具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物及其用途的制作方法

相关申请的交叉引用本技术要求基于2021年5月10日提交的韩国专利申请第10-2021-0060009号的优先权，并且相应的韩国专利申请文件中公开的所有内容通过引用并入，作为本说明书的一部分。提供了一种3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶变体；一种具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物；一种包含该微生物的用于生产泛酸和/或泛解酸的组合物；以及一种用于制备泛酸和/或泛解酸的方法，所述方法包括培养所述微生物。

背景技术：

1、泛酸是一种属于维生素b复合物的物质，也称为维生素b5，是商业上重要的物质之一，广泛应用于化妆品、药品、人类营养、动物营养等。泛酸具有其中β-丙氨酸通过酰胺键与泛解酸连接的结构。

2、泛酸或泛解酸可以通过化学合成制备或通过在合适的培养基中发酵合适的微生物以生物技术方式制备。使用微生物的生物技术制备方法的优点是形成了所需的泛酸或泛解酸的立体异构d型。

3、因此，需要开发在以生物技术方式制备泛酸和/或泛解酸中具有有益效果的微生物，以及使用该微生物高效生产泛酸和/或泛解酸的技术。

4、(现有技术)

5、(专利文献)

6、(现有文献1)美国注册专利号：7718205

技术实现思路

1、技术问题

2、本技术的一种实例提供了一种具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽。在一种实施方式中，(1)该多肽可以包含其中在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第159位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的氨基酸序列。在另一种实施方式中，(2)该多肽可以包含其中在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第159位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代，并且从n端开始第116位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的氨基酸序列。如上所述，该氨基酸序列中从n端开始计数氨基酸可以指从起始密码子翻译的甲硫氨酸(met，m)作为第一个氨基酸进行计数。

3、另一种实例，提供了一种编码该多肽的多核苷酸。

4、又一种实例，提供了一种包含该多核苷酸的重组载体。该重组载体可以是表达载体。

5、再一种实例，提供了一种生产泛酸或泛解酸的微生物，该微生物包含选自由该多肽、编码该多肽的多核苷酸和包含该多核苷酸的重组载体所组成的组中的一种或多种(一种、两种或全部)，并且具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性。

6、所述微生物，可以包含：

7、(1)选自由在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第159位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的多肽、编码该多肽的多核苷酸以及包含该多核苷酸的重组载体所组成的组中的一种或多种(一种、两种或全部)；或者

8、(2)上述(1)，以及选自由在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第116位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的多肽、编码该多肽的多核苷酸以及包含该多核苷酸的重组载体所组成的组中的一种或多种(一种、两种或全部)。

9、该微生物可以是棒状杆菌属(corynebacterium)微生物、埃希氏菌属(escherichia)微生物。该棒杆菌属微生物可以是谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)。

10、另一种实例，提供了一种包含该微生物的用于产生泛酸或泛解酸的组合物。

11、另一种实例，提供了一种该微生物在生产泛酸和/或泛解酸中的用途。

12、另一种实例，提供了一种用于制备泛酸或泛解酸的方法，该方法包括在培养基中培养该微生物。该制备方法还可以包括在培养后从培养的微生物、培养基或它们两者中回收泛酸或泛解酸。

13、技术方案

14、在本说明书通过寻找可以提高泛酸和/或泛解酸生产能力的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶或其变体，并将该3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶或其变体引入微生物中，提供一种具有优异的泛酸和/或泛解酸生产能力的重组菌株。

15、在本说明书中，确认了表达3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的微生物具有优异的泛酸生产能力，并且还确认了，当在3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的特定位置处引入氨基酸取代突变时，泛酸的生产能力进一步提高。

16、一种实例提供了具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽。一种实施方式中，该多肽可以包含其中在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第159位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的氨基酸序列。在另一种实施方式中，该多肽可以包含其中在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第159位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代，并且从n端开始第116位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的氨基酸序列。如上所述，从氨基酸序列中的n端开始计数氨基酸可以指从起始密码子开始翻译的甲硫氨酸(met，m)作为第一个氨基酸进行计数。

17、另一种实例，提供了一种编码该多肽的多核苷酸。

18、又一种实例，提供了一种包含该多核苷酸的重组载体。该重组载体可以用作该多肽的表达载体。

19、再一种实例，提供了一种具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物。该微生物可以是生产泛酸或泛解酸的微生物。

20、3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的增强，可以通过对微生物内源3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶进行突变或引入外源3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶或其变体来增强。

21、在一种实施方式中，具有增强活性的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶可以包含其中在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第159位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的氨基酸序列。除此之外，具有增强活性的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶可以包含其中在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第159位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代，并且从n端开始第116位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的氨基酸序列。

22、具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物，可以包含：

23、(1)选自由其中在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第159位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的多肽、编码该多肽的多核苷酸以及包含该多核苷酸的重组载体所组成的组中的一种或多种；或者

24、(2)上述(1)，以及选自由其中在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第116位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的多肽、编码该多肽的多核苷酸以及包含该多核苷酸的重组载体所组成的组中的一种或多种。

25、与3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性未增强(例如，在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第159位残基对应的氨基酸和/或第116位残基对应的氨基酸未被另一种氨基酸取代)的同源微生物相比，具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物可以具有更高的泛酸和/或泛解酸生产能力。

26、另一个实例，提供了一种用于生产泛酸和/或泛解酸的组合物，该组合物包含具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物。

27、另一个实例，提供了一种用于生产泛酸和/或泛解酸的方法，该方法包括培养具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物。

28、在下文中，将更详细地描述本发明。

29、多肽

30、在本说明书中，泛酸(例如，d-泛酸)是具有化学式1结构的化合物，是其中β-丙氨酸通过酰胺键与泛解酸连接的维生素(维生素b5)，并且是辅酶a(coa)和酰基载体蛋白(acp)的组成部分，参与活生物体的各种代谢过程。

31、

32、泛解酸(例如，d-泛解酸)是具有化学式2结构的化合物，并且是多种生物活性化合物的组成部分：

33、

34、在本说明书中，3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶是催化由5,10-亚甲基四氢叶酸(5,10-methylentetrahydrofolate)、3-甲基-2-氧代丁酸(3-methyl-2-oxobutanoate)和水来生物合成四氢叶酸(tetrahydrofolate)和2-脱氢泛解酸(2-dehydropantoate)的过程的酶。

35、在一种实施方式中，3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶可以是其中引入了一个或多个氨基酸残基被取代、缺失或插入的突变的变体。

36、在一种实例中，3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的变体可以是其中在seqid no：37的氨基酸序列中第159位残基对应的氨基酸被一种氨基酸取代的变体，该氨基酸选自由精氨酸(r)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、半胱氨酸(c)、脯氨酸(p)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、蛋氨酸(m)、酪氨酸(y)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)和甘氨酸(g)所组成的组，并且与原来的氨基酸不同。在一种实施方式中，3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶变体可以是其中在seq id no：37的氨基酸序列中第159位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的变体，该另一种氨基酸即精氨酸(r)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、半胱氨酸(c)、脯氨酸(p)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、蛋氨酸(m)或酪氨酸(y)。显然，在变体中，即使对在seq id no：37的氨基酸序列中除第159位残基对应的氨基酸之外的部分氨基酸序列进行缺失、修饰、取代或插入，只要变体表现出3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的活性，它们就可以被包括在本技术的变体中。

37、此外，在一种实例中，该变体可以包含多肽，该多肽中在seq id no：37的氨基酸序列的第159位残基对应的氨基酸在氨基酸序列中与公开为seq id no：37、被另一种氨基酸取代的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同源性或同一性。也就是说，本公开的变体可以包含多肽，该多肽包含在seq id no：37的氨基酸序列的第159位残基对应位置处的取代，与seq id no：37的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高并且小于100％的序列同源性或同一性，并且具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性。

38、在一种实施方式中，3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶变体可以包含选自seq idno：110至seq id no：125的氨基酸序列，但不限于此。显然，即使在由选自seq id no：110至seq id no：125的任一序列组成的变体中除了第159位残基对应的氨基酸以外的一些氨基酸发生缺失、修饰、取代或插入，只要变体表现出3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的活性，它们就可以被包括在本技术的变体中。此外，在一种实例中，该变体可以包含多肽，该多肽与选自seq id no：110至seq id no：125的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同源性或同一性，在seqid no：110至seq id no：125的氨基酸序列中seq id no：37的氨基酸序列的第159位残基对应的氨基酸是固定的。也就是说，本公开的变体可以包含这样的多肽，该多肽包含在seq idno：37的氨基酸序列的第159位残基对应位置处被另一种氨基酸取代，并且与选自seq idno：110至seq id no：125的任一氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高并且小于100％的序列同源性或同一性，并且具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性。

39、在一种实例中，在3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的变体中，

40、(1)在seq id no：37的氨基酸序列中第159位残基对应的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的氨基酸可以被另一种氨基酸取代，该另一种氨基酸选自由精氨酸(r)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、半胱氨酸(c)、脯氨酸(p)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、蛋氨酸(m)和酪氨酸(y)所组成的组，并且与原来的氨基酸不同，以及

41、(2)在seq id no：3的7氨基酸序列中第116位残基对应的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的氨基酸可以被另一种氨基酸取代，该另一种氨基酸选自由天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)、半胱氨酸(c)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)和蛋氨酸(m)所组成的组，并且与原来的氨基酸不同。

42、显然，即使在seq id no：37的氨基酸序列中除第159位残基对应的氨基酸和第116位残基对应的氨基酸之外的一些氨基酸序列缺失、修饰、取代或插入，只要变体表现出3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的活性，它们就可以被包括在本技术的变体中。

43、此外，在一种实例中，变体可以包含多肽，在该多肽中与公开为seq id no：37的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同源性或同一性的氨基酸序列中，(1)seq id no：37的氨基酸序列的第159位残基对应的氨基酸，以及(2)seq id no：37的氨基酸序列的第116位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代。也就是说，本公开的变体中可以包含这样的多肽，该多肽包含(1)在seq idno：37的氨基酸序列的第159位残基对应位置处，以及(2)在seq id no：37的氨基酸序列的第116位残基对应位置处用另一种氨基酸进行的取代，与seq id no：37的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高并且小于100％的序列同源性或同一性，并且具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性。

44、在一种实施方式中，3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶变体可以包含seq id no：128的氨基酸序列，但不限于此。显然，即使在由seq id no：128的氨基酸序列组成的变体中除了(1)第159位残基对应的氨基酸和(2)第116位残基对应的氨基酸之外的一些氨基酸序列缺失、修饰、取代或插入，只要变体表现出3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的活性，它们就可以被包括在本技术的变体中。此外，在一种实例中，该变体可以包含多肽，该多肽与seqid no：128的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同源性或同一性，在seq id no：128的氨基酸序列中(1)seqid no：37的氨基酸序列的第159位残基对应的氨基酸，以及(2)seq id no：37的氨基酸序列的第116位残基对应的氨基酸是固定的。也就是说，本公开的变体可以包含这样的多肽，该多肽包含(1)在seq id no：37的氨基酸序列的第159位残基对应位置处，以及(2)在seq idno：37的氨基酸序列的第116位残基对应位置处用另一种氨基酸进行的取代，并且与seq idno：128的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高并且小于100％的序列同源性或同一性，并且具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性。

45、微生物

46、本说明书提供了：

47、一种生产泛酸和/或泛解酸的微生物，包含：

48、(1)选自由在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第159位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的多肽、编码该多肽的多核苷酸以及包含该多核苷酸的重组载体所组成的组中的一种或多种；或者

49、(2)上述(1)，以及选自由在seq id no：37的氨基酸序列中从n端开始第116位残基对应的氨基酸被另一种氨基酸取代的多肽、编码该多肽的多核苷酸以及包含该多核苷酸的重组载体所组成的组中的一种或多种。

50、在本说明书中，术语“具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物”可以是通过被改造(突变)为表达如上所述的具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽，使不具有泛酸和/或泛解酸生产能力的微生物具有泛酸和/或泛解酸生产能力，或者使该微生物具有比其原始的泛酸和/或泛解酸生产能力更高的泛酸和/或泛解酸生产能力。在本说明书中，“微生物”包括单细胞细菌，并且可以与“细胞”互换。在本说明书中，在突变为表达具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽之前的微生物可以表述为“亲本微生物(或亲本菌株)或宿主细胞”，以便区别于已突变的微生物。

51、在一种实例中，微生物可以是选自由棒状杆菌属微生物和埃希氏菌属微生物等所组成的组中的一种或多种。棒状杆菌属微生物可以包括谷氨酸棒状杆菌、产氨棒状杆菌(corynebacterium ammoniagenes)、乳糖发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、热产氨棒状杆菌(corynebacteriumthermoaminogenes)、高效棒状杆菌(corynebacterium efficiens)等，但不一定限于此。更具体地，棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌。埃希氏菌属的菌株可以是大肠杆菌(escherichia coli)。

52、在本说明书中，在具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物中，可以导入编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的基因。

53、在本公开中，术语“具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物”可以是表达具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的微生物，其中引入了突变(工程化)以使得亲本菌株表达具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽。该微生物可以包含选自由具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽、编码该多肽的多核苷酸和包含该多核苷酸的重组载体所组成的组中的一种或多种。在一种实例中，用于表达具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的突变可以通过将编码具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的如上所述多核苷酸或包含该多核苷酸的重组载体引入亲本菌株中来进行。如上所述引入亲本菌株的编码具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的多核苷酸，可以替换亲本菌株中编码3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶的内源基因，或者另外进一步包含。

54、在一种实施方式中，表达具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的微生物可以是保藏编号为kccm12973p(命名为谷氨酸棒状杆菌cv03-5002)的微生物。

55、在本说明书中，多核苷酸(可以与“基因”互换使用)或多肽(可以与“蛋白质”互换使用)“包含特定核酸序列或氨基酸序列，或由特定核酸组成序列或氨基酸序列组成，或表达特定的核酸序列或氨基酸序列”，可以指该多核苷酸或多肽必然包含特定的核酸序列或氨基酸序列，并且可以解释为包含“基本上等同的序列”，其中，在保持多核苷酸或多肽的原始功能和/或所需功能的范围内将突变(缺失、替换、修饰和/或添加)添加到特定的核酸序列或氨基酸序列中。

56、在一种实例中，本说明书中提供的核酸序列或氨基酸序列可以包含在保持其原始功能或所需功能的范围内，通过常规诱变方法修饰的那些，例如，直接进化和/或定点诱变等。在一种实例中，多核苷酸或多肽“包含特定核酸序列或氨基酸序列，或由特定核酸序列或氨基酸序列组成”，可以指必然包含(i)该特定核酸序列或氨基酸序列，或(ii)在保持原始功能和/或所需功能的范围内，由与特定核酸序列或氨基酸序列具有60％或更高、70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高的同源性的氨基酸序列组成，或必然包含该氨基酸序列。在本说明书中，该所需功能可以指增加或赋予微生物的泛酸和/或泛解酸生产能力的功能。

57、在本说明书中公开的核酸序列中，考虑到微生物中的优选密码子由于密码子的简并性而表达蛋白质(赖氨酸分泌蛋白)，在不改变氨基酸序列和/或由编码区表达的蛋白质功能的范围内，可以对编码区进行各种修饰。

58、在本说明书中，术语“同源性(同一性)”是指给定的核酸序列或氨基酸序列的相关程度并且可以表示为百分比(％)。对于核酸序列的同一性，其可以使用例如文献(参见：karlin and altschul,pro.natl.acad.sci.usa,90,5873,1993)的算法blast或pearson(参见：methods enzymol.,183,63,1990)的fasta来确定。基于算法blast，开发了名为blastn或blastx的程序(参见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

59、在一种实例中，包含本说明书中提供的特定核酸序列的多核苷酸可以被解释为包含：含有特定核酸序列或与该特定核酸序列基本等同的核酸序列的多核苷酸片段，以及含有与该特定核酸序列互补的核酸序列。具体而言，如果需要，具有互补性的多核苷酸可以在本领域技术人员可以适当控制的tm值下进行杂交，如果必要，例如在55℃、60℃、63℃或65℃的tm下杂交，并且可以在以下条件下进行分析：此条件在已知文献中被详细公开。例如，可以列出以下条件：具有60％或更高、70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、98％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高的高互补性的基因进行杂交，并且具有低于此的互补性的基因不进行杂交的条件，或通常的southern杂交洗涤条件，其为在对应于60℃、1×ssc(盐水-柠檬酸钠缓冲液)和0.1％(w/v)sds(十二烷基硫酸钠)；60℃、0.1×ssc和0.1％ sds；或68℃、0.1×ssc和0.1％ sds的盐浓度和温度下，洗涤1次、具体地2次或3次的条件等，但不限于此。杂交要求两个多核苷酸具有互补的序列，或者根据杂交的严格性，可以允许碱基之间的错配。术语“互补”可用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于dna，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。用于杂交多核苷酸的适当严格性取决于该多核苷酸长度和互补程度，这是本领域众所周知的(参见sambrook等人，supra,9.50-9.51,11.7-11.8)。

60、多核苷酸或载体的引入可以通过本领域技术人员选择已知的转化方法来进行。在本说明书中，术语“转化”是将特定的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体引入宿主细胞的过程，并且转化的多核苷酸可以位于插入宿主细胞中的染色体中或位于染色体外。作为一种实例，转化可以通过引入编码靶蛋白(外源蛋白)的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体，使由该多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达。另外，多核苷酸可以包含编码靶蛋白的dna和/或rna。只要多核苷酸可以引入并表达到宿主细胞中，引入的形式不受限制。例如，该多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，该表达盒是包含自主表达所必需的所有元件的基因构建体。表达盒可以包含通常可操作地连接至多核苷酸的表达调控元件，例如启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和/或翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，可以将多核苷酸以其自身的形式引入宿主细胞并在宿主细胞中可操作地连接至表达所需的序列。如上文所述，术语“可操作地连接”可以指表达调控元件(例如，启动子)和多核苷酸功能性地连接，使得表达调控元件可以对编码靶蛋白(外源蛋白)的多核苷酸进行转录调控(例如，转录起始)。可操作地连接可以使用本领域已知的基因重组技术进行，例如，可以通过常见的位点特异性dna切割和连接来进行，但不限于此。

61、将多核苷酸转化到宿主细胞中的方法可以通过任何将核酸引入细胞(微生物)的方法来进行，并且可以根据宿主细胞适当地选择本领域已知的转化技术来进行。作为已知的转化方法，电穿孔法、磷酸钙(capo4)沉淀法、氯化钙(cacl2)沉淀法、显微注射法、聚乙二醇(peg)沉淀法(聚乙二醇介导的摄取)、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法、脂质转染法、醋酸锂-dmso法等可以作为示例，但不限于此。

62、将多核苷酸引入(插入)到宿主细胞基因组(染色体)中可以通过适当选择本领域技术人员已知的方法来进行，例如，可以使用rna引导的核酸内切酶系统来进行(或crispr系统；例如，选自由以下组成的组中的一种或多种：(a)rna引导的核酸内切酶(例如cas9蛋白等)、编码其的基因、或包含该基因的载体；以及，(b)向导rna(例如单向导rna(sgrna)等)、编码其的dna、或包含含有dna的载体的混合物(例如，rna引导的核酸内切酶蛋白和向导rna的混合物)、复合物(例如，核糖核酸融合蛋白(rnp)、重组载体(例如，包含rna引导的核酸内切酶编码基因和编码向导rna的dna的载体等)等)，但不限于此。

63、在本说明书中，术语“载体”是指含有编码靶蛋白的多核苷酸的核酸序列的dna产物，该核酸序列可操作地连接至合适的调控序列，使得靶蛋白可以在合适的宿主中表达。该调控序列可以包含能够启动转录的启动子、用于调控转录的任何操纵子序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列和/或调控转录和/或翻译终止的序列。载体转化至宿主细胞后，可以独立于宿主细胞的基因组表达，或可以整合到宿主细胞的基因组中。

64、可用于本说明书的载体不受特别限制，只要它能够在宿主细胞中复制即可，并且可以选自所有常用的载体。常用载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒、噬菌体等。例如，作为载体，可以将pwe15、m13、mbl3、mbl4、ixii、ashii、apii、t10、t11、charon4a和charon21a等用作噬菌体载体或粘粒载体，并且可以将pbr基、puc基、pbluescriptii基、pgem基、ptz基、pcl基和pet基载体等用作质粒载体，但不限于此。具体而言，可以举例pdz、pacyc177、pacyc184、pcl、peccg117、puc19、pbr322、pmw118、pcc1bac载体等，但不限于此。

65、本说明书中可用的载体可以是已知的表达载体和/或用于将多核苷酸插入宿主细胞染色体的载体。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入宿主细胞染色体，例如，同源重组或crispr系统，但不限于此。载体还可以包含选择标记物，用于确认其是否插入染色体中。选择标记物是为了选择载体转化了的细胞，即，为了确认多核苷酸是否插入，并且选择标记可以从赋予选择性表型(例如，耐药性、营养缺陷型需要、细胞毒性耐药性和表达表面蛋白)的基因中选择和使用。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标记物的细胞存活或表现出其他表型特征，从而可以选择转化的细胞。

66、另一种实例提供了一种用于生产泛酸或泛解酸的组合物，其包含该微生物。

67、另一种实例提供了一种用于制备泛酸或泛解酸的方法，该方法包括在培养基中培养该微生物。

68、另一种实例提供了一种用于增加微生物的泛酸和/或泛解酸生产能力的方法，或一种用于赋予微生物泛酸生产能力的方法，该方法包括增强微生物的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性。

69、增强微生物的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性可以包括将突变引入该微生物中，以表达具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的。

70、突变的引入可以包括将编码具有3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的重组载体引入(转化)到该微生物中。

71、另一种实例提供了一种用于生产泛酸和/或泛解酸的方法，该方法包括在培养基中培养如上所述的具有增强的3-甲基-2-氧代丁酸羟甲基转移酶活性的微生物。该方法还可以包括，培养后，从培养的微生物、培养基或它们两者中回收泛酸或泛解酸。

72、在该方法中，微生物的培养没有特别限制，但可以通过已知的分批培养方法、连续培养方法、补料分批培养方法等进行。然后，培养条件没有特别限制，但可以使用碱性化合物(例如：氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如：磷酸盐或硫酸盐)调节合适的ph(例如，ph 5～9，具体地，ph 6～8，最具体地，ph 6.8)，并且可以通过将氧气或含氧气体混合物引入到培养物中来维持需氧条件。培养温度可保持在20℃～45℃，或在25℃～40℃，并且培养可以进行约10小时～160小时，但不限于此。通过可以分泌到培养基中或保留在细胞内的培养，生产泛酸和/或泛解酸。

73、可用于培养的培养基可以单独地使用选自由糖和碳水化合物(例如：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如：大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如：棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇类(例如：甘油和乙醇)、有机酸(如：醋酸)等所组成的组中的一种或多种，或者通过混合两种以上作为碳源来使用，但不限于此。作为氮源，可以单独地使用选自由含氮有机化合物(例如：蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、豆粕粉和尿素)、无机化合物(例如：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等所组成的组中的一种或多种，或可以混合并使用两种以上，但不限于此。作为磷源，可以单独地使用选自由磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、其相应的含钠盐等所组成的组中的一种或多种，或可以混合并使用两种以上，但不限于此。此外，培养基可以包含必需的生长促进物质，例如其他金属盐(例如：硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和/或维生素等。

74、泛酸和/或泛解酸的回收可以根据培养方法使用本领域已知的合适方法从培养基、培养液或微生物中收集所需的氨基酸。例如，可以通过选自离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、hplc等中的一种或多种方法进行回收。回收泛酸和/或泛解酸的方法可以另外包括在此之前、同时或之后进行的纯化步骤。

75、有益效果

76、本说明书中，提供了3-甲基-2-酮丁酸羟甲基转移酶变体，并且提供了使用该变体提高微生物的泛酸和/或泛解酸的生产能力的技术。通过将表达3-甲基-2-酮丁酸羟甲基转移酶变体的突变引入微生物中，提供了能够改善泛酸和/或泛解酸的生产率或赋予泛酸和/或泛解酸的生产力的技术。