv)、
劳斯肉瘤病毒
(rsv)
和单纯疱疹病毒
(hsv)(
胸苷激酶
)
启动子
。
在某些实施方案中，慢病毒载体根据已知方法产生
。
参见例如
kutner
等人
,bmc biotechnol.2009
；
9:10.doi:10.1186/1472-6750-9-10
；
kutner
等人
,nat.protoc.2009
；
4(4):495-505.doi:l0.l038/nprot.2009.22。
[0169]
根据本文中设想的某些特定实施方案，大多数或所有病毒载体主链序列来源于慢
病毒，例如
hiv-i。
但是，要理解的是，可以使用许多不同来源的逆转录病毒和
/
或慢病毒序列，或组合使用，并且可以在不损害转移载体执行本文中描述的功能的能力的情况下适应某些慢病毒序列中的许多取代和改变
。
此外，在本领域中多种慢病毒载体是已知的，参见
naldini
等人
(l996a、l996b
和
1998)
；
zufferey
等人
,(1997)
；
dull
等人
,1998,
美国专利号
6,013,516
和
5,994,136
，其中许多可以调整以适于产生本文中设想的病毒载体或转移质粒
。
[0170]
在各种实施方案中，通过用包含一种或多种多核苷酸的腺病毒转导细胞，将一种或多种编码本文中公开的融合蛋白的多核苷酸引入靶细胞
。
基于腺病毒
(ad)
的载体能够在许多细胞类型中具有非常高的转导效率，并且不需要细胞分裂
。
使用此类载体，已经获得了高滴度和高水平的表达
。
该载体可以在相对简单的系统中大量生产
。
大多数腺病毒载体被工程化，使得转基因置换
ad ela、elb
和
/
或
e3
基因；随后复制缺陷型载体在以反式提供缺失基因功能的人
293
细胞中增殖
。ad
载体可以在体内转导多种类型的组织，包括非分裂分化细胞，诸如在肝
、
肾和肌肉中发现的那些
。
常规
ad
载体具有大的承载能力
。
[0171]
当前腺病毒载体
(
其为复制缺陷型
)
的产生和增殖可以利用命名为
293
的独特辅助细胞系，其通过
ad5 dna
片段从人胚胎肾细胞转化并组成型表达
el
蛋白
(graham
等人
,1977)。
由于
e3
区不是腺病毒基因组所必需的
(jones&shenk,1978)
，因此当前腺病毒载体在
293
细胞的帮助下在
el
和
/
或
d3
区中携带外来
dna (graham&prevec,1991)。
腺病毒载体已经用于真核基因表达
(levrero
等人
,1991
；
gomez-foix
等人
,1992)
和疫苗开发
(grunhaus&horwitz,1992
；
graham&prevec,1992)。
将重组腺病毒施用于不同组织的研究包括气管滴注
(rosenfeld
等人
,1991
；
rosenfeld
等人
,1992)、
肌肉注射
(ragot
等人
,1993)、
外周静脉内注射
(herz&gerard,1993)
和立体定向接种到大脑中
(le gal la salle
等人
,1993)。
在临床试验中使用
ad
载体的一个实例涉及用肌内注射进行抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法
(sterman
等人
,hum.gene ther.7:1083-9(1998))。
[0172]
在各种实施方案中，通过用编码一种或多种多核苷酸的单纯疱疹病毒
(
例如
hsv-l、hsv-2)
转导细胞，将一种或多种编码本发明的融合蛋白的多核苷酸引入受试者的靶细胞
。
[0173]
成熟
hsv
病毒体由包膜的二十面体衣壳与由
152kb
的线性双链
dna
分子组成的病毒基因组组成
。
在一个实施方案中，基于
hsv
的病毒载体缺少一个或多个必需或非必需的
hsv
基因
。
在一个实施方案中，基于
hsv
的病毒载体是复制缺陷型的
。
大多数复制缺陷型
hsv
载体含有缺失以除去一个或多个立即早期
、
早期或晚期
hsv
基因以防止复制
。
例如，
hsv
载体可以缺少选自以下的立即早期基因：
icp4、icp22、icp27、icp47
或其组合
。hsv
载体的优点是其进入潜伏期的能力，这可以导致长期
dna
表达，以及其可以容纳高达
25kb
的外源
dna
插入序列的大病毒
dna
基因组
。
基于
hsv
的载体描述在例如美国专利号
5,837,532、5,846,782
和
5,804,413
，以及国际专利申请
wo 91/02788、wo 96/04394、wo 98/15637
和
wo 99/06583
中，其各自通过引用全文并入本文
。
[0174]
v.
表达融合蛋白的细胞在再一方面，本发明提供了表达本文中描述的融合蛋白的细胞
。
可以用编码如上文所述的融合蛋白的载体转染细胞
。
在一个实施方案中，细胞是原核细胞
。
在另一实施方案中，细胞是真核细胞
。
在又一实施方案中，细胞是哺乳动物细胞
。
在一个特定实施方案中，细胞是人细胞
。
在另一实施方案中，细胞是来源于患有
tau
介导的障碍或处于患有
tau
介导的
障碍的风险下的患者的人细胞，所述
tau
介导的障碍包括但不限于
als、ftd
和阿尔茨海默病
。
细胞可以是神经元细胞或肌肉细胞
。
[0175]
表达融合蛋白的细胞可用于生产融合蛋白
。
在该实施方案中，用过表达融合蛋白的载体转染细胞
。
融合蛋白可任选含有表位，例如如上文所述的人
fc
结构域或
flag
表位，其将促进纯化
(
分别使用蛋白a或抗
flag
抗体柱
)。
表位可以经由接头或蛋白酶底物序列与融合蛋白的其余部分连接，使得在纯化期间或之后，可以从融合蛋白中除去表位
。
[0176]
表达融合蛋白的细胞也可用于治疗方面
。
在一个实施方案中，从需要治疗的患者
(
例如患有
tau
介导的障碍或处于患有
tau
介导的障碍的风险下的患者
)
中收集细胞
。
在一个实施方案中，细胞是神经元细胞
。
随后用编码多核苷酸的载体转染收集的细胞以表达融合蛋白
。
随后可以处理转染的细胞以富集或选择转染的细胞
。
也可处理转染的细胞以分化成不同类型的细胞，例如神经元细胞
。
在处理后，可以将转染的细胞施用于患者
。
在一个实施方案中，通过鞘内注射
、
颅内注射或脑室内注射将细胞定向注射到
cns
中来施用细胞
。
[0177]
在一个备选实施方案中，可以使用表达融合蛋白的分泌形式的细胞
。
例如，融合蛋白构建体可以设计成在n端末端具有分泌信号序列
。
代表性的信号序列显示在下表7中
。
[0178]
表7：代表性信号序列
seq id no:
序列
77mgvkvlfaliciavaea78mapvqllgllvlflpamrc79mavlgllfclvtfpscvls
因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含信号序列和融合蛋白，其中信号序列选自
seq id no:77-79
，且融合蛋白选自
seq id no:83-88
和
95-101。
在另一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:77
的信号序列，和选自
seq id no:83-88
和
95-101
的融合蛋白
。
在另一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:78
的信号序列，和选自
seq id no:83-88
和
95-101
的融合蛋白
。
在另一实施方案中，融合蛋白包含
seq id no:79
的信号序列，和选自
seq id no:83-88
和
95-101
的融合蛋白
。
表达具有信号序列的融合蛋白构建体的细胞可以施用于受试者，例如人受试者
(
例如患有
tau
障碍或处于患有
tau
障碍的风险下的患者
)。
融合蛋白从细胞中分泌，这有助于减少
tau
蛋白聚集和
/
或相关的细胞毒性
。
[0179]
如上所述，在某些实施方案中，融合蛋白可进一步包含细胞穿透肽
。
表达包含信号序列和细胞穿透肽的融合蛋白的细胞将能够分泌没有信号序列的融合蛋白
。
还包含细胞穿透肽的分泌的融合蛋白随后将能够进入附近的细胞，并具有减少这些细胞中由
tau
蛋白介导的聚集和
/
或细胞毒性的潜力
。
含有信号序列和细胞穿透肽二者的融合蛋白将经由信号序列分泌并能够经由细胞穿透肽序列进入细胞
。
[0180]
vi.
使用方法在另一方面，本发明提供了在
tau
障碍中和
/
或在
tau
障碍或由
tau
聚集介导的状况中实现有益效果的方法
。tau
障碍选自肌萎缩性侧索硬化
(als)、
额颞痴呆
(ftd)、
帕金森病
、
亨廷顿病
、
阿尔茨海默病
、
海马硬化和路易体痴呆
。
[0181]
在一些实施方案中，本发明提供了治疗患有
tau
疾病
、
障碍或状况的受试者
(
诸如人
)
的方法，其包括向受试者施用治疗或预防有效量的本文中描述的融合蛋白
、
编码此类融合蛋白的核酸
、
或编码此类融合蛋白的病毒载体的步骤，其中所述施用导致与
tau
疾病
、
障
碍或状况相关的一种或多种生物化学或生理参数或临床终点的改善
。
[0182]
在另一些实施方案中，本发明提供了减少
tau
在细胞中的聚集的方法
。
细胞可以是培养的细胞或分离的细胞
。
细胞也可以来源于受试者，例如人受试者
。
在一个实施方案中，细胞在人受试者的
cns
中
。
在另一实施方案中，人受试者患有
tau
障碍疾病或处于患有
tau
障碍疾病的风险下，所述
tau
障碍疾病包括但不限于肌萎缩性侧索硬化
(als)、
额颞痴呆
(ftd)
和阿尔茨海默病
。
在一个特定实施方案中，
tau
障碍是阿尔茨海默病
。
[0183]
致病性
tau
蛋白可以以多种方式检测
。
在一个实例中，可以例如通过使用靶向磷酸化
tau
或构象特异性
tau
的抗体将过度磷酸化的
tau
蛋白与非致病性
(
即功能性
)tau
区分开
。
当与对照相比时，致病性
tau
蛋白的更大减少指示了更高的效力
。
致病性
tau
蛋白的减少也可以在细胞中直接检测，例如使用免疫荧光显微镜与检测
tau
蛋白的标记试剂
(
参见例如
ding
等人
,(2015)oncotarget,6:24178
–
24191
；
chou
等人
,(2015)hum.mol.genet.24:5154-5173
，和实施例
1)。
在某些实施方案中，当与对照物相比时，
tau
多肽水平的更大减少指示了更高的效力
。
[0184]
因此，在一个实施方案中，该方法包括使细胞与有效量的融合蛋白或编码融合蛋白的核酸
、
载体或病毒颗粒接触，以使致病性
tau
蛋白当与未处理的细胞或对照细胞相比时减少至少
10
％，例如至少
15
％
、
至少
20
％
、
至少
30
％
、
至少
40
％
、
至少
50
％
、
至少
60
％
、
至少
70
％
、
至少
75
％
、
至少
80
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
98
％
、
至少
99
％
。
[0185]
如下文在实施例1中显示的那样，发现包含j结构域和
tau
结合结构域的融合蛋白的表达降低了
tau
报告构建体的总体水平
。
因此，在另一实施方案中，该方法包括使细胞与一定量的融合蛋白
、
表达融合蛋白的细胞
、
编码融合蛋白的核酸
、
载体或病毒颗粒接触，当与未处理的细胞或对照细胞相比时，所述量有效地使
tau
蛋白水平降低至少
10
％，例如至少
15
％
、
至少
20
％
、
至少
30
％
、
至少
40
％
、
至少
50
％
、
至少
60
％
、
至少
70
％
、
至少
75
％
、
至少
80
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
98
％
、
至少
99
％
。
[0186]
vii.
药物组合物如本文中设想的那样，本文中设想的组合物可包含一种或多种包含j结构域和
tau
结合结构域的融合蛋白
、
编码此类融合蛋白的多核苷酸
、
包含其的载体
、
遗传修饰的细胞等
。
组合物包括但不限于药物组合物
。“药物组合物”是指在药学上可接受或生理学可接受的溶液中配制以便单独或与一种或多种其它治疗方式组合施用于细胞或受试者的组合物
。
还应理解的是，如果需要的话，组合物也可与其它药剂组合施用，诸如细胞因子
、
生长因子
、
激素
、
小分子
、
化疗剂
、
前药
、
药物
、
抗体或其它各种药学活性剂
。
实际上对也可包含在组合物中的其它组分没有限制，只要另外的药剂不会不利地影响组合物递送预期治疗的能力
。
[0187]
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性
、
刺激
、
过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益
/
风险比相称的那些化合物
、
材料
、
组合物和
/
或剂型
。
[0188]
本文中使用的“药学上可接受的载体”、“稀释剂”或“赋形剂”包括但不限于任何辅助剂
、
载体
、
赋形剂
、
助流剂
、
甜味剂
、
稀释剂
、
防腐剂
、
染料
/
着色剂
、
增味剂
、
表面活性剂
、
润湿剂
、
分散剂
、
悬浮剂
、
稳定剂
、
等渗剂
、
溶剂
、
表面活性剂或乳化剂，其已被美国食品及药品管理局
(united states food and drug administration)
批准为可用于人或家畜
。
示例性的药学上可接受载体包括但不限于糖，诸如乳糖
、
葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马
铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠
、
乙基纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂
、
蜡
、
动物和植物脂肪
、
石蜡
、
有机硅
、
膨润土
、
硅酸
、
氧化锌；油，诸如花生油
、
棉籽油
、
红花油
、
芝麻油
、
橄榄油
、
玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油
、
山梨糖醇
、
甘露醇和聚乙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和用于药物制剂的任何其它相容性物质
。
[0189]
viii.
剂量本文中描述的组合物
(
例如包括融合蛋白构建体
、
核酸或基因治疗病毒颗粒的组合物
)
的剂量可以根据许多因素而变化，诸如化合物的药效学性质；施用方式；接受者的年龄
、
健康和体重；症状的性质和程度；治疗的频率，以及同期联合治疗
(
如果有的话
)
的类型；和化合物在待治疗的受试者中的清除率
。
本文中描述的组合物初始可以以合适的剂量施用，所述剂量可以根据临床反应按需进行调整
。
在一些方面，组合物的剂量是预防或治疗有效量
。
[0190]
ix.
试剂盒设想了试剂盒，所述试剂盒包括
(a)
药物组合物，其包括融合蛋白构建体
、
编码此类融合蛋白的核酸
、
或包含此类核酸的病毒颗粒，该药物组合物减少本文中描述的细胞或受试者中的
tau
蛋白聚集，和
(b)
包装插页，其具有进行本文中描述的任何方法的说明书
。
在一些方面，试剂盒包括
(a)
药物组合物，其包括本文中描述的组合物，该药物组合物减少本文中描述的细胞或受试者中的
tau
蛋白聚集，
(b)
另外的治疗剂，和
(c)
包装插页，其具有进行本文中描述的任何方法的说明书
。
实施例
[0191]
为了测试j结构域是否可以特异性工程化以促进聚集蛋白的正确折叠，我们设计并测试了许多设计为靶向
tau
蛋白的融合蛋白构建体
。
[0192]
实施例1：融合蛋白设计
a.
方法通用技术和材料除非另行指示，本发明的实践采用免疫学
、
生物化学
、
化学
、
分子生物学
、
微生物学
、
细胞生物学
、
基因组学和重组
dna
的常规技术，这些技术是本领域普通技术人员已知的
。
参见
sambrook,j.
等人
,“molecular cloning:alaboratory manual,”第3版
,cold spring harbor laboratory press,2001
；“current protocols in molecular biology”,f.m.ausubel
等人编辑
,1987
；“methods in enzymology,”系列
academic press,san diego,calif.
；“pcr 2:a practical approach”,m.j.macpherson,b.d.hames
和
g.r.taylor
编辑
,oxford university press,1995
；“antibodies,a laboratory manual”harlow,e.
和
lane,d.
编辑
,cold spring harbor laboratory,1988
；“goodman&gilman’s the pharmacological basis of therapeutics,”第
11
版
,mcgraw-hill,2005
；和
freshney,r.i.,“culture of animal cells:a manual of basic technique,”第4版
,john wiley&sons,somerset,n j,2000
，其内容通过引用全文并入本文
。hek-293
细胞
(
人胚胎肾细胞
)
购自
american type culture collection(manassas,va)。
抗
flag
抗体购自
thermo fisher scientific。
为了便于纯化
、
检测和
/
或表征，本实施例1中使用的一些融合蛋白构建体除
seq id no:83-101
中提供的序列外还含有在蛋白的c端或n端处的
seq id no:67
的
flag
表位，以及短接头序列
。
[0193]
hek293
细胞中蛋白的表达与检测用
lipofectamine 3000
转染试剂
(thermo fisher scientific)
将编码各种蛋白构建体的表达载体质粒转染到
hek293
细胞中
。
使用免疫印迹测定分析细胞裂解物的表达的蛋白
。
在分析前，将培养基的样品离心以除去碎片
。
在含有
2mm pmsf
和蛋白酶混合物
(complete
蛋白酶抑制剂混合物；
sigma)
的裂解缓冲液
(10mm tris-hcl
，
ph 8.0
，
150mm nacl
，
10mm edta
，2％
sds)
中裂解细胞
。
在短暂超声处理后，使用免疫印迹测定来分析样品的表达的蛋白
。
对于免疫印迹分析，将样品在
sds
样品缓冲液中煮沸，并在聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行
。
随后，将分离的蛋白条带转移至
pvdf
膜
。
[0194]
使用化学发光信号检测表达的蛋白
。
简而言之，将印迹与能够结合特定表位的一抗
(
例如抗
tau
抗体
)
一起温育
。
在冲洗掉未结合的一抗后，使酶连接二抗
(
例如
hrp
连接抗
igg
抗体
)
与结合印迹的一抗分子结合
。
在冲洗后，加入化学发光试剂，并在
x
射线胶片上捕获印迹中的所得化学发光信号
。
使用以下抗体：
·
抗
tau
抗体
(milliporesigma,burlington,ma)
，
·
抗
v5
抗体
(thermo fisher scientific)
，
·
抗
flag
抗体
(thermo fisher scientific)
，
·
抗
ptau(ser396)
抗体
(biolegend,san diego,ca)
，
·
抗
ptau(thr231)(biolegend,san diego,ca)。
[0195]
报告构建体我们首先研究了靶向
tau
的融合蛋白是否改善了
tau
在培养细胞中的聚集
。
为此，我们生成了两种表达野生型
tau(0n4r)
，以及已知引起过度磷酸化和聚集的突变形式
(
含有
p243s
取代
)(
在其n端与
v5
表位融合
)
的构建体
(
参见下表
8)。
培养
hek293
细胞，并用编码野生型
(seq id no:80)
或突变体
(seq id no:81)tau
的质粒转染
。
[0196]
表8：
tau
报告构建体
融合蛋白构建体设计了几种融合蛋白构建体，其包含来自人
dnajb1
的j结构域
(seq id no:5)
，如表6中所提供并概括在下表9中
。
这些实验中的转染构建体在其c端末端含有
flag
表位融合以促进检测
。
这些融合蛋白构建体的对照包括含有在高度保守的
hpd
基序内具有
p33q
突变的j结构域的构建体
。
此外，设计了其它对照构建体，包括仅包含人
dnajb1 j
结构域
(seq id no:5)
而没有任何
tau
结合结构域的构建体
(
构建体
13)(
也具有
flag
表位
)
，含有在任一侧与多聚谷氨酰胺结合肽
qbp1
融合的
dnajb1 j
结构域的融合蛋白构建体
(
构建体
11)
，以及其在j结构域内具有
p33q
突变的相应对照
(
构建体
12)。
[0197]
表
9.
融合蛋白构建体和对照
将这些构建体中的几个与表达野生型或突变体
tau
的构建体一起共转染到
hek293
细胞中
。
通过免疫印迹分析检测构建体
1、
构建体
4、
构建体5和构建体6的表达
(
数据未显示
)。
[0198]
为了确定j结构域是否可用于减少
tau
聚集，通过野生型或突变体
tau
与融合蛋白的共表达进行了初步实验，所述融合蛋白包含来源于
hsp40 j
结构域蛋白
(
来自人
dnajb1)
的j结构域序列，其与
tau
结合肽
tbp(
构建体
1)、scfv(tau)(
构建体
4)、scfv(mw7)(
构建体
5)
和
happ1(
构建体
6)
缀合
。
如图3中所示，如通过抗
v5
抗体所检测的那样，野生型
(
图3，上图，泳道
2-6)
或突变体
(p243s)tau(
泳道
7-11)
在
hek293
细胞中的表达导致
tau
的出现
。
我们进一步测试了融合蛋白构建体中的一种的共表达是否对改变磷酸化
tau
的水平有影响
。
我们因此检查了
tau 2n4r
中在
thr231
或
ser396
处磷酸化的
tau
的量，因为这些位点处的过度磷酸化与
tau
蛋白病相关
(bramblett
等人
,(1993)neuron 10:1089-99
；
alonso
等人
,(2004)jbiol chem 279:34873-81
；
lin
等人
,(2007)j neurochem 103:802-13
；
alonso
等人
,(2010)jbiol chem 285:30851
–
30860)。
当用识别在
ser396
处磷酸化的
tau(2n4r)
的抗体探测时
(
图3，下图
)
，单独的野生型或
p243s tau
的表达
(
分别为泳道2和
7)
检测到在大约
63kda
处的
ptau(ser396)。
相反，共表达构建体
1、4、5
和6的细胞的提取物中可检测的
ptau(ser396)
水平显著降低
(
表达野生型
tau
的细胞分别为泳道
3、4
和5，而表达
p243s tau
的细胞分别为泳道
9、10
和
11)。
[0199]
图4上图显示了在表达野生型
(0n4r)
或突变体
tau
的细胞中，构建体4的共表达导致
ptau(2n4r
中的
thr231)
和
ptau(2n4r
中的
ser396)
的显著降低
。
下图显示了使用抗
flag
抗体检测构建体
4。
[0200]
最后，我们测试了
jb1-scfv(tau)
在减少
ptau(ser396)
方面的特异性
。
我们因此测试了几种构建体在降低可检测的
ptau(ser396)
的量的能力方面的能力，如图5中所示：
·
构建体8，其与构建体4相同，除了j结构域内高度保守的
hpd
基序内的
p33q
突变
(
泳道5和
9)
；
·
仅有
scfv(tau)
的对照
(
不含j结构域序列的构建体4；泳道3和
7)
如图5中所示，野生型
tau(
泳道
2-5)
或突变体
(p243s)tau(
泳道
6-9)
的表达导致可检测的
tau(
上图
)
，以及
ptau(ser396)(
中图
)
的出现
。ptau(ser396)
的水平在共表达构建体
4(
泳道4和
8)
的细胞中显著降低，但在表达构建体
8(
泳道5和
9)
或仅
scfv(tau)(
泳道3和
7)
的细胞中没有显著降低
。
因此，我们推断
ptau(ser396)
的减少由融合蛋白
(
诸如构建体
4)
介导，其需要功能性j结构域活性
。
[0201]
如图6中所示，野生型
tau(
泳道
2-6)
或突变体
(p243s)tau(
泳道
7-11)
的表达导致可检测的
tau(
上图
)
，以及
ptau(ser396)(
下图
)
的出现
。
在共表达构建体
6(
泳道3和
8)、
构建体
1(
泳道4和
9)
和构建体
14(
泳道5和
10)
的细胞中，
ptau(ser396)
的水平显著降低，表明结合序列诸如
tbp2(seq id no:53)
在融合构建体中是有用的
。
[0202]
我们进一步测试了融合蛋白构建体中的一种的共表达是否对改变截短形式的
tau(tau3r
，
seq id no:80)
的水平有影响
。
在
hek293
细胞中与全长
tau
或截短形式的
tau(tau3r)
一起表达具有
tau
结合肽
tbp
的j结构域融合蛋白
(
构建体
1)。
当用识别
tau
的抗体探测时，在
60kda
附近检测到全长
tau
，而在
30kda
附近检测到
tau3r(
图
7)。
构建体1显著降低了
tau3r
的蛋白水平，通过突变j结构域
(
构建体
7)
消除了该效果
。
[0203]
图8显示了在
u87-mg
神经胶质瘤细胞中表达构建体1的效果
。
用慢病毒感染
u87-mg
神经胶质瘤细胞以表达具有或不具有构建体1或构建体7的全长
tau。
在第2天用新鲜培养基替换培养基
。
在感染后第7天从
u87-mg
细胞收集培养基
。
培养基中的乳酸脱氢酶
(ldh)
活性通过
ldh-cytox
tm
测定试剂盒
(biolegend)
来测量
。
数值代表平均值
±
sd。
这些结果证明j结构域融合蛋白不仅能够减少蛋白错误折叠和
/
或聚集，还能够减少与蛋白错误折叠和
/
或聚集相关的细胞毒性
。
[0204]
实施例2：编码融合蛋白构建体的
aav
载体示例性的基因治疗载体由携带编码表6的融合蛋白构建体的密码子优化的
cdna
的
aav rh10
载体构建，所述
cdna
具体为在含有巨细胞病毒
(cmv)
早期增强子元件和鸡
β-肌动蛋白启动子的
cag
启动子控制下的构建体
1、4、5
和6，以及对照构建体
13(
仅
dnajb1 j
结构域
)、gfp(
阴性对照
)。
将编码
jb1-tbp
的
cdna
放置在
kozak
序列的下游和牛生长激素多聚腺苷酸化
(bghpa)
信号的上游
。
整个盒的侧翼是
aav-2
的两个非编码末端反向序列
。
[0205]
使用类似于上述的杆状病毒表达系统
(urabe
等人
,2002,unzu
等人
,2011(
综述在
kotin,2011
中
))
制备重组
aav
载体
。
简而言之，使用三种重组杆状病毒感染
sf9
昆虫细胞，所述三种重组杆状病毒一种编码用于复制和包装的
rep
，一种编码用于
aav rh10
衣壳的
cap-5
，以及一种具有表达盒
。
使用
avb
琼脂糖高速亲和介质
(ge healthcare life sciences,piscataway,nj)
进行纯化
。
使用
qpcr
用转基因的引物-探针组合滴定载体，且滴度表示为每毫升的基因组拷贝数
(gc/
毫升
)。
载体的滴度大约为8×
10
13
至2×
10
14
gc/
毫升
。
[0206]
实施例3：小鼠模型中的功效的测试存在许多阿尔茨海默病的动物模型
(
参见例如
kitazawa
等人
,(2012)curr.pharm.des.,18:1131-1147)。
在本实施例中，使用
tau
蛋白病的人
tau(htau)
小鼠模型
(duff
等人
,(2000)neurobiol dis.7:87-98)。htau
小鼠表达来源于人
pac(h1
单倍型
)
的人
tau
，称为
8c
小鼠，而鼠
tau
通过外显子1的靶向破坏
(duff
等人
,
同上
)
而被敲除
。
在
c57bl/6
背景下饲养小鼠
。
[0207]
进行预防性研究
(preventive study)
，治疗
2.5
至
6.5
月龄的小鼠
。
将含有编码融合蛋白的载体的不同
aav
病毒颗粒和相应的对照施用于转基因动物
。
在一个实施方案中，通过尾静脉注射施用病毒颗粒
。
在另一实施方案中，通过肌内注射施用病毒颗粒
。
在又一实施方案中，通过颅内注射施用颗粒，例如如
stanek
等人
,(2014)hum.gene.ther.25:461-474
中所述
。
将大约
36
只小鼠分成三组混合的雄性和雌性小鼠，向其施用包含编码构建体
4、
载体对照
、
在j结构域的保守
hpd
基序内具有
p33q
突变的构建体8的
cdna
的
aav rh10。
[0208]
施用后，监测疾病进展并与对照注射小鼠进行比较
。
研究的主要终点是与载体对照治疗小鼠相比，构建体治疗的小鼠的脑中不溶性
tau
聚集体的统计学显著减少
。
次要终点是不溶性
tau
聚集体的剂量依赖性减少
、
磷酸化
tau
的减少
、
和可溶性
tau
的减少
。
[0209]
其它方面本说明书中提及的所有出版物
、
专利和专利申请通过引用全文并入本文，其程度如同每个单独的出版物
、
专利或专利申请具体和单独地指示通过引用全文并入本文
。
当发现本技术中的术语在通过引用并入本文的文献中被不同地定义时，本文提供的定义将用作该术语的定义
。
[0210]
虽然已经结合本发明具体方面对本发明进行了描述，要理解的是，本发明能够进
一步修改，并且本技术意在覆盖本发明的任何变化
、
用途或改编，这些变化
、
用途或改编通常遵循本发明的原理，并且包括来自本发明所属领域内已知或常规实践的本公开的此类偏离，并且可以应用于上文所述的基本特征，并且遵循要求保护的范围
。