一种β‑葡萄糖醛酸苷酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试剂盒与流程

本发明涉及需氧菌性阴道炎检测试剂领域，具体涉及一种β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试剂盒。

背景技术：

阴道炎是阴道黏膜及黏膜下结缔组织的炎症，是妇科门诊常见的疾病。正常健康妇女，由于解剖学及生物化学特点，阴道对病原体的侵入有自然防御功能，当阴道的自然防御功能遭到破坏，则病原体易于侵入，导致阴道炎症。常见的阴道炎有细菌性阴道炎(BV/AV)、霉菌性阴道炎(VVC)及滴虫性阴道炎(TV)三大类。其中，女性细菌性阴道感染可分为两种，一种由厌氧菌和兼性厌氧菌引起，临床上称细菌性阴道病(BV)，另一种由需氧菌引起，临床上称需氧菌性阴道炎(AV)。两种细菌性阴道炎的病原体不同，临床症状、治疗方案和结局也不相同，区别这两种细菌性阴道感染，在阴道感染的诊疗中具有重要意义。BV是指一类在生殖学上正常菌群(产H₂O₂乳酸杆菌)减少，代之以加德纳菌、厌氧菌，弯曲弧菌大量繁殖，阴道内生态平衡系统改变引起的一类疾病。AV是由阴道乳酸杆菌减少，需氧菌感染引起的阴道炎症。常见病原体为链球菌、葡萄球菌以及大肠埃希菌。正常阴道是以乳酸杆菌为优势菌的正常微生物群，阴道pH＜4.5。而当患需氧菌性阴道炎时，阴道乳酸杆菌减少，而需氧菌繁殖导致阴道壁黏膜充血、水肿和产生脓性分泌物。临床表现以阴道异常分泌物、性交痛为主。细菌预成酶是细菌在生长繁殖过程中合成的一系列与生长代谢有关的酶类，这些酶类能分解多种生化反应的底物，并且在有氧环境中能较长时间地保留其活性。不同种属的细菌，其预成酶的种类不同。B族链球菌和大肠埃希菌代谢可产生β葡萄糖醛酸苷酶。通过检测β葡萄糖醛酸苷酶来诊断阴道中需氧菌菌群结构是一个有效、可行的方法。但目前用于检测β葡萄糖醛酸苷酶的检测试剂其精确度有所欠缺。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂，该检测试剂通过添加新生牛血清特异增强β-葡萄糖醛酸苷酶活性的稳定性，检测更加准确。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂，包括聚乙烯吡咯烷酮、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷盐和新生牛血清和磷酸盐缓冲液。

作为优选，所述β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂中的成分按重量份计包括：

聚乙烯吡咯烷酮 1～10份；

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷盐 2.5～25份；

其中，新生牛血清占β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂的体积百分比为1～10％；

磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为50～150mmol/L。

作为优选，所述β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂中的成分按重量份计包括：

聚乙烯吡咯烷酮 2份；

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷盐 5份；

其中，新生牛血清占β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂的体积百分比为1％；

磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为100mmol/L。

作为优选，所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮-K90。

作为优选，所述5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷盐为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷钠。

作为优选，使用所述β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂进行检测的样品的稀释液为生理盐水。

本发明的第二个目的是为了提供一种反应垫，该反应垫使用方便快捷，精确性高。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种反应垫，包括载体和如上所述的β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂的成分；所述β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂的成分包被在载体上；所述反应垫用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶。

作为优选，使用所述反应垫进行检测的样品的稀释液为生理盐水。

本发明的第三个目的是为了提供一种反应垫的制备方法，通过该制备方法结合检测试剂的成分获得一种灵敏度高、精确度高的反应垫。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种如上所述的反应垫的制备方法，包括以下步骤：

1)制备浸泡液A：将聚乙烯吡咯烷酮和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷盐溶于磷酸盐缓冲液中，得到浸泡液A；

2)制备浸泡液B：将新生牛血清充分溶于磷酸盐缓冲液中，得到浸泡液B；

3)浸泡液A处理：将载体置于浸泡液A中充分浸泡后取出，然后进行干燥，得到浸泡液A载体；

4)浸泡液B处理：将浸泡液A载体置于浸泡液B中充分浸泡后取出，然后进行干燥，得到反应垫。

作为优选，步骤1)和2)中，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.8～7.5；再优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.8。

作为优选，步骤1)和2)中，所述磷酸盐缓冲液为磷酸钠缓冲液。

作为优选，步骤3)中，所述载体置于浸泡液A中充分浸泡10～20s；步骤4)中，所述载体置于浸泡液B中充分浸泡10～20s。

作为优选，步骤3)中，所述干燥的温度为20～70℃，时间为30～40min；步骤4)中，所述干燥的温度为20～70℃，时间为30～40min。

作为优选，所述载体为滤纸。

本发明的第四个目的是为了提供一种试剂盒，该试剂盒用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种试剂盒，包括如上所述的反应垫；所述试剂盒用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶。

本发明的设计原理如下：

当阴道分泌物中的葡萄糖醛酸苷酶活性异常时，葡萄糖醛酸苷酶水解5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷盐，吲哚基在有氧的条件下呈现蓝色，呈色的深度与β-葡萄糖醛酸苷酶的活性成正比；新生牛血清辅助增强β-葡萄糖醛酸苷酶活性的稳定性，使得检测结果准确。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明的检测试剂通过添加新生牛血清特异增强β-葡萄糖醛酸苷酶活性的稳定性，检测更加准确；

2、本发明的反应垫可使用生理盐水作为检测样品的稀释液，使用条件简单方便，并可结合使用条件相同的其他菌种预成酶的检测反应垫同时对样品进行检测，效率更高；

3、本发明的反应垫制备方法最大限度地将检测试剂的成分包被在反应垫中，获得的反应垫灵敏度高，精确性好。

附图说明

图1为实施例8的显色结果示意图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂，按重量份计包括以下成分：

聚乙烯吡咯烷酮-K90 1～10份；

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷钠 2.5～25份；

其中，新生牛血清占β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂的体积百分比为1～10％；

磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为50～150mmol/L；

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-K90，在25℃下，体积百分数为5％的水溶液(aq)，其粘度为39.5～45.8mPas。

β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂通过以下制备方法制得：

将聚乙烯吡咯烷酮、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷钠和新生牛血清依次溶于pH为6.8～7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)中，得到β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂。

一种反应垫，包括载体和如上所述的β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂的成分；所述β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂的成分包被在载体上；所述反应垫用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶。使用该反应垫进行样品检测时，样品的稀释液为生理盐水。

该反应垫的制备方法包括以下步骤：

1)备料：按以上重量份准备聚乙烯吡咯烷酮-K90、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷盐和新生牛血清；

2)配制磷酸盐缓冲液(PBS)：配制pH为6.8～7.5的磷酸盐缓冲液待用；

所述磷酸盐缓冲液为NaH₂PO₄和Na₂HPO₄的水溶液；

3)制备浸泡液A：将聚乙烯吡咯烷酮和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷钠溶于磷酸盐缓冲液中，得到浸泡液A；

4)制备浸泡液B：将新生牛血清充分溶于磷酸盐缓冲液中，得到浸泡液B；

5)浸泡液A处理：将滤纸置于浸泡液A中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度为20～70℃，时间为30～40min的条件下进行干燥，得到浸泡液A滤纸；

6)浸泡液B处理：将浸泡液A滤纸置于浸泡液B中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度为20～70℃，时间为30～40min的条件下进行干燥，得到反应垫。

更具体地，所述滤纸可以是Whatman玻璃纤维滤纸、GF/A Whatman的纤维滤纸Grade3或普通定量滤纸。

应用反应垫制备试剂盒：将反应垫置于试剂盒的反应孔中，然后将反应孔密封，得到试剂盒；试剂盒置于2～8℃中保存；该试剂盒用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶。

实施例1～3

实施例1～3公开了β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂，按表1分别准备三组原料成分，按表2准备浓度和pH不同的磷酸钠缓冲液；A组用于实施例1，B组用于实施例2，C组用于实施例3。

将聚乙烯吡咯烷酮、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷钠和新生牛血清依次溶于100mL磷酸钠缓冲液中，得到β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂。

表1检测试剂的成分及含量

表2磷酸钠缓冲液的配制参数

对实施例1～3中得到的检测试剂进行检测：分别制备酶活性浓度不同的β-葡萄糖醛酸苷酶标准品溶液，β-葡萄糖醛酸苷酶标准品溶液以生理盐水作为溶剂，检测实施例1～3的灵敏度。

分别取实施例1～3的β-葡萄糖醛酸苷酶检测试剂各1mL，然后分别滴加标准品溶液35uL，在温度为37±2℃的条件下水浴8～10min，然后观察溶液中的颜色变化，溶液显色为淡蓝色、蓝色或蓝紫色表示阳性，无显色表示阴性；结果如表3所示：

表3实施例1～3的检测结果

+表示阳性，-表示阴性。

实施例1～3均可检测β-葡萄糖醛酸苷酶，且当β-葡萄糖醛酸苷酶活性较低时仍然能够检测到β-葡萄糖醛酸苷酶；其中在酶活性浓度为3.75U/mL时，实施例1仍可检测得到少量的β-葡萄糖醛酸苷酶，实施例1检测试剂的灵敏度最高。

实施例4～6

实施例4～6公开了一种反应垫及其制备方法：

1)按表1进行备料，按表2配制磷酸钠缓冲液；A组用于实施例4，B组用于实施例5，C组用于实施例6；

2)制备浸泡液A：将聚乙烯吡咯烷酮和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷钠溶于100mL磷酸钠缓冲液中，得到浸泡液A；

3)制备浸泡液B：将新生牛血清充分溶于100mL磷酸钠缓冲液中，得到浸泡液B；

4)浸泡液A处理：将滤纸置于浸泡液A中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度为40℃，时间为30～40min的条件下进行干燥，得到浸泡液A滤纸；

5)浸泡液B处理：将浸泡液A滤纸置于浸泡液B中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度为40℃，时间为30～40min的条件下进行干燥，得到反应垫。

对实施例4～6中得到的反应垫进行检测：分别制备酶活性浓度不同的β-葡萄糖醛酸苷酶标准品溶液，β-葡萄糖醛酸苷酶标准品溶液以生理盐水作为溶剂，检测实施例4～6的灵敏度；在实施例4～6的反应垫中分别滴加标准品溶液35uL，在温度为37±2℃的条件下水浴8～10min，然后观察反应垫中的颜色变化，反应垫显色为淡蓝色、蓝色或蓝紫色表示阳性，无显色表示阴性；结果如表5所示：

表4实施例4～6的检测结果

+表示阳性，-表示阴性。

实施例4～6的反应垫均可检测β-葡萄糖醛酸苷酶，且当β-葡萄糖醛酸苷酶活性较低时仍然能够检测到β-葡萄糖醛酸苷酶；其中在酶活性浓度为3.75U/mL时，实施例4仍可检测得到少量的β-葡萄糖醛酸苷酶，实施例4的反应垫灵敏度最高。

实施例7

在实施例4中，浸泡液A和浸泡液B均采用与磷酸钠缓冲液摩尔浓度相同的Tris-Hcl缓冲液、无水甲醇或生理盐水替代磷酸钠缓冲液，并采用与实施例4～6相同的β-葡萄糖醛酸苷酶标准品溶液进行检测，检测结果如表6所示：

表5采用不同溶剂替代磷酸钠缓冲液所得到的反应垫的检测结果

结果显示：采用磷酸盐缓冲液的灵敏度最高，在酶活性浓度为3.75U/mL时仍然能够检测得到。

实施例8

本实施例将实施例4得到的反应垫置于不同的保存条件，检测其稳定性，处理后采用与实施例4～6相同的检测方法进行检测，反应垫的显色结果如图1所示，图示中的空白对照为生理盐水，结果如表6所示：

表6不同条件下处理的反应垫灵敏度检测结果

检测结果显示，添加了新生牛血清的反应垫无论在37℃放置或低温条件下处理，均表现出较高的稳定性，且灵敏度仍然比未添加新生牛血清的反应垫高，表明新生牛血清在本发明当中提高了反应垫的稳定性。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。